專利名稱：口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
扁平苔蘚(lichen planus, LP)是一種伴有慢性淺表性炎癥的皮膚黏膜角化異常性疾病，其病因復(fù)雜，至今尚不明確，并且病程長，有一定的癌變率(0.4 5%)，對患者造成很大的困擾。口腔扁平苔蘚(OLP)的典型病理表現(xiàn)為上皮過度不全角化、基底層液化變性以及固有層有密集的淋巴細胞呈帶狀浸潤。在口腔扁平苔蘚的病因?qū)W的研究中，念珠菌與扁平苔蘚的關(guān)系很早就得到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但至今尚不能給念珠菌是共生菌還是始動致病菌下結(jié)論。對口腔扁平苔蘚的念珠菌進行明確的研究，從而有效地預(yù)防和治療口腔粘膜病，首先需要準確的菌種鑒定分類的方法，特別是菌株間關(guān)系的分析判斷。傳統(tǒng)的表型分型雖具有一定的研究價值，但存在鑒別能力弱、重復(fù)性差、不穩(wěn)定等局限性。隨著現(xiàn)代生物分子技術(shù)的快速發(fā)展，從基因水平對念珠菌進行分型已成為可能和必然。基因分型的目的在于追蹤口腔扁平苔蘚中念珠菌的感染是來自患者自身、還是外源性的感染；明確是否存在特定菌株與扁平苔蘚之間的相關(guān)性；了解念珠菌的感染除了與宿主全身及局部易感因素有關(guān)外，其本身的遺傳型是否與感染有關(guān)，是否存在易感菌株或易感基因，從而探求口腔扁平苔蘚的發(fā)病和進展機理。隨機引物擴增多態(tài)性 DNA 分析(random amplified polymorphicDNA, RAPD)是由 Willams和Welsh提出的一種新的揭示基因組多態(tài)性的方法，它應(yīng)用隨機合成的寡核苷酸鏈作為引物對基因組進行隨機擴增，從而產(chǎn)生基因圖譜，利用計算機進行輔助分析RAPD條帶，反映各菌株間基因親緣關(guān)系的遠近，從而將白念分成若干基因型。ITS 指核糖體 DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacerregion, ITS)。念珠菌的rDNA是一個串聯(lián)排列的重復(fù)序列，包括18S、5. 8S和26S。 而分隔這些基因亞單位的是ITS，稱為非編碼區(qū)。ITS1-ITS2部分進化較快，具有種間特異性和種內(nèi)保守性，可以將菌株鑒定到種或亞種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是采用PCR ITS1-ITS2和RAPD兩種基因分型方法，探討口腔扁平苔蘚念珠菌的基因同源性，并分析比較其分型結(jié)果，提供了口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列，為臨床靶標用藥提供依據(jù)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列，所述特征序列為下列基因序列之(1)5 ‘ -TGGAAGTAAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGT ATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGG TTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAA-3'；(2) 5 ‘ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTT GCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTA AACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCCA-3‘；(3)5 ‘ -TGGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTA GTAATAATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGCCCACCGCC AAAGCAAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCT ACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCCA-3‘。上述是發(fā)明人采用PCR ITS1-ITS2和RAPD兩種基因分型方法，所獲得的三種新的基因型特征序列，分別為II型、IIIa型和Inb型。本發(fā)明還涉及所述的特征序列在口腔扁平苔蘚白色念珠菌基因分型中的應(yīng)用。若通過基因診斷確定基因型為上述之一，采用特定藥物針對性干預(yù)白念的局部治療，可縮短療程至1周左右(通常一般療程為2 3周)，為臨床診斷提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列，為口腔扁平苔蘚白色念珠菌基因分型提供了依據(jù)，可真正從基因水平來為臨床上制定及時有效的防治措施提供可靠依據(jù)，以及為念珠菌分子流行病學(xué)的深入研究奠定 基礎(chǔ)。


