專利名稱：利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法。
背景技術(shù)：
基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物體遺傳信息的技術(shù)，常規(guī)基因打靶動物生產(chǎn)的兩大限制因素為第一，動物體細胞基因打靶效率很低，10_6 10_7;第二，生產(chǎn)雙等位基因敲除的動物時間周期長，克隆效率低。伴隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出很多新的技術(shù)和方法來提高基因打靶效率，如采用無啟動子篩選的基因打靶策略，動物中干細胞的分離及誘導(dǎo)等。但是這些改進對于生產(chǎn)基因打靶動物并沒有顯著的推動作用，所以基因打靶動物的生產(chǎn)一直處于緩慢發(fā)展階段。最近幾年，鋅指蛋白核酸酶(ZFNs)的出現(xiàn)極大地提高了基因打靶的效率，其將成為生產(chǎn)基因敲除動物的一個重要的突破口。肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)是轉(zhuǎn)化生長因子β (Transforming Growth Factor-β，TGF-β )超家族成員，是一種作為肌肉生長負調(diào)控因子的分泌型蛋白。在胚胎發(fā)育過程中，myostatin在生肌節(jié)細胞和發(fā)育的骨骼肌中表達，調(diào)控形成肌纖維的最后數(shù)量。 在成年動物體內(nèi)，myostatin主要在骨骼肌中特異表達，并控制肌纖維的生長。myostatin 的基因敲除和自然純合突變在小鼠、牛、狗和人類均表現(xiàn)出骨骼肌的顯著增加。myostatin以一種前體蛋白的形式被合成，經(jīng)歷一系列蛋白水解過程產(chǎn)生具有生物活性的分子，或者稱其為成熟區(qū)域。第一次水解去除了由M個氨基酸組成的信號肽，這個信號肽對于蛋白進入分泌旁路是必需的。接著，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精氨酸-絲氨酸-精氨酸-精氨酸)位點發(fā)生第二次水解，產(chǎn)生一個分子量27，680道爾頓的 N-端片段(被稱作前肽)以及12，400道爾頓大小的C-端片段。根據(jù)對其它TGF-β成員的了解，前肽對于C-端區(qū)域正確折疊成為半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)具有重要的作用。而C-端片斷是具有生物活性的部分。它通過二硫鍵連接形成C-端片段二聚體，并且折疊為半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)，繼而發(fā)揮作用。肌肉生長抑制素基因人工敲除的小鼠(McPherron AC等，1997，nature. 387 83-90)，表現(xiàn)出骨骼肌顯著、廣泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整個身體被層，單個肌肉重量約為野生型小鼠的二倍。所有被檢的骨骼肌都受到了基因突變的影響而發(fā)生了增加，并且雄性和雌性增加與其體型和體重按一定比例。對純合突變小鼠肌肉制備的切片觀察分析則表明這些小鼠既有肌纖維數(shù)量的增多，又有肌纖維的肥大，肌肉量的增加是肌纖維數(shù)量以及肌纖維大小增加的雙重結(jié)果。myostatin的生物學(xué)功能提示我們，對myostatin的敲除可以成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種增加肌肉的有效策略。通過基因打靶技術(shù)，將該基因失活，是研究其功能和和驗證其生產(chǎn)應(yīng)用價值一個理想的手段。鋅指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了 DNA調(diào)控元件特異性的結(jié)合DNA的特性以及內(nèi)切核酸酶的催化活性，N末端的鋅指蛋白能夠特異的結(jié)合DNA序列，通過C末端內(nèi)切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA雙鏈分子產(chǎn)生斷裂(DSB)，緊接著DSB就會啟動細胞內(nèi)自身修復(fù)機制。目前主要的修復(fù)機制有兩種一種是非同源重組的末端連接修復(fù)機制，另一種是同源重組修復(fù)機制。前一種修復(fù)機制是一種易錯修復(fù)常常會產(chǎn)生遺傳信息的改變，而利用同源重組修復(fù)機制來修復(fù)DSB是一種高保真的修復(fù)方式，一般以另一條姐妹染色體為模板進行精確修復(fù)。在哺乳動物細胞內(nèi)，前一種修復(fù)機制占主導(dǎo)作用，借助ZFNs特異性產(chǎn)生DSB， 引發(fā)細胞非同源重組的末端連接修復(fù)，在DSB位點引入小片段刪除，或者插入，造成移碼突變，或者蛋白關(guān)鍵序列的缺失達到基因敲除目的(圖1)。