專利名稱：油脂酵母δ12和δ15雙功能脂肪酸去飽和酶基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個來源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ 12/Δ 15雙功能的脂肪酸去飽和酶基因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(Polyunsaturasedfatty acids，PUFAs)，如二十碳五烯酸(Eicosatetraenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)等是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)膜脂結(jié)構(gòu)的主要成分，對人體特別是嬰幼兒大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是必不可少的，在醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)保健方面具有重要的作用。人體合成EPA和DHA的效率極低，在日常生活中補充足夠的EPA和DHA對維持身體健康極為重要。目前市場上該類脂肪酸主要來源于深海魚油，環(huán)境污染問題及魚類資源的有限性使得人們必需尋找持久的、穩(wěn)定安全的EPA和DHA替代來源。已知某些微生物如真菌和海洋微藻能從頭合成PUFAs且體內(nèi)含量豐富，目前直接從這些微生物發(fā)酵培養(yǎng)制備商業(yè)化的PUFAs只是在極少數(shù)物種中取得成功，高提取成本和低產(chǎn)量是需要克服的主要瓶頸。另一方面，基因工程已經(jīng)能實現(xiàn)在一些植物中合成PUFAs，利用轉(zhuǎn)基因植物尤其是油料作物作為“綠色細胞工廠”生產(chǎn)PUFAs也是今后發(fā)展的一個重要方向。一些微生物擁有合成PUFAs的全套基因，是轉(zhuǎn)基因研究中優(yōu)良基因的主要來源，因此從這些微生物中克隆合成PUFAs所必需的去飽和酶基因和延長酶基因是轉(zhuǎn)基因研究及開發(fā)的基礎(chǔ)。圖1顯示了生物體內(nèi)合成PUFAs的主要過程，其中Δ 15-脂肪酸去飽和酶處于整個代謝途徑的上游，可以將亞油酸(LA，018:2Δ9'12)轉(zhuǎn)化生成α-亞麻酸(ALA, 018:3Δ9'12'15)，在ω -3途徑中ALA是合成EPA和DHA的底物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種油脂酵母Δ12和Δ15雙功能脂肪酸去飽和酶基因及其克隆方法，該基因編碼的蛋白具有Δ 12和Δ 15去飽和酶兩種活性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是油脂酵母Δ 12和Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因，其特征在于它的基因的全長序列如下atgtcagtcgttgactttaccgataccacaagtggctcggctatcaattcttcgaacatt60
tcccagagaggaaatggatctacgatagtcgaaaccaaaaaagggccatcttcaaatttg120
aaggctattgacacgtttggtaacgagttcaaagtaccagattacaccattaagcaaatt180
ttgtcggctatcccaaagcattgttatgaaagatctcttgttagatcgttaggctacgtt240
gctcgtgatataaccatgatgtgtttaattggttacattggacaaaagactatcccaatg300
gttgagatcgcaggcaaggaagggttgagtagtaacatcagaggaggcctCtggtgCgtg360
tattcatacttgttggggttatttggttttggtttatggattttagctcacgaatgtgga420
cacggggcattttctgattatcagaatgttaatgatgttgttggttggattttacactcg480
tatttgatagtcccatatttttcgtggaaattctctcattcaaagcatcacaaggctact540
ggccacttgactaaggatatggttttcattccttacaccaaggaagaatttgtcgaaaag600
agcggcgtatctaaggtgtctgaagtcatggaagattcgccaatctggtcgttgatggtt660
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tcatacctaggtcactcaaagatcgccaagtctcattatgctccagcttctccagttttt780
gacaaggaacactactggtatattatcttgtctgacatcgggattattacaaccataacg840
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ccttggttatgggttaaccactggttagtctttgttactttcttacaacataccgatcca960
accatgcctcattaccgtgataatgaatggactttcgctcgtggtgctgctgctactatc1020
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atgtacagaaacgttaacggtgcaggtcca gttaagccaa tagattaa1308ο
上述油脂環(huán)孝母Δ12和Δ15雙功能脂肪酸去飽和酶基因[橘林油游■酵母
