專利名稱：一種利用基因工程菌生產(chǎn)l-鳥氨酸鹽酸鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程菌的應(yīng)用，具體涉及一種利用大腸桿菌 TOP 10/PBAD/Thi0-TOPO-Arg-Bsub基因工程菌生產(chǎn)L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。
背景技術(shù)：
一、L-鳥氨酸的生理功能和其醫(yī)療保健價(jià)值L-鳥氨酸是一種非蛋白氨基酸，是生物體合成精氨酸、脯氨酸等蛋白質(zhì)氨基酸的前體物質(zhì)。L-鳥氨酸在生物體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化成腐胺，尸胺，亞精胺，精胺等多胺，多胺有促進(jìn)生物組織生長(zhǎng)的作用。帶正電荷的多胺能和帶負(fù)電的DNA和RNA結(jié)合，促進(jìn)生物體DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的翻譯；多胺能和細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)或磷脂結(jié)合，使膜保持其穩(wěn)定性。L-鳥氨酸能夠有效的刺激腦垂體誘導(dǎo)釋放生長(zhǎng)激素，促進(jìn)脂肪代謝，肌肉生長(zhǎng)和肝細(xì)胞再生，有利皮膚和組織傷口的愈合和修復(fù)。研究顯示，鳥氨酸能夠促進(jìn)胸腺、肝臟和心臟組織的再生、加強(qiáng)肌肉的生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能。臨床應(yīng)用顯示L-鳥氨酸對(duì)外科手術(shù)、燒傷病人、普通感染性疾病和腫瘤癌癥的治療有明顯好處，L-鳥氨酸制劑對(duì)急性病人的恢復(fù)、對(duì)肝臟疾病、肝硬化病人的治療有積極的意義。L-鳥氨酸是生物體尿素循環(huán)代謝環(huán)中的重要成員，鳥氨酸接受二個(gè)NH4+離子和一分子的C02，形成一個(gè)L-精氨酸分子，在生物精氨酸酶的作用下，精氨酸被水解成鳥氨酸和尿素，尿素被排出生物體外起到排除血氨的生理功能。運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充L-鳥氨酸制品，肌肉的運(yùn)動(dòng)質(zhì)量和強(qiáng)度在五周后會(huì)有顯著提高。由于體育鍛煉和劇烈體力活動(dòng)可產(chǎn)生較多的血氨，引起肌體疲勞，而L-鳥氨酸能夠吸收血氨抑制疲勞。L-鳥氨酸的制劑，飲品和保肝護(hù)肝藥品在國(guó)際市場(chǎng)上，具有一定的銷售規(guī)模， L-鳥氨酸作為制備各種鳥氨酸藥品保健品的基本原料，市場(chǎng)前景看好。二、L-鳥氨酸鹽酸鹽的生產(chǎn)方法L-鳥氨酸的生產(chǎn)方法有微生物發(fā)酵法和L-精氨酸弱堿水解法或者L-精氨酸酶法水解法。中國(guó)專利(申請(qǐng)[公開]號(hào)CN101323866A)公開了一種使用改造了的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為33%，發(fā)酵時(shí)間56小時(shí)，產(chǎn)酸率可以達(dá)到5 7%，收率70 80%。中國(guó)專利(申請(qǐng)[公開]號(hào)CN100340M2C)公開了一種使用弱堿法(石灰乳)水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸的方法，水解液中精氨酸的濃度為10%，產(chǎn)品的收率可以達(dá)到 78 82%。中國(guó)專利(申請(qǐng)[公開]號(hào)CN1908177A)公開了一種使用微生物酶法(糞腸球菌精氨酸酶)水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸的方法，培養(yǎng)微生物36小時(shí)后，加入轉(zhuǎn)化底物 L-精氨酸繼續(xù)發(fā)酵水解L-精氨酸48小時(shí)，水解液中L-精氨酸的濃度為12% 15%，每升轉(zhuǎn)化液中L-鳥氨酸的含量可以達(dá)到90 112克，再用樹脂法分離出L-鳥氨酸。我國(guó)是一個(gè)水解法生產(chǎn)L-胱氨酸和L-精氨酸的大國(guó)，L-精氨酸的成本低廉，利用L-精氨酸水解法生產(chǎn)L-鳥氨酸比起發(fā)酵法的生產(chǎn)成本更為經(jīng)濟(jì)。由于化學(xué)水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸的方法常常引起L-鳥氨酸消旋，弱堿水解L-精氨酸的方法制備L-鳥氨酸，雖然能夠減少消旋程度，但需要使用硫酸沉淀弱堿金屬離子，會(huì)遇到過濾困難的問題， 而且會(huì)產(chǎn)生一定的固體廢物。發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸的産酸率不高，常伴隨著產(chǎn)生少量的其他氨基酸，而且需要消耗一定量的糧食，而酶法生產(chǎn)L-鳥氨酸則可以克服化學(xué)水解法以及發(fā)酵法的弊端，且底物濃度高(15% )，不產(chǎn)生雜酸(其他氨基酸)，更利于產(chǎn)物的回收和精制，本專利公布的方法，采用TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub大腸桿菌基因工程菌濕菌體轉(zhuǎn)化L-精氨酸為L(zhǎng)-鳥氨酸，生產(chǎn)的產(chǎn)物不需要離子交換樹脂法分離，可以直接減壓濃縮結(jié)晶分離出合格的L-鳥氨酸鹽酸鹽來，方法較簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期顯著縮短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用大腸桿菌TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌生產(chǎn)L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法。