應(yīng)用ZFNs介導(dǎo)基因敲除或者修飾在斑馬魚，擬南芥等模式生物中已經(jīng)成功實現(xiàn)， 并且效率較高 10 50% (Doyon,Y.等，Nat. Biotech. 2008,26 :702-708 ；Lloyd, Α.等，PNAS 2005，102 :2232-2237)。本發(fā)明證實了利用ZFNs在動物體細胞內(nèi)進行基因的刪除或者精細修飾是一種行之有效的方法，能夠成功獲得基因敲除克隆牛。常規(guī)基因打靶克隆牛的生產(chǎn)流程，包括構(gòu)建基因打靶載體，載體轉(zhuǎn)染，細胞藥物篩選，細胞單克隆的鑒定，體細胞核移植，克隆牛的鑒定。如果需要對第二個等位基因也進行敲除，需要經(jīng)歷上述同樣的過程，即需要進行兩次細胞克隆，并且最后得到的克隆牛含有藥物篩選時所必須的抗性基因，最后要得到不含有抗性基因的動物個體還要經(jīng)歷一次體細胞克隆。以牛為例完成上述過程需要的時間為載體構(gòu)建3個月，細胞篩選1個月，體細胞核移植、胚胎發(fā)育1個月，胚胎移植妊娠到小牛出生10個月。這樣，一次克隆至少需要14個月的時間。并且在細胞篩選過程中，有些甚至無法得到陽性單細胞克隆。如果實現(xiàn)無抗性基因的基因敲除牛需要進行三次克隆，則所需時間就至少需要42個月，周期長、風(fēng)險高。而研究證明，利用ZFNs技術(shù)，可以在12個月內(nèi)得到雙等位基因完全敲除并且不含有抗性基因的克隆牛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計ZFNs特異位點表達載體并轉(zhuǎn)入牛的成纖維細胞中，獲得肌肉抑制素基因敲除的細胞，其中，設(shè)計特異的鋅指結(jié)合蛋白酶ZFNs，其作用的 DNA序列為ZFNs-Setl :GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。前述的方法，包括如下步驟1)構(gòu)建MSTN-ZFNIet 1真核表達載體。ZFNs以二聚體(異型)形式發(fā)揮作用(圖 1)，故每一個作用位點需要兩個鋅指蛋白核酸酶表達元件；二聚體(異型)在鋅指蛋白結(jié)合位點的鋅指蛋白不同，即結(jié)合的DNA序列不同，在R)kl酶切結(jié)構(gòu)域有共同的DNA切割域。以 MSTN-ZFN-Set 1為例，MSTN-ZFN-Set Ι-pZFNl和pZFN2兩個鋅指蛋白核酸酶需要同時表達才能一起發(fā)揮敲除MSTN基因的功能，因此在構(gòu)建載體時可分別構(gòu)建MSTN-ZFN-kt 1-pZFNl 和MSTN-ZFN-ktl-pZFN2的真核表達載體，將兩個載體同時轉(zhuǎn)染到細胞中實現(xiàn)兩個鋅指酶同時表達。以下為表達載體的構(gòu)建原理MSTN-ZFN4etl-pZFm和MSTN-ZFN4etl-pZFN2表達載體，堿基序列(編碼區(qū))分別如SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2所示。鋅指蛋白核酸酶編碼部分，由兩部分組成結(jié)合特異染色體序列的鋅指蛋白結(jié)合域；非限制性內(nèi)切核酸酶i^ok I切割域。鋅指蛋白結(jié)合域的設(shè)計和構(gòu)建可參考美國No. 6，453，242和6，534，沈1。本發(fā)明 ZFNs設(shè)計含有5個鋅指蛋白單體，可特異結(jié)合15個堿基對。鋅指蛋白的作用機理可參考 miller 等(1985) EMBO J. 4 1609 ；Rhodes (1993) Scientif ic American Feb. :56_65。非限制性內(nèi)切核酸酶I7OkI切割域，由IIS型I內(nèi)切核酸酶構(gòu)成，其作用方式和機理可參考 Li 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 89 :4375-4279 ；Li 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 90 :2764-2768 ；Kim 等(1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 91 :883-887 ；結(jié)合域和切割域兩部分構(gòu)成融合表達蛋白，通過酶切連接的方法連接到表達載體上。2)將上述表達載體分別轉(zhuǎn)入牛的成纖維細胞中，PCR檢測肌肉抑制素基因發(fā)生敲除的細胞。其中，PCR檢測使用的引物為F 5 ’ -GAATGAGAACAGCGAGCAG-3，禾口 R 5’ -ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3’。本發(fā)明還提供通過上述方法獲得的基因敲除細胞。本發(fā)明還提供利用鋅指核酸酶生產(chǎn)肌肉抑制素基因敲除克隆牛的方法。本發(fā)明還提供一種制備肌肉抑制素基因敲除的?？