圖1為對照組白色念珠菌RAPD產(chǎn)物電泳基因圖譜；(M = Marker, C = control, 1 7=電泳泳道編號)圖2為非糜爛型組白色念珠菌RAPD產(chǎn)物電泳基因圖譜；(M = marker, C = control，3 11 =電泳泳道編號)圖3為糜爛組白色念珠菌RAPD產(chǎn)物電泳基因圖譜；(M = marker, C = control, 1 2=電泳泳道編號)圖4為UIV Band分析白色念珠菌基因分型樹狀圖；(橫坐標=SAB，縱坐標=各白念菌株RAPD基因分型。1 2 =糜爛組2、8號菌株，SAB = 100%;14、16 19 =非糜爛組 3、4、5、6 和 11 號菌株，SAB = 100% ；15,20,21 =非糜爛組 9、10 和 12 號，SAB = 100% ；6 =對照組1號菌株。)圖5為對照組m和糜爛型OLP組E2、E8PCR ITS1-ITS2區(qū)域電泳圖譜；(M = marker, C = control, Nl =對照組，E2、E8 =糜爛組)圖6為非糜爛組3 7、9 12號PCR ITS1-ITS2區(qū)域電泳圖譜；(M = marker, C =control，3 7、9 12 =非糜爛組)
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此 實施例1 特征序列的獲得
1材料與方法1. 1研究對象病例組白色念珠菌分離株來源于2010. 2. 16 2010. 6. 1就診于浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科及黏膜病?？撇⒋_診為OLP的患者。OLP患者的診斷依據(jù)其典型的臨床表現(xiàn)以及實驗室檢查確診，主要的病損表現(xiàn)為大多左右對稱，由粟粒大小的白色或灰白色丘疹組成的線條構(gòu)成網(wǎng)狀、環(huán)狀、樹枝狀、斑塊狀病損，病變區(qū)域與正常粘膜之間無清晰的界限， 白色線條間及四周可為正常粘膜或有充血、糜爛，甚或潰瘍。健康對照組均無口腔粘膜疾病，無任何口腔粘膜病的臨床癥狀、體征及病史。研究對象的排除條件為①全口義齒配戴者；②長期或近期(3月內(nèi))使用廣譜抗菌藥物者；③近期(3月內(nèi))使用抗真菌藥物者；④長期使用腎上腺皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑者；⑤患有糖尿病、甲狀腺功能低下、免疫缺陷等系統(tǒng)性疾病者。研究對象共分為三組，分別為非糜爛組共36例，其中男13例，女23例，平均年齡為49. 19歲；糜爛組共12例，其中男8例，女4例，平均年齡為54. 83歲；健康對照組，共觀例，其中男16例，女12例，平均年齡為52.21歲。本實驗所有參加對象均簽署知情同意書。1. 2實驗設(shè)備1.2. 1隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9050型，上海，中國)1.2.2API 20C AUX 念珠菌鑒定系統(tǒng)(Biomerieux，F(xiàn)rance)1. 2. 3 冰箱(-4°C，-20"C ) (SIEMENS,中國)1. 2. 4 移液槍(Gilson，F(xiàn)rance)1. 2. 5 紫外分光光度計(Parmacia biotech, USA)1. 2. 6PCR 儀(BIOMETRA，GERMANY)1. 2. 7 紫外成像儀(KAISER，GERMANY)1. 3實驗試劑1. 3. 1真菌基因組DNA提取試劑盒(biof lux，China)1. 3. 2Primer C1 (5，-ACGGTACACT-3，)Primer C2 (5， -GTTCCGCCC-3，)(Sangon, China)(Invitrogen, China)1. 3. 3Primer ITS-I (5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，)Primer ITS-2 :(5， -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3，)(Invitrogen, China)1. 3. 4Primer STAR HS DNA Polymerase(TaKaRa，China)1.3.5100bp DNA ladder Marker(TaKaRa, China)1. 3. 6Taq 酶、dNTP Mixture、10*PCR Buffer, MgCl2 (TaKaRa, China)1. 3. 7PBS液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，中國)1. 3. 8沙保勞氏瓊脂(杭州天和，中國)1. 3. 9Agrarose B, Low EEO瓊脂糖(BBI，生工生物工程(上海)有限公司供應(yīng))1. 3. 10Red-gel (BI0TIUM, USA)1. 3. 11 無菌棉簽(3M, USA)
