專利名稱：構建副豬嗜血桿菌基因組文庫的方法及篩選的免疫蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其涉及副豬嗜血桿菌，具體來說是一種構建副豬嗜血桿菌基因組文庫的方法及篩選的免疫蛋白。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(HPS)主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎，近年來該病原導致斷奶仔豬死亡率逐漸成上升趨勢。副豬嗜血桿菌通常為定植在上呼吸道的一種條件致病菌，但是在一定條件下，會引起格拉氏病，特點為嚴重的漿膜炎，包括胸膜炎，心包炎，腹膜炎等，從而表現為嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病。目前以呼吸道傳播為主的呼吸系統(tǒng)傳染病已經躍居三大系統(tǒng)傳染病之首。世界范圍內的斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥，高致病性蘭耳病等免疫抑制病的出現，使該病更加復雜化，尤其是以多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎及高死亡率為特征的癥候群帶來了巨大經濟損失。鑒于此病的嚴重性，對豬群感染抗體水平的監(jiān)測顯得尤為重要。目前副豬嗜血桿菌ELISA檢測試劑盒，存在不能一次性檢測到所有15個血清型，一般都采用HPS 全菌包板做抗原，由于HPS為苛養(yǎng)菌，生產成本高。雖然HPS基因組全序列目前全部測通， 但基因功能研究相對滯后，這給研制蛋白質抗原設置了障礙。所以本研究建立HPS基因文庫，通過免疫篩選，研制檢測副豬嗜血桿菌的15個血清型的蛋白質抗原。20世紀70年代中期首例cDNA克隆問世以來，cDNA文庫的構建方法有了很大的改進和提高。構建cDNA文庫已成為研究功能基因組學的基本手段之一。目前已廣泛用于研究不同發(fā)育階段基因表達的變化，某特定發(fā)育期基因表達的情況，克隆新型細胞因子，分離新的組織特異基因等。cDNA便于克隆和大量表達，它不像基因組含有內含子而難于表達。因此，可以從cDNA文庫中篩選到所需要的目的基因，并且可直接用于該目的基因的表達。通過構建cDNA表達文庫不僅可保護瀕危珍稀生物資源，而且可以提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。更重要的是可以用于分離全長基因進而展開基因功能研究。本研究正是從庫中通過合適的手段調取基因片段，為研究副豬嗜血桿菌基因功能及獲取目的基因奠定基石出。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種構建副豬嗜血桿菌基因組文庫的方法及篩選的免疫蛋白，通過構建副豬嗜血桿菌基因組文庫，能夠成功的篩選用于檢測副豬嗜血桿菌的15個血清型的蛋白質抗原。本發(fā)明提供了一種副豬嗜血桿菌構建基因組文庫的方法，包括如下步驟1) 一個提取保藏號為CCTCC NO. M2010063的副豬嗜血桿菌細菌基因組DNA的步驟；2) 一個酶切副豬嗜血桿菌細菌基因組的步驟；3) 一個回收酶切后1-61Λ基因組條帶的步驟；4) 一個準備載體質粒的步驟；
5) 一個制備感受態(tài)細胞的步驟；6) 一個將副豬嗜血桿菌細菌基因組酶切片段與載體的連接和轉化步驟；7) 一個PCR鑒定陽性克隆的步驟；8) 一個確定庫容量的步驟。進一步的，在一個將保藏號為CCTCC N0.M2010063的副豬嗜血桿菌細菌基因組 DNA的提取步驟中，提取后的基因組濃度大于200ug/ml。本發(fā)明還提供了一種編碼假定微球菌核酸酶樣蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種編碼假定微球菌核酸酶樣蛋白的基因。本發(fā)明還提供了一種編碼乙?；D移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所