寺∨咛サ姆椒ǎ湟郧笆龅幕蚯贸毎麨楹艘浦补w細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術(shù)獲得?？寺∨咛?。本發(fā)明進一步提供一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將前述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。本發(fā)明首次利用鋅指核酸酶(ZFNs)成功敲除牛成纖維細胞中的肌肉抑制素基因，由此獲得基因敲除克隆牛，與常規(guī)的通過基因打靶技術(shù)獲得克隆牛相比，利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，在單細胞克隆中的敲除效率在14% 20%之間，而常規(guī)的基因打靶效率僅為10_6 10_7，效率提高了 IO4 105，為生產(chǎn)基因敲除動物提供了極大的便利。另外，利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，可以實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細胞克隆，這在常規(guī)基因打靶過程中是難以實現(xiàn)的，省去了藥物篩選過程，有利于細胞單克隆的形成，避免了細胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細胞核移植和胚胎的發(fā)育質(zhì)量起到了關(guān)鍵作用，同時不含有抗性基因，大大簡化了生物安全評價過程。


圖1為ZNFs介導(dǎo)肌肉抑制素基因基因敲除示意圖。圖2為MSTN-ZFNIetl_pZFm/pZFN2表達載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為ZFNs介導(dǎo)肌肉抑制素基因基因敲除突變類型，其中WT為野生型對照，… 為缺失堿基，括號數(shù)字代表缺失或者插入堿基個數(shù)，上角標為該突變類型重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)。圖4為發(fā)生基因敲除單細胞克隆測序結(jié)果峰圖，其中在作用位點附近出現(xiàn)雙峰 (下劃線部分)表明發(fā)生基因敲除，否則為野生型序列。圖5為基因敲除牛測序結(jié)果。圖6為ZFNsIet 1作用位點在不同物種之間的同源性比較，其中框內(nèi)為ZFNs切割位點。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中ZFNs設(shè)計由Sigma公司完成，引物合成由上海生工完成，序列測定由北京華大完成。Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均來自大連TaKaRa公司，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、 mRNA純化試劑盒均購自Applied Biosystems公司，體細胞克隆所用試劑均購自Sigma公司。酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴增等常規(guī)實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
實施例IZFN表達載體的篩選及敲除效率1、ZFN表達載體構(gòu)建MSTN(NC 007300. 4)基因序列信息從NCBI網(wǎng)站中獲得，ZFNs設(shè)計由Sigma公司完成，設(shè)計ZFNs位點位于第1、3外顯子上。MSTN-ZFNsIet 1作用于第一外顯子上， MSTN-ZFNs-Set 2和MSTN-ZFNsIet 3作用于第三外顯子上。它們作用的DNA序列分別為ZFNs-Setl :GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT ；ZFNs-Set 2 :CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG ；ZFNs-Set 3 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA下劃線部分分別為鋅指蛋白結(jié)合序列，中間部分為R)kl內(nèi)切核酸酶切割位點。 對應(yīng)的三個 ZFNs 表達載體分別為MSTN-ZFN4etl-pZFm/pZFN2，MSTN-ZFN_Set2-pZFNl/ pZFN2 和 MSTN-ZFN4et3-pZFNl/pZFN2。ZFN表達載體構(gòu)建過程以MSTN-ZFNIet 1為例，表達載體骨架為pAVX (Sigma)， 該載體含有PUC Oir啟動該質(zhì)粒在原核細胞中的復(fù)制，具有卡那霉素抗性基因；在多克隆位點上游含有一個廣譜啟動子CMV序列，能使克隆到該多克隆位點基因高效表達。