2實驗步驟2. 1標本采集2. 1. 1健康對照組采用含漱濃縮法采集菌株，即囑健康志愿者用PBS液含漱口腔 Imin，收集含漱液。2. 1. 2非糜爛組和糜爛組采用無菌棉捻拭子法，即用生理鹽水濕潤的無菌棉捻反復(fù)涂擦口腔粘膜扁平苔蘚病變處。2. 2白色念珠菌菌株分離及純化3. 2. 1健康對照組收集的含漱液立即送于實驗室，用4000r/min離心5min，取沉淀 Iml均勻涂布于沙保勞氏瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)M 48h，待菌落出現(xiàn)后.挑取典型菌落形接種于沙保勞氏瓊脂平板。反復(fù)3次，以達到分離純化的目的。3. 2. 2從非糜爛組和糜爛組將收集的棉捻涂布于沙保勞氏瓊脂平板上，37°C培養(yǎng) 24 48h，待菌落出現(xiàn)后.挑取典型菌落形接種于沙保勞氏瓊脂平板，反復(fù)3次，以達到分離純化的目的。2. 3白色念珠菌的鑒定及保存分離株在沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)上生長4 后，菌落形態(tài)呈乳白色奶酪狀圓形；用改良革蘭染色法染色后，光鏡下呈革蘭陽性、細胞體積較大、菌體為圓形或卵圓形職層環(huán)狀結(jié)構(gòu)；在米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基上37°C孵育4 他后可形成芽管；在SDA上45°C孵育48h，仍然生長良好；應(yīng)用API 20C AUX念珠菌鑒定系統(tǒng)(購自法國BioMerieUX S. A.公司)進行鑒定的讀數(shù)均符合BioMerieux提供的數(shù)據(jù)庫中的白色念珠菌讀數(shù)。最后菌株保存于-20°C 冰箱中。2.4 白色念珠菌 DNA 的提取(根據(jù) Biospin Fungus Genomic DNAExtraction Kit 說明)2. 4. IBiospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit 使用前準備向Wash Buffer中加入37. 8ml乙醇(無水)并混合均勻；向E Binding Buffer 中加入^ml乙醇(無水)并混合均勻。2. 4. 2DNA提取操作步驟2. 4. 2. 1保存菌種接種于沙保羅固體培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)4 活化；2. 4. 2. 2取活化的真菌組織，在冰浴中將真菌組織研磨粉碎；2. 4. 2. 3取不多于50mg磨碎的真菌組織，放入1. 5ml微量離心管中；2. 4. 2. 4 加 400ul LE Buffer,并混合均勻；2.4. 2. 5于65°C環(huán)境中溫浴15 30mins (溫浴過程中可間或振蕩離心管2-3次)， 然后移出；2. 4. 2. 6加入130ul DABuffer，混合均勻后于冰浴中放置5mins ；2.4.2.714，000咜離心3111士118;2. 4. 2. 8上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1. 5ml的離心管；2. 4. 2. 9 加 750ul 的 E Binding Buffer,并混合均勻；2. 4. 2. 10將混合液轉(zhuǎn)移至spin column。6，000*g離心lmin，并棄去接液管中液體。由于混合液體積大于750ul，分2次離心過柱；2. 4. 2. 11 向 spin column 中加入 500ul 的 G Binding Buffer。10，000*g 離心30s，并棄去接液管中液體；2. 4. 2. 12 向 spin column 中加入 600ul 的 Wash Buffer。10，000*g 離心 30s,并棄去接液管中液體；2. 4. 2. 13 重復(fù)步驟 12 一次；2. 4. 2. 14 再次將 Spin column 10，000*g 離心 lmin,并將 Spin column 轉(zhuǎn)移至一個新的1. 5ml離心管；2. 4. 2. 15 向 Spin column 中加入 IOOul 至 200ul Elution Buffer,并于室溫溫育 Imin ；2. 4. 2. 16 于 12，000*g 離心 lmin,并棄去 Spin column。1. 5ml 離心管中液體含有 DNA，于-20°C冰箱保存。2. 5紫外線分光光度計DNA吸光度測定2. 5. 1用雙蒸水稀釋待測DNA50倍；2. 5. 2以雙蒸水作對照，在波長^Onm處，將紫外分光光度計讀數(shù)調(diào)到零；2. 5. 3將稀釋DNA加入到厚度為Icm的比色杯中，測定DNA在^Onm處的光吸收值；2. 5. 4DNA 濃度(μ g/mL) = (A260nm/0. 02) X 稀釋倍數(shù)。2. 6RAPD 分析2. 6. IPCR 擴增PCR 反應(yīng)體系總體積為 25ul，包括 2. 5ul 10*PCR Buffer、250uMdNTP、1. 5mM MgCl2U. 5U Taq 酶、引物 Cl 和 C2 各 0. 6ul(0. 6uM)、100ng DNA 模板。引物序列為 Cl: (5，-ACGGTACACT-3，) ；C2 (5，-GTTCCGCCC-3，)。在 PCR 擴增儀(HEMA480)中，按以下步驟進行反應(yīng)94°C 5min (預(yù)熱)；94°C 30s ；34°C lmin ；72°C anin。共40個周期，最后一個循環(huán)72°C延伸10min，4°C保存。在每次PCR反應(yīng)中，均設(shè)置陰性對照。2.6.2PCR 產(chǎn)物電泳PCR擴增產(chǎn)物在2 % (w/v)瓊脂糖TAE凝膠中電泳，以IOObp梯度的Marker為DNA 分子量標記。2. 6. 3用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)UIV Band對電泳凝膠攝照并進行分析。該分析系統(tǒng)能以各電泳條帶的位置、分子質(zhì)量作為參數(shù)計算任意2個電泳道的遺傳同源系數(shù) (Similarity coefficient, SAB)。系數(shù)值越大說明兩者親緣性越近，若Sab值彡0. 8。則可認為這兩株菌株具有基因同源性。