7J\ ο本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種編碼乙?；D移酶的基因。本發(fā)明還提供了一種編碼外膜蛋白P5前驅蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種編碼外膜蛋白P5前驅蛋白的基因。本發(fā)明還提供了一種編碼轉運系統(tǒng)的通透酶的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 4 所示。本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種編碼轉運系統(tǒng)的通透酶的基因。本發(fā)明還提供了一種編碼UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰轉移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種編碼UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰轉移酶的基因。本發(fā)明的副豬嗜血桿菌Shanghai20090303Haemophilus parasuis aianghai20090303(本發(fā)明的代號為SH08-54P)，其保藏號為CCTCC NO. M2010063，該病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)中，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為湖北省武漢市武昌珞珈山(武漢大學)，保藏日期為2010年3月沈號。本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯而易見的。本發(fā)明選擇了 HPS上海流行優(yōu)勢菌株SH08-54P為研究對象，提取細菌基因組，用限制性內切酶Sau3AI對基因組進行部分酶切，回收大小為1-61Λ的片段，將其連接入載體質粒pUC18，最后轉化宿主菌E. coli，對重組質粒進行了酶切鑒定以及對轉化子數目進行了統(tǒng)計，均達到基因表達文庫的要求，結果成功地構建了副豬嗜血桿菌基因表達文庫。將該菌株凍融三次后，制成油乳劑滅活苗，免疫新西蘭兔，制備抗血清，對抗血清進行ELISA檢測，符合篩選文庫的要求。用該免疫血清對該文庫3次反復篩選到5個陽性克隆子，測序分析后獲得基因序列。為研制副豬嗜血桿菌診斷和防治的基因工程試劑奠定基礎。通過本發(fā)明復篩得到陽性克隆子中的插入片段為研制ELISA檢測用的抗原肽提供選擇。將插入片段進行核苷酸序列測定及同源性分析，再連接入表達載體中，表達的蛋白經過提純，就可用于ELISA試劑盒中的包被抗原。復篩得到陽性克隆子插入片段為研制副豬嗜血桿菌疫苗提供選擇。將插入片段段進行核苷酸序列測定及同源性分析，在表達載體中表達，用于實驗動物的攻毒保護試驗中，選取最佳免疫保護肽，為實際生產提供一種新型的基因工程疫苗。


圖 1 是 SH08-54P 基因組 DNA 的 Sau3AI 酶切圖譜，其中 M :DNA Marker DL 15000 ； 1-6 分別為 IX ；5X ；25X ； 125X ；625X ；3125X 的稀釋。圖 2 是 pUC18 載體 BamHI 酶切電泳圖，其中 M :DNA Marker DL 15000 ；1 :5min ；2 IOmin ；3 :20min ；4 :30min ；5 :40min ；6 :pUC18。圖3是pUC18載體CIAP去磷酸化電泳圖，其中M :DNA Marker DL 15000 ； 1 dephosphated pUC18 ；2 :pUC18 digested by BamHI0圖4是重組質粒的PCR鑒定電泳圖，1-24 代表隨機篩選的重組質粒。圖5是IPTG和X-gal藍白斑選擇測定重組效率。圖6是SH08-54P基因組文庫免疫學初次篩選結果。圖7是SH08-54P基因組文庫免疫學第3次篩選結果圖8是陽性克隆子的PCR鑒定結果圖，M =DNA分子量標準；1 5，陽性克隆子PCR產物。圖9是HO1序列及比對信息。圖10是H02序列及比對信息。圖11是H03序列及比對信息。圖12是H04序列及比對信息。圖13是H05序列及比對信息。