該大腸桿菌工程菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC(武漢大學(xué))，保藏編號(hào) CCTCC No. M2010358o保藏物名稱大腸桿菌T0P10/PBAD/Thio-T0P0-Arg-Bsub，拉丁語名稱；Escherichiacoli, TOP 10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub本發(fā)明中的“T0P10/PBAD/Thio-T0P0-Arg-Bsub”，也可以按照 “TOPlO/pBAD/ Thio-TOPO-arg-Bsub”來表示，其中的大小寫的區(qū)別不會(huì)導(dǎo)致矛盾，它們之間可以互相更換保藏單位地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)保藏日期2010年12月22日。該培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件、檢測(cè)存活性條件培養(yǎng)基含100 μ g/ml Amp LB培養(yǎng)基，pH 7. 0，培養(yǎng)溫度37°C。該培養(yǎng)物由如下方式得到枯草芽孢桿菌中的精氨酸酶基因編碼序列 (argBsub)，與 pBAD/Thio-TOPO 載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E. coli T0P10。保存該培養(yǎng)物最適宜的方法冷凍真空干燥法該大腸桿菌工程菌能夠有效的催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥氨酸。本發(fā)明提供的構(gòu)建高水平表達(dá)產(chǎn)生枯草芽孢桿菌精氨酸酶基因工程菌的技術(shù)方案是構(gòu)建一種重組質(zhì)粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)，該重組質(zhì)粒攜帶枯草芽孢桿菌精氨酸酶基因的編碼序列(arg-Bsub)。用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ε. coli T0P10，通過抗生素篩選得到陽性轉(zhuǎn)化菌株，測(cè)定陽性轉(zhuǎn)化菌株的精氨酸酶活性，篩選出精氨酸酶高表達(dá)菌株，通過DNA序列分析確認(rèn)高表達(dá)菌株含有重組質(zhì)粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)。利用高水平表達(dá)產(chǎn)生枯草芽孢桿菌精氨酸酶的大腸桿菌基因工程菌株催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥氨酸。具體步驟是構(gòu)建所述的重組質(zhì)粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)和轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌T0P10。構(gòu)建重組質(zhì)粒(pBAD/thio-TOPO-argB-sub)的策略方案見圖11.材料與試劑1. 1.遺傳資源感受態(tài)大腸桿菌T0P10菌種(Escherichia coli T0P10)，購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)公司。
線性TA克隆載體pBAD/Thio-TOPO，購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)公司?？莶菅挎邨U菌(Bacillus Subtilis)來自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC(武漢大學(xué))，保藏號(hào) CCTCC No. 93009。1. 2其他材料與試劑提取枯草芽孢桿菌(保藏號(hào)CCTCC No. 93009)細(xì)菌基因組DNA所用得的試劑，DNA molecular weight marker，緩沖液，溶菌酶，RNase，蛋白酶K等，購(gòu)自基因有限公司。其它化學(xué)常規(guī)試劑均為分析純?cè)噭?。TaqDNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液，購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)公司。1. 1.遺傳資源感受態(tài)大腸桿菌T0P10和線性TA克隆載體pBAD/Thio-TOPO，TaqDNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液，購(gòu)自英濰捷基[Irwitrogen]貿(mào)易公司?？莶菅挎邨U菌(Bacillus Subtilis)來自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO.AB93009。