并限定此值( = 0. 8)作為界限值，將具有基因同源性的菌株分為若干族。2. 6. 4嚴格按照上述實驗條件重復(fù)RAPD分析，檢驗RAPD的重復(fù)性。2. 7PCR ITS1-ITS2區(qū)域DNA堿基序列測定2. 7. IPCR 擴增 ITS1-ITS2 區(qū)域PCR 反應(yīng)體系總體積為 50ul，包括 10*PCR Buffer 5ul,200um dNTP, 25mM MgCl2,高保真 Taq 酶 2U，IOOng DNA 模板，引物 ITSl 和 ITS2 各 2ul，ITSl (5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，)，ITS2 (5，-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3，)。在 PCR擴增儀中，按一下步驟進行反應(yīng)95°C變性30s ；50°C退火30s ；72°C延伸30s，40個循環(huán)，而后 72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物在2% (w/v)瓊脂糖TAE凝膠中電泳，以IOObp梯度的Marker為DNA分子量標記電泳結(jié)果在紫外燈下觀察并照相記錄。2. 7. 2DNA堿基序列測定ITS1-ITS2區(qū)域PCR擴增產(chǎn)物進行純化及DNA堿基序列測定(TaKaRa寶生物工程有限公司，大連)。2. 7. 3BLAST 序列比對將新測定的ITS1-ITS2區(qū)域的DNA堿基序列通過BLAST檢索與Genebank的數(shù)據(jù)庫進行比對，找出與之相似的序列記錄，菌株的鑒定以最高分的菌種決定。2. 7. 4PCR ITS1-ITS2 基因分型使用Vector NTI suite序列分析軟件對12株菌株的ITS1-ITS2區(qū)域堿基序列進行比對，找出菌株間相同及相異的堿基，得出基因分型的結(jié)果。2. 8統(tǒng)計分析采用SPSS. 13對結(jié)果做統(tǒng)計及差異顯著性比較。3 結(jié)果3. 1白色念珠菌的培養(yǎng)陽性率48例各型OLP與28例對照組，經(jīng)過沙式培養(yǎng)基培養(yǎng)及鑒定，口腔扁平苔蘚白色念珠菌感染率明顯高于共生白色念珠菌；非糜爛組培養(yǎng)陽性率最高，與對照組及糜爛組培養(yǎng)陽性率有顯著差異(P <0.05)；糜爛組與對照組念珠菌培養(yǎng)陽性結(jié)果差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。結(jié)果見表1。表1 三組受試者念珠菌培養(yǎng)陽性率
權(quán)利要求
1.口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列，所述特征序列為下列基因序列之(1)5'-TGGAAGTAAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTATTCT TTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGG CCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAAT CTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCAA-3‘；(2)5 ‘ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTA ATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTT ACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCCA-3‘；(3)5 ‘ -TGGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAGTAAT AATCTGGTGTGACAAGTTGATAAAAAATTGGTTGTAAGTTTAGACCTCTGGCGGCAGGCTGGGCCCACCGCCAAAGC AAGTTTGTTTCAAAGAAAAACACATGTGGTGCAATTAAGCAAATCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA AACCTTGTTACGACTTTTACTTCCCA-3‘。
2.如權(quán)利要求1所述的特征序列在口腔扁平苔蘚白色念珠菌基因分型中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列及其應(yīng)用，所述特征序列為SEQ ID No.1～3之一。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了口腔扁平苔蘚白色念珠菌易感基因型特征序列，為口腔扁平苔蘚白色念珠菌基因分型提供了依據(jù)，可真正從基因水平來為臨床上制定及時有效的防治措施提供可靠依據(jù)，以及為念珠菌分子流行病學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102220319SQ201110133188
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者何虹, 楊海萍, 范艷, 董研, 趙丹萍, 黃劍奇 申請人:浙江大學(xué)