(Lipomyces kononenkoae)雙功能的脂肪酸去飽和酶基因lkfadl5]的克隆方法，其特征在于對已經(jīng)報道的Δ 15-脂肪酸去飽和酶氨基酸序列進行比對，根據(jù)對應(yīng)的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母總DNA為模板，采用降落PCR(Touch-downPCR)的方法擴增出LKFAD15保守區(qū)對應(yīng)的基因編碼序列并克隆到pMD18_T載體并測序；根據(jù)測序所得的DNA序列設(shè)進一步進行橘林油脂酵母基因組步移，利用接頭PCR(Adaptor-PCR)和熱不對稱交錯PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)擴增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的側(cè)翼序列；最后將獲得的側(cè)翼序列與之前得到的基因片段進行拼接，即得到橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) Ikfadl5結(jié)構(gòu)基因的全長序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因的全長序列)。與現(xiàn)有的脂肪酸去飽和酶基因相比，這個基因具有以下特點1)目前僅從原生動物和霉菌中克隆出具有Δ 12/Δ 15-雙功能的脂肪酸去飽和酶基因。本發(fā)明從一種油脂酵母(橘林油脂酵母)中克隆到具有Δ 12/△ 15雙功能的脂肪酸去飽和酶基因，該基因編碼的蛋白具有△ 12和△ 15去飽和酶兩種活性；該脂肪酸去飽和酶也具有較為廣泛的底物特異性，這是從油脂酵母中克隆到具有雙功能的脂肪酸去飽和酶基因的首次報道。橘林油脂酵母亞油酸含量高，通過在橘林油脂酵母中過表達以及在其它宿主中異源表達lkfadl5具有提高LA或ALA含量的潛力。2)在NCBI 中經(jīng)Blast 分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5與其它物種的脂肪酸去飽和酶基因在核苷酸序列上沒有同源性。


圖1是多不飽和脂肪酸(PUFAs)的合成途徑圖。圖2是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的釀酒酵母脂肪酸圖譜。圖3是不同來源的Δ-15脂肪酸去飽和酶進化樹。LKFAD15 from Lipomyceskononenkoae, PipFAD15(ABL63813. l)from Pichia pastoris, LidFAD15 (AAA86690.1)from Limnanthes douglasii, PefFAD15(AAL36934. l)from Perilla frutescens,CyaFAD15(EAZ92081. l)from Cyanothece sp. , LynFAD15 (EAW33450. l)from Lyngbyasp.，SynFAD15(BAA02924. l)from Synechocystis sp.，CadFAD12(XP_002420902. 1)from Candida dubliniensis, CopFAD12(EER27935. l)from Coccidioides posadasii,AsoFAD12 (BAD04850. 1)from Aspergillus oryzae, CrcFAD12 (AAU12575. 1)fromCryptococcus curvatus, CrnFAD12(XP_570226. l)from Cryptococcus neoformans,PhcFAD12(ACJ26016. l)from Phanerochaete chrysosporium, LeeFAD12(BAD51484. 1)from Lentinula edodes, LabFAD12(XP_001876301.1)from Laccaria bicolor,MucFAD12(BAB69056. l)from Mucor circinelloides, MoaFAD12(BAA81754. l)fromMortierella alpinea, Acc bi-functionalFAD12,15(ABK15557. 1)from Acanthamoebacastellanii.圖4是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的全長序列。圖5是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因所編碼的氨基酸序列。
具體實施例方式1.油脂酵母Δ 12和Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因[橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae)雙功能的脂肪酸去飽和酶基因lkfadl5]的克隆方法對已經(jīng)報道的Δ 15-脂肪酸去飽和酶氨基酸序列進行比對，根據(jù)對應(yīng)的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母總DNA為模板，采用降落PCR的方法擴增出LKFAD15保守區(qū)對應(yīng)的基因編碼序列并克隆到pMDIS-T載體并測序；根據(jù)測序所得的DNA序列設(shè)進一步進行橘林油脂酵母基因組步移，利用接頭PCR(Adaptor-PCR)和熱不對稱交錯 PCR(Ther mal Asymmetric Interlaced PCR)擴增出橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的側(cè)翼序列；最后將獲得的側(cè)翼序列與之前得到的基因片段進行拼接，即得到橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5結(jié)構(gòu)基因的全長序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因的全長序列)。橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5 5，和 3，端的側(cè)翼序列5，-GTCATGTCAGTCGTTGACTTTACCGATA-3’ ； 5’ -GGCCATTAATCTATTGGCTTAACTGGACCT-3’。采用TRIzol試劑盒提取橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因?qū)?yīng)的全長cDNA序列。測序表明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)結(jié)構(gòu)基因的序列與其對應(yīng)的全長cDNA序列一致，證明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因不含有內(nèi)含子。橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5基因的全長序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因的全長序列)atgtcagtcg ttgactttac cgataccaca agtggctcgg ctatcaattc ttcgaacatt 60tcccagagag gaaatggatc tacgatagtc gaaaccaaaa aagggccatc ttcaaatttg 120