利用體外化學(xué)合成的方法構(gòu)建鋅指蛋白表達元件(ZFP)JnSEQ ID NO :1(第110 642位為化學(xué)合成的鋅指蛋白表達元件)和SEQ ID NO :2(第107 639位為化學(xué)合成的鋅指蛋白表達元件)所示，合成的鋅指蛋白表達元件兩側(cè)含有EcoRI和BamHI酶切位點，可以利用EcoRI 和BamHI酶切位點將鋅指蛋白表達元件(ZFP)克隆到載體pAVX的多克隆位點上。同樣，利用BamHI和B10I酶切位點將R)kl內(nèi)切核酸酶表達元件克隆到該載體上，這樣將鋅指蛋白 DNA結(jié)合域以及R)kl DNA切割域相互結(jié)合，構(gòu)成了一個嵌合的限制性核酸內(nèi)切酶。此外，在鋅指蛋白DNA結(jié)合域的5’端含有核定位信號(NLQ可引導(dǎo)該下游表達蛋白進入核區(qū)，更好的在DNA水平上發(fā)揮作用。MSTN-ZFNIet 1含有兩個表達質(zhì)粒MSTN-ZFNIetΙ-pZFNl和 MSTN-ZFNIetl-pZFN2，其堿基序列(編碼區(qū))分別如SEQ ID NO 1(其中第110到第642 位堿基為鋅指蛋白表達元件)和SEQ ID NO :2(其中第107到第639位堿基為鋅指蛋白表達元件)所示。兩質(zhì)粒在鋅指蛋白表達元件(ZFP)序列上存在差異，在R)kl內(nèi)切核酸酶表達元件中含有同樣序列信息(圖2)。MSTN-ZFNIet 2和MSTN-ZFNIet 3表達質(zhì)粒構(gòu)建過程同 MSTN-ZFNIet 1。2、ZFN 的篩選在牛的成纖維細胞系中檢測三對表達載體是否能在對應(yīng)的細胞基因組DNA序列發(fā)揮切割作用。在 ZFNs 位點兩側(cè)設(shè)計引物，setl-F 5‘-GAATGAGAACAGCGAGCAG-3‘ ；setI-R 5，-ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3’ ；set2/3_F :5’ -TCCTTTCCAGAGAACTGTGGA-3’ ；set2/3-R 5’ -AGGTGCCTTTGTCTGGCTTA’電轉(zhuǎn)(ΑΜΑΧΑ公司)三對ZFNs的mRNA，電轉(zhuǎn)參數(shù)為T-016，轉(zhuǎn)染劑量為4 μ g mRNA 每IO6個細胞，電轉(zhuǎn)M小時后提取總細胞基因組；進行細胞PCR產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物測序。如果ZFNs發(fā)揮切割作用，細胞會啟動自身修復(fù)機制，在切割位點會出現(xiàn)小片段的刪除或者插入，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果峰圖為雜合峰圖，即該ZFNs可用于后續(xù)基因敲除。以CEL-I酶為主要檢測ZFNs是否發(fā)揮作用的依據(jù)，CEL-I檢測需要突變類型占據(jù)一定比例，否則不能檢出，本發(fā)明證實，當敲除效率為6%時(TA克隆統(tǒng)計測序結(jié)果)，CEL-I 檢測結(jié)果為陰性。3、ZFN敲除效率敲除效率的統(tǒng)計采用TA克隆測序的方式計算，電轉(zhuǎn)M小時后提取總細胞基因組； 進行細胞PCR產(chǎn)物回收純化，T載體連接，測序，序列比對分析，突變類型與總有效測序總數(shù) (野生型與突變型克隆的總和)的比值則為敲除效率。在三對ZFNs中，第一對有較高的敲除效率(14% 20% )，測序得到多種敲除基因類型(圖3)。第二對效率較低(0 6% )， 第三對不發(fā)揮作用。實施例2單細胞克隆的獲得以及基因敲除克隆的鑒定1、單細胞克隆的獲得利用AMAXA電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)牛的成纖維細胞，選用優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)T-016，基因轉(zhuǎn)染效率可以達到90%以上。轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)為mRNA，在細胞內(nèi)的半衰期約為8小時，不會存在轉(zhuǎn) DNA時隨機插入細胞基因組的情況，對于動物的遺傳穩(wěn)定性有良好的保證。同時不會有抗性基因的隨機整合，符合生物安全方面的要求。具體操作方法用Applied Biosystems公司試劑盒回收純化體外轉(zhuǎn)錄的mRNA， DEPC水洗脫溶解，使其終濃度在500ng/ μ 1左右。一對ZFNs對應(yīng)的mRNA各2 μ g，總的mRNA 量為4 μ g，轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量為1 X IO6,電轉(zhuǎn)染后將細胞接種于T25細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)M小時后，細胞計數(shù)，按照每500個細胞/IOcm皿密度將細胞接種于IOcm培養(yǎng)皿中，補充含有15% FBS的DMEM培養(yǎng)基10毫升，在含有5% CO2的37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6_7天后，瓶皿表面會形成分散的單細胞克隆，在顯微鏡下挑選細胞分裂相多、細胞輪廓清晰、細胞之間緊密、 光澤度好的單細胞克隆，擴繁到48孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。