登錄GenBank，通過GeneID :937760獲取枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis) 168 菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整編碼序列。1. 2其他材料與試劑提取枯草芽孢桿菌細(xì)菌基因組DNA所用得的試劑，DNA molecular weight marker,緩沖液，溶菌酶，RNase,蛋白酶K等，購(gòu)自基因有限公司。其它化學(xué)常規(guī)試劑均為分析純?cè)噭?.構(gòu)建基因工程菌大腸桿菌T0P10/pBAD/Thio-T0P0-arg-Bsub的具體步驟2. 1.設(shè)計(jì)合成一對(duì)TA克隆引物登錄GenBanK，通過GeneID :937760獲取枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis) 168 菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整編碼序列，據(jù)此，利用I^rimerer 5. 0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增888bp精氨酸酶基因DNA序列，用于pBAD/Thio-TOPO載體TA克隆所需的引物，pi、p2。 (引物由英濰捷基[Irwitrogen](上海)貿(mào)易有限公司合成。)ρ1 5‘ -GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3‘，共 26bp。p2 5' -GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3‘，共 23bp。2. 2.提取枯草芽孢桿菌基因組DNA采用改進(jìn)的I^alval等人的方法提取枯草芽孢桿菌基因組DNA。(I^aiva， I. Molecular coloning of a-amylase gene from Bacillus amylolique faciens and its expression in B. subtilis[J]. Gene,1982,19 :81-87)(1).挑取枯草芽孢桿菌(保藏編號(hào)CCTCC No. AB93009)菌株平板培養(yǎng)的單個(gè)菌落，接種到裝有IOml牛肉膏，蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，32°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。O). 5000rpm離心lOmin，得到菌體沉淀，STE洗滌1次，再次離心，菌體重懸于 4mlTE溶液中。(3) ·加入50mg/ml溶菌酶溶液8μ 1(終濃度為100 μ g/ml)，37°C保溫20min。再加入 RNase (10mg/ml) 10 μ 1，至終濃度 25 μ g/ml，然后加入 10% SDS 溶液 0. 5ml，37°C保溫 30min。加入蛋白酶 K(20mg/ml)10y 1，終濃度為 50 μ g/ml，37°C保溫 60min。(4).再加入等體積的水飽和酚，混勻，8000rpm離心5min，取上清于另一個(gè)離心管中。(5).上清液中加入等體積的酚氯仿(1 1體積)混合液，混勻，SOOOrpm離心 5min,取上清置于另一個(gè)離心管中。(6).加入1/5體積的3M醋酸銨，2倍體積無水乙醇，輕緩反轉(zhuǎn)離心管，使溶液充分混勻，可見DNA形成絲狀析出物。(7). 8000rpm離心5min，沉淀DNA，吸棄所有的上清液。(8).向DNA沉淀中加入Iml的70 %乙醇，顛倒試管使溶液充分接觸試管所有內(nèi)壁，以洗去殘留的鹽。SOOOrpm離心5min，沉淀DNA。吸棄所有的上清液。(9).敞開管口，室溫下使乙醇盡可能揮發(fā)干凈。(10).溶于 0. 5mlTE 溶液中，測(cè)定 0D260 及 0D280，A260/A280 應(yīng)在 1. 8 2. 0。(11). 0. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，DNA帶應(yīng)集中均勻，不含RNA。附牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配制方法牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉5g溶于 IOOOml 純凈水中，pH7. 0。2. 3. PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌精氨酸酶基因PCR反應(yīng)所用試劑，Taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液，dNIPs和無菌純水均來自 Invitrogen公司，PCR引物pi、p2由英濰捷基[Invitrogen](上海)貿(mào)易有限公司合成。以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用pi、p2引物PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌精氨酸酶基因(argBsub)。PCR反應(yīng)在50 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行，參照pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit使用說明書的方法進(jìn)行PCR，TOPO克隆，細(xì)胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化菌株篩選。(1).制備50 μ 1反應(yīng)體系。