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橘林油脂酵t母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因所編碼的氨基酸序列如I
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myrnvngagp vkpid435。
2.經(jīng)序列分析，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5基因的全
長1308bp，不含內(nèi)含子，其氨基酸序列與來自白假絲酵母(Candida albicans) SC5314的A12-FAD和畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115的Δ 15-FAD均具有很高的同源性，其相似性分別為76%和73%。3.在NCBI 中經(jīng)Blast 分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5與其它物種的脂肪酸去飽和酶基因在核苷酸序列上沒有同源性。4.橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5 (即油脂酵母 Δ 12 禾口 Δ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因)編碼的蛋白具有△ 12和△ 15去飽和酶兩種活性的雙功能驗證
(1)將橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5克隆到釀酒酵母載體pHBM354，得到釀酒酵母重組表達質(zhì)粒INVkI-LkFAD15，并將重組表達質(zhì)粒INVScI-LkFAD15與空載體pHBM3M以醋酸鋰方法分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母。從尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基(Synthetic Complete Medium lack of Uracil, SC-Ura :0. 67%酵母氮堿，2%葡萄糖，0. 002%亮氨酸，0. 004%色氨酸，0. 002%組氨酸，1.5%瓊脂，均為質(zhì)量百分數(shù))，105°C滅菌30min(待培養(yǎng)基的溫度在60°C左右時加入氨基酸，氨基酸的百分含量相當于單位為g/mL，即IOOmL尿嘧啶缺陷型液體培養(yǎng)基中，亮氨酸、色氨酸和組氨酸的加入量分別為0. 002g、0. 004g、0. 002g)上挑取多個陽性單菌落，接種于5mL SC-Ura的液體培養(yǎng)基(0. 67% YNB,2%葡萄糖，0. 002% Leu, 0. 004% Trp, 0. 002% His)中，、200rpm/min 振蕩過夜培養(yǎng)；按液體培養(yǎng)基質(zhì)量的接種，將過夜培養(yǎng)的菌液接種于50mL SC-Ura的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D_ = 2 4。收集細胞后用無菌水洗滌細胞，用50mL重組釀酒酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基[Buffered Synthetic Complete Medium, BSC-Ura :0. 67%酵母氮堿，2%半乳糖，0. 005%亮氨酸，0.005%色氨酸，0.0025%組氨酸(均為質(zhì)量百分數(shù))，50mM Tris-HCL PH8. 0緩沖液，105°C滅菌30min的液體培養(yǎng)基重懸細胞至0D_ = 0. 4，再將重懸液接種于新的IOOmLBSC-Ura液體培養(yǎng)基中，20°C ,200rpm/min振蕩培養(yǎng)3 4天。收集酵母細胞提取總脂肪酸并甲酯化后上氣相色譜(GC)進行分析。(2)橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 基因在釀酒酵母 INVkI 中表達時，在沒有添加外源底物的條件下，通過GC檢測發(fā)現(xiàn)釀酒酵母重組菌株INV&I-D15中產(chǎn)生了四種新的脂肪酸成分即 α6:2Δ9’12，α6:3Δ9’12’15，C18:2"9'12, 018:3Δ9'12'15(圖 2)，其含量分別占總脂肪酸的6. 23^,1.83^,12. 25^,3.47% (表1，均為質(zhì)量百分數(shù))。根據(jù)橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5去飽和酶在進化樹中的位置，推測橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5可能是一個新的雙功能去飽和酶(圖3)，即該基因編碼的蛋白具有Δ12和△ 15去飽和酶兩種活性。對橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5在釀酒酵母中表達的功能分析進一步證實了這種推測。在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因轉(zhuǎn)化釀酒酵母中，首先由酵母細胞內(nèi)自身合成的C16:l"9作為底物，在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5的Δ 12去飽和酶活性作用下先生成α6:2Δ9’12，然后016:2Δ9'12在橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5的Δ 15去飽和酶活性作用下最后生成α6:3Δ9’12’15，表1數(shù)據(jù)表明與空載體對照相比，轉(zhuǎn)橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的釀酒酵母中α6:1Δ9脂肪酸含量下降了 39.87%。C18系列脂肪酸可能也是在相同過程的作用下合成新的C18系列脂肪酸產(chǎn)物。GC分析的結(jié)果同時表明來源于橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5雙功能去飽和酶對C16:1，C18:1底物都具有較高的特異性。表1橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的釀酒酵母脂肪酸組成(% total fatty acids)