具體實施例方式實施例1細菌SH08-54P基因組文庫的建立1. 1細菌基因組DNA提取將凍干保存的SH08-54P接種于制備好的巧克力瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱， 過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于含有V因子的BHI液體培養(yǎng)基的細菌瓶中，放置于37°C恒溫空氣搖床進行液體培養(yǎng)，一段時間后，將液體細菌培養(yǎng)物擴大培養(yǎng)，用于細菌基因組提取 (采用QIAGEN基因組提取試劑盒)，并用分光光度計對基因組濃度進行定量，保證總量大于 lOOug。SH08-54P總DNA經Bio-Rad核酸蛋白測定儀測定其0D260nm/0D280nm比值為 1. 712，表明基因組DNA純度高?；蚪M濃度為207ug/ml，達到構建基因文庫的要求。1. 2細菌基因組DNA的酶切準備選擇Sau3AI，固定DNA量進行酶量的篩選。將限制性內切酶Sau3AI進行系列稀釋(1X，5X，25X，125X，625X，3125X)，并在37°C時對不同反應時間進行比較(5min， IOmin，20min, 30min, 40min)，以找到最佳酶切條件，酶切后1 %瓊脂糖凝膠電泳，切下 1-61Λ的DNA片段，利用試劑盒回收，方法參照說明書進行，-20°C保存?zhèn)溆?。結果顯示，酶切30s且對Sau3AI進行125倍稀釋時，效果較為理想(見圖1)。
1. 3載體質粒pUC18的準備取含質粒pUC18的菌種劃線接種LB瓊脂平板，培養(yǎng)后挑單菌落擴大培養(yǎng)，以質粒小提試劑盒OiIAGEN)提取質粒。將載體PUC18用限制性內切酶BamH I并進行完全酶切消化，用酚仿1次和氯仿1次抽提回收。回收的載體用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)脫磷酸化，去除線性載體的5'末端的磷酸基以防止其自連，隨即用酚仿2次和氯仿1次抽提回收，-20°C 保存?zhèn)溆谩］d體完全酶切過程中，作用IOmin后終止反應時BamHI已經對pUC18充分完成消化過程，PUC18載體被完全消化后變成線性結構，在電泳過程中其相對于未經酶切的環(huán)形 DNA載體來講，空間位阻效應將明顯增大，故其在瓊脂糖凝膠電泳過程中的遷移率會下降而低于未經酶切的PUC18載體，線性片段瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)；為防止載體自連成環(huán)，提高其與外源性片段的連接效率，用CIAP去磷酸化處理并純化回收(見圖3)1. 4 BL21感受態(tài)細胞的制備(1)將凍干保存的BL21菌稀釋溶解后劃線培養(yǎng)過夜，挑取生長良好的單菌落轉入 2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。( 取0. 5ml培養(yǎng)物轉入50ml LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)3_4h，無菌取出4ml培養(yǎng)物冰浴IOmin, 4°C下4000r/min離心5min，棄去上清。(3)往沉淀中加入aiil的4°C預冷的滅菌的0. lmol/L CaCl2輕輕懸浮，置冰浴 30min, 2500rpm 離心 3_5min，棄去上清。(4)沉淀加入200ul預冷0. lmol/L CaC12，并輕輕重懸細胞，置4°C 4_12h，用于轉化。1.5 DNA與載體的連接和轉化將DNA與載體按照5 1的比例在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應，16°C作用12h。無菌操作取200ul感受態(tài)細胞置冰浴，加入IOul連接產物，輕輕吹打充分混勻，冰浴30min，取出置42°C熱休克90s，不要搖動，立刻冰浴l-2min，加入800ul 37°C預熱的LB 液體培養(yǎng)基于37°C 100-150rpm作用45min，以復蘇抗性，稍微離心一下，棄去部分上清，剩 200ul左右全部均勻涂布于帶有Amp抗生素(50ug/ml)、X-Gal及IPTG的LB平板的LB平板，靜置5-lOmin待液體被吸收后，置37°C培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。1. 