模板DNA，2y 1 (50ng) ； IOX PCR Buf, 5 μ 1 ；50mMdNTPs, 0. 5 μ 1 ；引物 pi 禾口 p2，各 1 μ 1 (IOOng) ；Taq DNA polymerase (1 單位 / μ 1)，1 μ 1 ；加無菌純水至體積50ul。(2). PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性％iin，94°C變性 lmin，56°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ；共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)完畢后，置于冰中待用。(3).取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ 1上樣1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為0. 9ΚΒ大小的DNA 片斷(已知精氨酸酶基因是888個(gè)堿基對(duì)的DNA片斷)，得到的DNA帶輪廓清楚，適用于直接進(jìn)行Τ0Ρ0-ΤΑ克隆反應(yīng)。2. 4. Τ0Ρ0克隆連接反應(yīng)(重組質(zhì)粒的構(gòu)建)為了獲得精氨酸酶基因表達(dá)的產(chǎn)物的活性和質(zhì)量最大化，表達(dá)產(chǎn)生的酶蛋白需要有正確的折疊和最大的可溶性，我們認(rèn)為N-末端融合有HP-硫氧還蛋白引導(dǎo)肽，較有利于維持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的氧化還原環(huán)境，有利于表達(dá)蛋白質(zhì)的正確折疊和增大其可溶性，有利于增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量。另外，TA克隆技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、重組效率高等優(yōu)點(diǎn)。 因此，我們選用TA克隆載體pBAD/Thio-TOPO構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD/Thio-TOPO-argBsub。所用pBAD/Thio-TOPO載體、鹽溶液和無菌水均來自hvitrogen公司。(1).準(zhǔn)備Τ0Ρ0克隆反應(yīng)體系新鮮的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μ 1，鹽溶液1 μ 1，pBAD/Thio-TOPO載體1 μ 1，無菌純水 3μ 1，總體積6μ 1。在小試管中震動(dòng)混勻，短暫離心，集中反應(yīng)液至試管底部。O).連接反應(yīng)
把反應(yīng)試管置室溫(25°C)水浴進(jìn)行TA連接反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)完成后，把反應(yīng)試管置于冰中待用。2. 5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化用受體大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，系hvitrogen公司提供的化學(xué)誘導(dǎo)的感受態(tài)菌株，商品名為 “one shot T0P10 Chemically Competent Ε. coli。(1).取TOPO克隆連接反應(yīng)液2 μ 1，加進(jìn)一小瓶的(50 μ 1)大腸桿菌Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞中，振搖混勻，瞬間離心集中細(xì)菌至小瓶底部。(2).放到冰中，保持10分鐘。(3). 42°C熱休克細(xì)胞30秒鐘，無需振搖，立刻轉(zhuǎn)移置放在冰中。(4).向轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入250 μ 1室溫(25°C )的LB培養(yǎng)基，擰緊瓶蓋，在37°C搖床上(225rpm)振搖1小時(shí)。(5).取50 μ 1和200 μ 1兩個(gè)體積的轉(zhuǎn)化液鋪含有100 μ g/mlAmp的LB培養(yǎng)基平板兩個(gè)。(6). 37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)平板，得到Amp抗性菌落，從中篩選出酶活性最高的轉(zhuǎn)化菌株，即是大腸桿菌TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株。2.6.陽性克隆的鑒定和篩選分別挑取20個(gè)Amp抗性的轉(zhuǎn)化菌單菌落，接入含有100 μ g/mlAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225rpm培養(yǎng)6小時(shí)，按0. 01 %的終濃度向培養(yǎng)物添加阿拉伯糖后繼續(xù)培養(yǎng) 6小時(shí)，離心得到濕菌體，把0. Ig濕菌體加入5ml pH9. 0的5%精氨酸底物中，添加錳離子使終濃度成為 ο μ mol/L, 37°C溫育60分鐘，薄層層析檢查鳥氨酸的生成量，從中篩選出精氨酸酶產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化菌，即是所構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌株(E.coli TOPlO/pBAD/ Thio-TOPO-argBsub)。其中薄層層析所用的展層劑配比為正丁醇丙酮濃氨水水=10 10 5 22. 