權(quán)利要求
1.油脂酵母Δ12和△ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因，其特征在于它的基因的全長序列如下atgtcagtcgttgactttaccgataccacaagtggctcggctatcaattcttcgaacatt60tcccagagaggaaatggatctacgatagtcgaaaccaaaaaagggccatcttcaaatttg120aaggctattgacacgtttggtaacgagttcaaagtaccagattacaccattaagcaaatt180ttgtcggctatcccaaagcattgttatgaaagatctcttgttagatcgttaggctacgtt240gctcgtgatataaccatgatgtgtttaattggttacattggacaaaagactatcccaatg300gttgagatcgcaggcaaggaagggttgagtagtaacatcagaggaggcctCtggtgCgtg360tattcatacttgttggggttatttggttttggtttatggattttagctcacgaatgtgga420cacggggcattttctgattatcagaatgttaatgatgttgttggttggattttacactcg480tatttgatagtcccatatttttcgtggaaattctctcattcaaagcatcacaaggctact540ggccacttgactaaggatatggttttcattccttacaccaaggaagaatttgtcgaaaag600agcggcgtatctaaggtgtctgaagtcatggaagattcgccaatctggtcgttgatggtt660ttgattttccaacaaattggtggtttacaattgtatttagctactaatgccactggtcaa720tcatacctaggtcactcaaagatcgccaagtctcattatgctccagcttctccagttttt780gacaaggaacactactggtatattatcttgtctgacatcgggattattacaaccataacg840gttgtgtaccaatggtacaagaactttggtttcttcaacatgtttgtcaactggttcatg900ccttggttatgggttaaccactggttagtctttgttactttcttacaacataccgatcca960accatgcctcattaccgtgataatgaatggactttcgctcgtggtgctgctgctactatc1020gaccgtaactttggtttcatcggacaacacattttccatgatatcattgaaactcacgtt1080ttgcaccattacgtttcaagaataccattttacaatgctagagaagccaccgatgccatc1140agaaaggttatgggcgaacattatagatatgaaggtgaatctatgtggtattctttatgg1200aaatgtatgagaatgtgtcaatatgttgatgatgctgacactgacgccaaaggtgtttta1260atgtacagaaacgttaacggtgcaggtccagttaagccaatagattaa1308ο
2.如權(quán)利要求1所述的油脂酵母Δ12和△ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因的克隆方法，其特征在于對已經(jīng)報道的△ 15-脂肪酸去飽和酶氨基酸序列進行比對，根據(jù)對應(yīng)的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母總DNA為模板，采用降落PCRCTouch-down PCR)的方法擴增出LKFAD15保守區(qū)對應(yīng)的基因編碼序列并克隆到pMDlS-Τ載體并測序；根據(jù)測序所得的DNA序列設(shè)進一步進行橘林油脂酵母基因組步移，利用接頭PCR(Adaptor-PCR)和熱不對稱交錯 PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)擴增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的側(cè)翼序列；最后將獲得的側(cè)翼序列與之前得到的基因片段進行拼接，即得到油脂酵母Δ12和△ 15雙功能脂肪酸去飽和酶基因的全長序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個來源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ12/Δ15雙功能的脂肪酸去飽和酶基因及其克隆方法。本發(fā)明分別以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)為材料，通過設(shè)計簡并引物擴增基因核心序列，再采用基因組步移的方法擴增出全長Δ15-脂肪酸去飽和酶基因lkfad15；通過在釀酒酵母INVScI中異源表達lkfad15證明該去飽和酶具有Δ12，15-脂肪酸去飽和酶的雙功能，并且對C16和C18底物都具有較高的底物特異性。
文檔編號C12N15/10GK102373229SQ201110174930
公開日2012年3月14日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者萬霞, 張燕, 張銀波, 梁焯, 江木蘭, 郭兵, 龔陽敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所