6陽性克隆質粒的提取和鑒定挑取白色菌落LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，利用試劑盒(天根)提取質粒，使用測序引物M13進行擴增鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢驗是否有插入片段。用不同比例的DNA片段與載體片段進行連接后轉化BL21細胞，通過選擇在不同情況下的陽性克隆子數量，進而確定酶切DNA片段與載體片段之間的最佳連接比例應為 5 1，在此比例下獲取最大連接比率從而可以最大可能地保證所構建基因組文庫的完整性。本步驟采用載體測序引物M13，以獲取的克隆提取的質粒為模板進行PCR檢測，電泳結果顯示，在挑取的M個單克隆中，陽性克隆均有1個或2個外源DNA片段插入，陽性率為 100%，有22個在Ikb以上，比例為92% (見圖4)。1.7庫容量確定在轉化后的菌液中，取IOul于1.5mlA離心管中，加入90ul培養(yǎng)基，混勻后取 IOul，加入到含有90ul培養(yǎng)基的B離心管中，混勻后再去取出IOul加入到含有90ul培養(yǎng)基的C離心管中。分別在A，B，C離心管中取出90ul涂于amp抗性平板，過夜培養(yǎng)后進行平板計數以確定克隆效率。根據連續(xù)稀釋培養(yǎng)的平板上的克隆子數量(見圖幻，取1000倍的平板計數，庫容量為35X IOX IOX 100X 10/9 = 3. 89 X IO5CFU ；基因組的長度約為2200kbp，以平均每個插入片段為1. 5kb計算，Iml菌液覆蓋率為1. 5X3. 89X 105/2200 = 266倍；以平均每個插入片段為4. 01Λ計算，Iml菌液覆蓋率為4. 0X3. 89X 105/2200 = 71倍，表明此庫滿足覆
蓋率的要求。實施例2基因組文庫的免疫學篩選2. 1兔抗SH08-54P血清的制備(1) SH08-54P粗提抗原的制備將凍干保存的SH08-54P菌株接種于制備好的平板，放于37°C恒溫培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于含有V因子的BHI液體培養(yǎng)基的細菌瓶中，放置于37°C恒溫空氣搖床進行液體培養(yǎng)，一段時間后，將液體細菌培養(yǎng)物擴大培養(yǎng)。8000r/min，4°C離心5min，棄上清， 用20mL PBS洗3次，再次8000r/min，4°C離心5min，棄上清，沉淀用PBS重懸，_20°C凍融3 次。測定其濃度，分裝成小份，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)兔抗SH08-54P血清的制備取2 3kg雄性成年新西蘭大白兔4只，臨用前將SH08-54P粗提抗原與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑充分乳化，兩背側皮下分點注射，每2周1次，共免疫3次，第一次加弗氏完全佐劑，第二次加弗氏不完全佐劑，第三次加弗氏不完全佐劑。于每次免疫的第7 IOd耳靜脈采血分離血清，以ELISA實驗檢測SH08-54P特異性抗體。在抗體滴度升高達到要求后，禁食24h，無菌操作頸動脈放血，收集血液。2. 2抗血清的預吸收利用大腸桿菌裂解液對抗血清進行預吸收，以去除大腸桿菌抗體(舒群芳等， 1996)。具體如下(1)從XLl-Blue大腸桿菌工作平板中挑取單個菌落接種入IOmL的LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)過夜。(2)將細菌培養(yǎng)物以1 100的比例再接種入500mL LB/Amp液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至飽和。(3)培養(yǎng)物室溫下4，000r/min離心lOmin，棄上清后，以每IOOmL培養(yǎng)物用3mL