7.插入DNA片斷的序列分析(1).把菌株 E.coli Τ0Ρ010/pBAD/Th i o-T0P0-ar gBsub 接入含有 100 μ g/ ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 V，225rpm培養(yǎng)8_10小時(shí)，提取質(zhì)粒，得到pBAD/ Thio-TOPO-argBsub 重組質(zhì)粒 DNA。(2).將提取的 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重組質(zhì)粒 DNA 送英濰捷基 Dnvitrogen] (上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行DNA序列分析。(3).依據(jù)pBAD/TOPCKThioFusion表達(dá)試劑盒產(chǎn)品說明書提供的質(zhì)粒DNA序列分析引物結(jié)合位點(diǎn)的序列信息，由英濰捷基[Irwitrogen](上海)貿(mào)易有限公司，合成 pBAD-正向引物pf，其序列是5’ -ATGCCATAGCATTTTTATCC，合成pBAD-反向引物pr，其序列是 5， -ATCTGTATCAGGCTGAAAATC。(4).利用正向引物 pf，5，-ATGCCATAGCATTTTTATCC 和 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行序列分析，解讀出一段至載體DNA的第245位核苷酸起，至下游1073 個(gè)核苷酸的DNA序列。(5).利用反向引物 pr，5，-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC 和 pBAD/Thio-TOPO-argBsub 重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行序列分析，解讀出一段自載體DNA的第834位核苷酸起，向上游延伸長(zhǎng)1108個(gè)核苷酸的DNA序列。(6).通過拼接后，得到一段DNA片段的序列信息，共計(jì)1484個(gè)堿基對(duì)(見序列表 <223>DNA序列測(cè)定得到的1484個(gè)核苷酸序列<400>3)，內(nèi)含TA克隆的插入序列長(zhǎng)894個(gè)核苷酸(見序列表<223>插入的精氨酸酶基因核苷酸序列表<400>6)，從第4位A起，至891 位的G，計(jì)888個(gè)核苷酸，其核苷酸序列和枯草芽孢桿菌168的精氨酸酶基因編碼序列完全相同(編碼296個(gè)氨基酸)。設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)在該酶的N-末端增加一個(gè)三聯(lián)體密碼GAA， 把天然的終止密碼TAA修改為ACC，故插入序列為894 (888+6)個(gè)堿基對(duì)(編碼298個(gè)氨基酸)。3. DNA序列分析的結(jié)果(1).融合枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白的完整編碼序列是由1350個(gè)核苷酸組成的。自起始密碼AT6開始，是為N-末端有著123個(gè)氨基酸殘基的HP-硫氧還蛋白弓|導(dǎo)肽編碼的核苷酸序列，接著而來的是為298個(gè)氨基酸殘基編碼的插入DNA序列，內(nèi)含組成枯草芽孢桿菌精氨酸酶的296個(gè)氨基酸殘基的核苷酸編碼序列，再至為C-末端的V5-抗原決定部位和多組氨酸標(biāo)簽的觀個(gè)氨基酸殘基編碼核苷酸，共有1347個(gè)核苷酸，給449個(gè)氨基酸殘基編碼，加上一個(gè)終止密碼，該閱讀框共有1350個(gè)核苷酸，其完整的DNA序列見序列表 <223)融合枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白編碼核苷酸序列<400>4。(2).由核苷酸序列推導(dǎo)的融合酶蛋白有449個(gè)氨基酸殘基組成，自N-末端向 C-末端方向排列，見序列表<223>融合枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白的氨基酸殘基序列 <400>6。由核苷酸序列推導(dǎo)的插入DNA片段編碼肽鏈的298個(gè)氨基酸殘基序列，自N-末端向C-末端方向排列，見序列表<223>插入DNA序列編碼的氨基酸殘基序列<400>7。除去首尾兩個(gè)氨基酸殘基以后的296個(gè)氨基酸殘基序列，是天然的枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白的氨基酸殘基序列。和GenBank公布的枯草芽孢桿菌168的精氨酸酶的氨基酸殘基序列完全一致，見序列表<223>枯草芽孢桿菌精氨酸酶氨基酸殘基序列<400>8。4.酶法轉(zhuǎn)化L-精氨酸生成L-鳥氨酸本發(fā)明所述的菌株能夠高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸成為L(zhǎng)-鳥氨酸，工藝過程如下50升發(fā)酵罐培養(yǎng)，阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下，每升培養(yǎng)物可以得到30克濕菌體，900克濕菌體在100L反應(yīng)液中20小時(shí)可以催化15公斤精氨酸定量轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 98%。。工程菌發(fā)酵和酶法轉(zhuǎn)化精氨酸的過程操作方法(1)、將低溫保存的大腸桿菌E. coli TOPlO/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株在含有100μ g/ml Amp的平板上劃線，37°C倒置培養(yǎng)，得到單菌落；(2).