3-4天后細胞鋪滿整個孔，消化細胞，取出1/10的細胞進行細胞PCR，用于鑒定細胞單克隆是否發(fā)生基因敲除；剩余細胞接種于6孔板，用于后續(xù)陽性克隆的細胞凍存。2、基因敲除單細胞克隆的鑒定單細胞克隆分子的鑒定采用測序技術(shù)，能夠準確判定基因的DNA序列。具體的操作方法單細胞克隆在48孔板鋪滿孔后，消化細胞，取出1/10的細胞進行細胞PCR，PCR產(chǎn)物回收純化，分成兩部分檢測，一部分直接進行PCR產(chǎn)物測序工作。若該克隆發(fā)生了基因敲除，則PCR產(chǎn)物測序峰圖呈現(xiàn)在切割位點后雙峰的結(jié)果，如圖4所示。針對含有特異雙峰結(jié)果的細胞克隆，將另一部分PCR產(chǎn)物進行TA克隆，精確定位基因敲除位點以及詳細的序列 fn息ο常規(guī)ZFNs介導(dǎo)基因敲除的分子檢測為CEL-I檢測，本發(fā)明證實，通過測序方法得到的結(jié)果更加直接，容易操作，并且準確率可以達到100%。實施例3基因敲除單細胞克隆的胚胎及克隆牛的制備1、基因敲除牛的制備具體過程包括(1)荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞培養(yǎng)
取40日齡荷斯坦奶牛胎兒耳組織，經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍等體外培養(yǎng)操作， 建立牛胎兒成纖維細胞系。(2)基因敲除單細胞克隆基因敲除單細胞克隆的獲得同實施例2。(3)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎制備及胚胎移植從屠宰廠收集成年牛的卵巢，取直徑2 8毫米的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細胞-復(fù)合體，將卵丘-卵母細胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液 (M199+10%胎牛血清+0. 01U/ml牛促卵泡激素+0. 01U/ml牛促黃體生成激素+1 μ g/ml雌二醇)的四孔板，在38. 5°C,5% C02培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18 20h后，將成熟的卵母細胞放入含有0. 1 %透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2 :3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細胞作為體細胞核移植受體。將帶有第一極體的卵母細胞移入含M199+10% FBS+7. 5 μ g/ml細胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，然后用內(nèi)徑為20 μ m 的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20% FBS 的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。將血清饑餓2 4d的供體細胞(及上述轉(zhuǎn)有抗體雙鏈基因及標記載體的轉(zhuǎn)基因細胞)用0. 25%胰蛋白酶消化2 ％iin，選擇直徑為10 12 μ m的體細胞用20 μ m直徑玻璃管將其移入去核的卵母細胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液(Brophy B等.2003. Nat Biotechnol21 (2) :157-162.)中平衡3 5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵細胞使供體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2. 5kV/cm，脈沖時間為10μ s， 脈沖次數(shù)為2次，脈沖間隔為Is的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入Μ199+10 % FBS液中。將重構(gòu)胚放入5 μ mol/L離子霉素液中，4min后移至 1. 9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CRlaa+5 % FBS液中，在38. 5°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。將形態(tài)優(yōu)良的第7天的克隆囊胚移入同期受體母牛的子宮角內(nèi)。