PBS重懸菌體沉淀。(4)菌體沉淀置_20°C反復凍融4 5次，用功率150W，超聲3sec，停kec，每次持續(xù)^iin，共5 8次超聲粉碎。(5)裂解物12，000r/min離心lOmin，收集上清，即為大腸桿菌裂解液。(6) 500 μ L血清加入4. 5mL大腸桿菌裂解液，于4°C搖床搖過夜。(7) 12，OOOr/min離心lOmin，收集上清，立即使用，或保存于_20°C備用。2. 3 SH08-54P基因組文庫的篩選SH08-54P基因組文庫的免疫學篩選方法參考《分子克隆實驗指南》等文獻(J.薩姆布魯克等，1998)，并作適當的修改。具體步驟如下(1)將滅菌硝酸纖維素濾膜放于LB平板上，編號面朝下。然后將濾膜移走，倒轉后重新放好，編號面朝上。( 取少量菌液用滅菌彎頭玻璃棒涂布在濾膜表面，在濾膜邊緣留出2 3mm寬的無菌邊界。室溫下放置平板直至所有液體均被吸收。(3)倒置平極，培養(yǎng)(8 IOh)直至出現極小的菌落(直徑0. Imm)。(4)將一個編號并已滅菌的硝酸纖維素濾膜與另一個含有適當抗生素的瓊脂平板表面接觸而使之變濕，編號面向上，復印濾膜的編號應同主濾膜編號相對應。(5)用滅菌平頭鑷子輕輕把主濾膜自第一平板上移至一疊Whatman3MM濾紙上。有菌落面朝上。(6)小心把第二張已濕的濾膜(編號面向下)放在相應編號的主濾膜上。要注意， 一經接觸就不要移動濾膜。將一張圓形3MM濾紙放于濾膜上。在濾紙上再放空皿，用手壓平皿，使濾膜得到復印。(7)當兩張濾膜夾在一起時，用18號針頭在濾膜上作出一系列有特定記號的定位孔。輕輕剝離濾膜，將復印濾膜放于濕潤用過的平板上，將主濾膜放于含合適抗生素的新鮮平板上，有菌面向上。(8)在化學通風櫥中，用平頭鑷子從平板上取出復印濾膜，放置在濕潤的紙巾上。 濾膜上用一塑料盒蓋好，再把一個裝有氯仿的無蓋玻璃平皿也放進塑料盒中。將濾膜上的細菌菌落在氯仿蒸氣中暴露15min。(9)將濾膜放在裝有裂解液的平皿中。所有濾膜均浸沒后，將平皿放在旋轉平臺上，緩緩搖動裂解緩沖液，室溫下菌落裂解需12 16h。(10)濾膜轉到含TNT的玻璃托盤中，室溫溫育30min，重復3次，用Kimwipes紙去除濾膜表面的菌落殘跡。(11)用平頭鑷子把濾膜逐張轉移至含封閉緩沖液的玻璃盤中，所有濾膜均浸沒后，室溫下在轉動平臺上慢慢搖動溶液30min。(12)用平頭鑷子把濾膜轉移至含稀釋的第一抗體的封閉緩沖液的新鮮玻璃盤中， 室溫下在轉動平臺上緩慢搖動溶液30min。(13)依次將濾膜放到下列每種緩沖液中洗滌lOmin，含0. 1 %牛血清白蛋白的TNT緩沖液含0. 牛血清白蛋白和0. 1% NP-40 (NOIldidet 140)的TNT緩沖液含0. 1 %牛血清白蛋白的TNT緩沖液(14)將濾膜放入含HRP標記的山羊抗兔的二抗溶液中，于室溫下輕輕搖動1. 5 池，洗滌濾膜。(15)將濾膜浸入到DAB顯色液中，室溫溫育15 20min。(16)蒸餾水洗滌兩遍，在抗原一抗體復合物處呈現深紫色判定為陽性克隆。2. 4陽性克隆的鑒定、插入片段核苷酸序列測定及同源性分析(1)對復篩得到陽性克隆子進行酶切鑒定。(2)取0. 5mL的菌液，加入等體積的50%無菌甘油混勻，保存于_20°C。1. OmL菌液送上海英駿生物科技有限公司測序。(3)重組子的核苷酸同源性分析
獲得測序結果后通過互聯網將獲得的序列輸入NCBI GenBank,用BLASTx程序進行核苷酸同源性比較。結果顯示用直徑為90mm的平板以每板約1，000個克隆子的密度進行初篩，篩選了約3. OX 104個重組的克隆子，共獲得15個初篩陽性克隆。將初篩陽性克隆進行了 3次復篩，直至全部反應陽性，共獲得5個持續(xù)陽性反應的克隆子(圖6，圖7)。復篩獲得的5個陽性克隆子，分別編號為H01-H05，快速提取質粒DNA，PCR鑒定，瓊脂糖凝膠觀察估計插入片段大小，結果陽性克隆的插入片段大小分別大約為0. 7kb, 1. Okb, 1. Ikb, 1. 8kb，0. 9kb (圖 8)。將5個陽性克隆子的序列送BLAST服務站進行同源性分析發(fā)現，其中HOl克隆基因序列全長967bp (如SEQ ID NO=I所示)，編碼假定微球菌核酸酶(熱核酸酶)樣蛋白；H02克隆基因序列共960bp (如SEQ ID NO 2所示)，編碼乙酰基轉移酶；H03克隆基因序列長1047bp (如SEQ ID NO 3所示)，編碼外膜蛋白P5前驅蛋白；H04克隆基因序列長 1809bp (如SEQ ID NO 4所示)，編碼ABC型!^3+轉運系統(tǒng)通透酶酶部分；H05克隆基因序列長921bp (如SEQ ID NO 5所示)，編碼UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰轉移酶(MurA酶) (表1)。具體比對信息見(圖9、圖10、圖11、圖12和圖13)。表1陽性克隆序列BLASTx結果