將Amp平板上長(zhǎng)出的單菌落接種到含有100 μ g/ml的Amp的3. 5ml LB培養(yǎng)基的試管中，37°C、225r/min，振蕩培養(yǎng)過夜(12 16小時(shí))，得到一級(jí)種液。(3).取培養(yǎng)好的一級(jí)種液9ml接種到裝有100ml 2%的玉米漿培養(yǎng)基的搖瓶中， 37°C、225r/min，振蕩培養(yǎng)8小時(shí)(0D = 3)得到二級(jí)種液。；(4).取培養(yǎng)好的二級(jí)種液1.2L接種到30L 4%的玉米漿培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在37°C，培養(yǎng)過程中補(bǔ)加600ml滅菌甘油，整個(gè)發(fā)酵過程中，用濃氨水調(diào)pH7. 0 8. 0，調(diào)整攪拌速度和空氣流量，使溶氧量不低于20%，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD6tltl = 6.0(12小時(shí)，)，降溫至300C，并加入3g L-Ara進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)8小時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)，收集濕菌體；(5).將發(fā)酵好的菌液在4°C，5000r/min，離心lOmin，棄上清，收集菌體；(6).按菌精氨酸=0.6 10的比例，向100升pH9. O的15%的精氨酸底物溶液中加入濕菌體900克，把溶液中Mn2+濃度調(diào)整為10 μ mol/L，溫度38°C酶解轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化18 小時(shí)后，點(diǎn)薄板檢測(cè)精氨酸酶解情況，精氨酸轉(zhuǎn)化率> 98%時(shí)，進(jìn)入下一工序；其中薄層層析所用的展層劑配比為正丁醇丙酮濃氨水水=10 10 5 2。(7).用6M鹽酸將酶解液pH調(diào)到5.0左右，60°C，保溫30min ；按底物量的15%加入活性炭，60°C，脫色30min后，過濾至清亮；(8).濾液在0. 08Mpa以上的真空下濃縮至底物量的2. 5 3倍體積；(9)再按底物量的8%加活性炭，60°C，脫色30min后，過濾至清亮；(10)繼續(xù)減壓濃縮至底物量的1.5倍的體積，加入一倍體積的95%的乙醇，冷卻
后，第一批L-鳥氨酸鹽酸鹽結(jié)晶析出。用第一次結(jié)晶產(chǎn)物濕重的一半數(shù)量體積的85%的乙醇洗滌結(jié)晶產(chǎn)物兩次并甩干，烘干得產(chǎn)品，洗滌液和母液合并用于進(jìn)一步回收L-鳥氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品。(11)向合并有洗滌液的母液中，加入一定量的活性炭60°C脫色45分鐘，將母液真空濃縮至起始體積的1/5左右，用6M左右的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5. 0，加等量的95%乙醇，攪拌均勻，置0°C鹽水中降溫8小時(shí)，第二批L-鳥氨酸鹽酸鹽結(jié)晶析出，離心機(jī)分離晶體，用少量 85%的酒精直到結(jié)晶濕重等量的85%乙醇洗滌后用離心機(jī)甩干，得到第二批結(jié)晶，烘干，合并兩次產(chǎn)品，得到所要的L-鳥氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品。5、薄層層析法測(cè)定精氨酸的轉(zhuǎn)化率薄層層析法分離鑒定氨基酸具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、測(cè)定快速、斑點(diǎn)集中及顯色靈敏度高等特點(diǎn)。薄層層析能夠檢測(cè)出0.2 0.5微克量的氨基酸。可以滿足測(cè)定精氨酸的轉(zhuǎn)化率的需要。(1)、20χ10展層薄板的鋪制方法A、配置0. 6 %的羧甲基纖維素鈉水溶液。稱取羧甲基纖維素鈉4. 5g(含水34%)，(用剪刀剪成細(xì)小粉末便于溶解)溶于 500ml蒸餾水中，電爐上加熱使羧甲基纖維素鈉完全溶解后，抽濾得澄清濾液。B、按硅膠粉的質(zhì)量羧甲基纖維素鈉水溶液重量=1 2.5的比例，即IOOml羧甲基纖維素鈉水溶液中加入硅膠粉40g，在碾缽中攪拌研磨成均勻的糊狀物。C、將糊狀的硅膠粉混合液倒在洗凈的20x10玻璃板上，用鋪板器鋪成厚薄均勻后薄板，放置于干凈平整的桌面上自然涼干。(2)、層展精氨酸樣品的制備A、取酶解20小時(shí)的精氨酸轉(zhuǎn)化液Iml加入到2ml的純水中，使精氨酸的濃度為 50 μ g/ μ 1。B、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配置稱取0. Ig精氨酸溶于90ml純水中，調(diào)pH9. 0 (pH8_9. 5均行)后定容至IOOml，精氨酸濃度為1 μ g/ μ 1。(3)、薄板層析分別取1 μ g/ μ 1的精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和50 μ g/ μ 1的精氨酸轉(zhuǎn)化液各1 μ 1點(diǎn)在層析薄板上，待斑點(diǎn)吹干后，將薄板放入層析缸中展層，層析所用的展層劑配比為正丁醇丙酮濃氨水水=10 10 5 230 0C -40 °C展層3-4小時(shí)后，取出薄板進(jìn)行茚三酮顯色。