受體母牛選擇的都是經(jīng)產(chǎn)母牛，在移植后的第60天進行直腸檢測，以確定妊娠率。2、基因敲除牛的分子鑒定基因敲除牛的分子鑒定具體操作過程為取牛耳部組織黃豆粒大小，消化提取耳組織基因組DNA，實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。用上、下游檢測引物F: 5，-GAATGAGAACAGCGAGCAG-3，和 R :5，-ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3，擴增 MSTN 基因目的序列。純化回收PCR產(chǎn)物，進行TA克隆并對菌落單克隆測序分析。結(jié)果表明，出生的4頭牛犢均為雙等位基因敲除的克隆牛，MSTN基因敲除類型與細胞水平的鑒定結(jié)果一致。實施例4ZFNs敲除細胞off-targeting效應(yīng)檢測ZFNs敲除細胞off-targeting效應(yīng)，是指在ZFNs除了特異性很強的結(jié)合靶序列同時，也會作用于其他的相似序列，這樣就會產(chǎn)生不想要的敲除類型，同時也可能影響個體的生長發(fā)育，對于試驗結(jié)果可信度造成較大負面影響。靶位點選擇過程當中已經(jīng)排除大量off-targeting位點，在表1中，以set 1為例，除了在牛的全基因組內(nèi)含有1個特異的靶位點之外，其相似序列相對較少，只有在含有9個堿基不同時才會出現(xiàn)，這樣ZFNs的 off-targeting效應(yīng)在一定程度上被減小。表IZFNs作用位點以及相應(yīng)的off-targeting位點
權(quán)利要求
1.一種利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計ZFNs特異位點表達載體并轉(zhuǎn)入牛的成纖維細胞中，獲得肌肉抑制素基因敲除的細胞，其特征在于，設(shè)計特異的鋅指結(jié)合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列為ZFNs-Setl :GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟1)構(gòu)建MSTN-ZFNIet1-pZFm和MSTN-ZFNIetl_pZFN2表達載體，它們的堿基序列分別如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示；2)將上述表達載體分別轉(zhuǎn)入牛的成纖維細胞中，通過PCR產(chǎn)物測序檢測肌肉抑制素基因發(fā)生敲除的細胞。
3.通過權(quán)利要求1或2所述的方法獲得的基因敲除細胞。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法在生產(chǎn)基因敲除克隆牛中的應(yīng)用。
5.一種制備肌肉抑制素基因敲除的牛克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求3所述的基因敲除細胞為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術(shù)獲得?？寺∨咛?。
6.一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，其是將權(quán)利要求5所述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入牛子宮內(nèi)進行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因牛。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用鋅指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因(Myostatin)的方法，其是根據(jù)牛肌肉抑制素基因序列，設(shè)計ZFNs特異位點表達載體并轉(zhuǎn)入牛的成纖維細胞中，獲得肌肉抑制素基因敲除的細胞。利用ZFNs介導(dǎo)的基因敲除，可以實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)染，得到雙等位基因敲除的細胞克隆，這在常規(guī)基因打靶過程中是難以實現(xiàn)的，省去了藥物篩選過程，有利于細胞單克隆的形成，避免了細胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細胞核移植和胚胎的發(fā)育質(zhì)量起到了關(guān)鍵作用，同時不含有抗性基因，大大簡化了生物安全評價過程。
文檔編號C12N15/877GK102260711SQ201110174000
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者丁方榮, 于勝利, 李寧, 李松, 湯波, 羅俊杰 申請人:北京濟福霖生物技術(shù)有限公司