克隆子核苷酸比對序列比對Score編碼蛋白編號長度NCBI 號菌種值蛋白功能HOl722bpZP 02477342.1Haemophilus parasuis 29755455假定微球菌核酸酶 (熱核酸酶)樣蛋白一種熱穩(wěn)定 DNA酶樣物質H02960bpYP 002475058.1Haemophilus parasuis SHO165452乙?；D移酶轉移乙?；鶊FH031047bpZP 02479133.1Haemophilus parasuis 29755635外膜蛋白P5 前驅蛋白重要表面抗原H041809bpYP 002474841.1Haemophilus parasuis SHO165247ABC型Fe3+轉運系統(tǒng)通透酶部分鐵離子轉運和代謝H05921bpZP 02477459.1Haemophilus parasuis 29755207UDP-N-乙酰葡糖- 烯醇丙酮酰轉移酶催化合成N-乙酰胞壁酸
權利要求
1.一種構建副豬嗜血桿菌基因組文庫的方法，其特征在于包括如下步驟1)一個提取保藏號為CCTCC NO. M2010063的副豬嗜血桿菌細菌基因組DNA的步驟；2)一個酶切副豬嗜血桿菌細菌基因組的步驟；3)一個回收酶切后1-61Λ基因組條帶的步驟；4)一個準備載體質粒的步驟；5)一個制備感受態(tài)細胞的步驟；6)一個將副豬嗜血桿菌細菌基因組酶切片段與載體的連接和轉化步驟；7)一個PCR鑒定陽性克隆的步驟；8)—個確定庫容量的步驟。
2.如權利要求1所述的一種副豬嗜血桿菌構建基因組文庫的方法，其特征在于在一個提取保藏號為CCTCC NO. M2010063的副豬嗜血桿菌細菌基因組DNA的步驟中，提取后的基因組濃度大于200ug/ml。
3.一種編碼假定微球菌核酸酶樣蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.一種載體，其特征在于含有權利要求3所述的一種編碼假定微球菌核酸酶樣蛋白的基因。
5.一種編碼乙?；D移酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
6.一種載體，其特征在于含有權利要求5所述的一種編碼乙?；D移酶的基因。
7.一種編碼外膜蛋白P5前驅蛋白的基因；其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 3 所示。
8.一種載體，其特征在于含有權利要求7所述的一種編碼外膜蛋白P5前驅蛋白的基因。
9.一種編碼ABCS !^3+轉運系統(tǒng)的通透酶酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如 SEQ ID NO 4 所示。
10.一種載體，其特征在于含有權利要求9所述的一種編碼ABC型!^3+轉運系統(tǒng)的通透酶酶的基因。
11.一種編碼UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰轉移酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。
12.—種載體，其特征在于含有權利要求11所述的一種編碼UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰轉移酶的基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領域，提供了一種構建副豬嗜血桿菌基因組文庫的方法，包括一個提取保藏號為CCTCCNO.M2010063的副豬嗜血桿菌細菌基因組DNA的步驟，一個酶切副豬嗜血桿菌細菌基因組的步驟；一個將副豬嗜血桿菌細菌基因組酶切片段與載體的連接和轉化步驟；一個PCR鑒定陽性克隆的步驟。利用上述的基因組文庫，采用保藏號為CCTCCNO.M2010063的副豬嗜血桿菌進行篩選，篩選過程中，通過制備抗血清，對抗血清進行ELISA檢測，用該免疫血清對文庫反復篩選到5個陽性克隆子。通過復篩得到的陽性克隆子為研制ELISA檢測用的抗原肽提供選擇，可以一次性檢測副豬嗜血桿菌的15個血清型的蛋白質抗原。
文檔編號C12N15/54GK102251289SQ201110103250
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者萬世平, 劉佩紅, 徐鋒, 楊顯超, 沈莉萍, 王建, 葛菲菲 申請人:上海市動物疫病預防控制中心