若轉(zhuǎn)化液中殘余精氨酸的顏色跟標(biāo)準(zhǔn)精氨酸的顏色一樣或者更淺，則說明溶液中精氨酸轉(zhuǎn)化>98%，可以進(jìn)入下一工序。6、培養(yǎng)基配制方法平板培養(yǎng)基配制方法如下(1)、LB培養(yǎng)基的配制稱取IOg蛋白胨、5g酵母粉與IOgNaCL溶于950ml的水中，調(diào)pH至7. 0后，加水定容到1000ml，分裝成IOOml份三角瓶；(2) UOO μ g/mlAmp 平板的配制稱取1.5g瓊脂粉溶于含IOOmlLB的三角瓶中，蓋上瓶塞，121°C滅菌20min。待溫度降至45°C以下時(shí)，加入5%的Amp儲(chǔ)存液200 μ 1，混勻后立即無菌分裝18 20ml到已滅好菌的玻璃平板中，待溶液凝固后，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)、含有100 μ g/ml的Amp試管培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基配制方法如下含有100 μ g/ml的Amp的試管培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基的配制取三角瓶裝的IOOmlLB培養(yǎng)基一瓶，蓋上瓶塞，121 °C滅菌20min。待溫度降至40 V 以下時(shí)，加入5%的Amp儲(chǔ)存液200 μ 1，混勻后立即無菌分裝到已滅好菌的玻璃試管3. 5ml 份備用。搖瓶培養(yǎng)用2%玉米漿培養(yǎng)基配制方法如下(4)、2%玉米漿培養(yǎng)基的配制；玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氫二鉀10g/L、硫酸鎂10g/L，加水定容到1000ml， PH7.0 ；分裝成IOOml份三角瓶，蓋上瓶蓋，121°C滅菌20min，備用。發(fā)酵培養(yǎng)用4%玉米漿培養(yǎng)基配制方法如下(5)、4%玉米漿培養(yǎng)基的配制稱取玉米粉1200g、味精750g，磷酸氫二鉀30g，硫酸鎂30g、加水至30升攪拌溶解，0. IMPa蒸汽滅菌25min，降溫至38°C，用于接種培養(yǎng)；(6)、甘油的準(zhǔn)備取甘油600ml，121 °C滅菌20min，用于發(fā)酵過程中補(bǔ)加。7. L-鳥氨酸鹽酸鹽的鑒別和檢測(cè)鑒別比較產(chǎn)品紅外吸收?qǐng)D譜和標(biāo)準(zhǔn)紅外吸收?qǐng)D譜。按照日本味之素公司氨基酸標(biāo)準(zhǔn)第七版提供的分析方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.目前進(jìn)行L-精氨酸轉(zhuǎn)化生成L-鳥氨酸的酶多是來自高等動(dòng)物肝臟的1型精氨酸酶，克隆表達(dá)動(dòng)物肝臟來源的1型精氨酸酶時(shí)，需要由其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行PCR 擴(kuò)增出精氨酸酶的基因才能和載體重組，手續(xù)繁雜，難于掌握。而PCR細(xì)菌基因則簡(jiǎn)單方便得多，利用大腸桿菌基因工程菌表達(dá)枯草桿菌精氨酸酶，具有安全高效，手續(xù)簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，2.所表達(dá)的融合蛋白不但保持了硫氧還蛋白融合蛋白可溶性高效表達(dá)的特性， 而且表達(dá)得精氨酸酶融合蛋白得到正確的折疊，在融合蛋白的形態(tài)下，表現(xiàn)出很高的酶活性，可以滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的要求。3.發(fā)酵培養(yǎng)得到菌體不需要破壁處理即可以直接用于催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn) L-鳥氨酸，工程菌菌體產(chǎn)量和酶活性均已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平要求。工程菌菌體中酶蛋白比重可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白的30%以上，酶活保持好，反應(yīng)20個(gè)小時(shí)后酶活力可保持95%。4.用微生物產(chǎn)生的精氨酸酶代替動(dòng)物來源的酶，不僅開辟了新酶源，而且能夠減少動(dòng)物傳染疾病的機(jī)會(huì)，有利于產(chǎn)品出口。


圖1 枯草芽孢桿菌精氨酸酶基因PCR-TA克隆方案示意圖序列表說明序列1弓丨物Pl的核苷酸序列序列2引物P2的核苷酸序列序列3DNA序列測(cè)定得到的1484個(gè)核苷酸序列序列4融合枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白編碼核苷酸序列序列5插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列序列6融合枯草芽孢桿菌精氨酸酶蛋白的氨基酸殘基序列序列7插入DNA序列編碼的氨基酸殘基序列序列8枯草芽孢桿菌精氨酸酶氨基酸殘基序列關(guān)于序列3、4、5的關(guān)系的說明
權(quán)利要求
1.一種利用大腸桿菌TOPlO/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub基因工程菌生產(chǎn)L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，該大腸桿菌基因工程菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào) CCTCC No. M2010358 ； 生產(chǎn)方法包括如下步驟(1)、將低溫保存的大腸桿菌E.coli TOP 10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub基因工程菌株在含有ΙΟΟμ g/ml Amp的平板上劃線，37°C倒置培養(yǎng)，得到單菌落；(2).將Amp平板上長(zhǎng)出的單菌落接種到含有100μ g/ml的Amp的3. 5ml LB培養(yǎng)基的試管中，37°C、225r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，12 16小時(shí)，得到一級(jí)種液。(3).取培養(yǎng)好的一級(jí)種液9ml接種到裝有IOOml2%的玉米漿培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C、 225r/min，振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，OD = 3，得到二級(jí)種液。；(4).取培養(yǎng)好的二級(jí)種液1.2L接種到30L4%的玉米漿培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度控制在 37°C，培養(yǎng)過程中補(bǔ)加600ml滅菌甘油，整個(gè)發(fā)酵過程中，用濃氨水調(diào)pH7. 0 8. 0，調(diào)整攪拌速度和空氣流量，使溶氧量不低于20%，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至0D_ = 6. 0，12小時(shí)，降溫至30°C， 并加入3g L-Ara進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)8小時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)，收集濕菌體；(5).將發(fā)酵好的菌液在4°C，5000r/min，離心lOmin，棄上清，收集菌體；(6).按菌精氨酸=0.6 10的比例，向100升pH9. 0的15%的精氨酸底物溶液中加入濕菌體900克，把溶液中Mn2+濃度調(diào)整為10 μ mol/L,溫度38°C酶解轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化18小時(shí)后，點(diǎn)薄板檢測(cè)精氨酸酶解情況，精氨酸轉(zhuǎn)化率> 98%時(shí)，進(jìn)入下一工序；其中薄層層析所用的展層劑配比為正丁醇丙酮濃氨水水=10 10 5 2。(7).用6M鹽酸將酶解液pH調(diào)到5.0左右，60°C，保溫30min ；按底物量的15%加入活性炭，60°C，脫色30min后，過濾至清亮；(8).濾液在0.OSMpa以上的真空下濃縮至底物量的2. 5 3倍體積；(9)再按底物量的8%加活性炭，60°C，脫色30min后，過濾至清亮；(10)繼續(xù)減壓濃縮至底物量的1.5倍的體積，加入一倍體積的95%的乙醇，冷卻后，第一批L-鳥氨酸鹽酸鹽結(jié)晶析出。用第一次結(jié)晶產(chǎn)物濕重的一半數(shù)量體積的85%的乙醇洗滌結(jié)晶產(chǎn)物兩次并甩干，烘干得產(chǎn)品，洗滌液和母液合并用于進(jìn)一步回收L-鳥氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的1)步驟中的平板培養(yǎng)基配制方法如下LB培養(yǎng)基的配制稱取IOg蛋白胨、5g酵母粉與IOgNaCL溶于950ml的水中，調(diào)pH至7. 0后，加水定容到 1000ml，分裝成100ml份三角瓶； 100 μ g/mlAmp平板的配制稱取1. 5g瓊脂粉溶于含IOOmlLB的三角瓶中，蓋上瓶塞，121°C滅菌20min。待溫度降至45°C以下時(shí)，加入5 %的Amp儲(chǔ)存液200 μ 1，混勻后立即無菌分裝到已滅好菌的玻璃平板中，待溶液凝固后，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的2)步驟中的含有100μg/ml的Amp試管培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基配制方法如下含有100 μ g/ml的Amp的試管培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基的配制取三角瓶裝的IOOmlLB培養(yǎng)基一瓶，蓋上瓶塞，121°C滅菌20min。待溫度降至40°C以下時(shí)，加入5%的Amp儲(chǔ)存液200 μ 1，混勻后立即無菌分裝到已滅好菌的玻璃試管3. 5ml份
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的幻步驟中的搖瓶培養(yǎng)用2% 玉米漿培養(yǎng)基配制方法如下2%玉米漿培養(yǎng)基的配制；玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氫二鉀10g/L、硫酸鎂10g/L，加水定容到1000ml, PH7.0 ；分裝成IOOml份三角瓶，蓋上瓶蓋，121 °C滅菌20min，備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的4)步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)用4% 玉米漿培養(yǎng)基配制方法如下4%玉米漿培養(yǎng)基的配制稱取玉米粉1200g、味精750g，磷酸氫二鉀30g，硫酸鎂30g、加水至30升攪拌溶解， 0. IMPa蒸汽滅菌25min，降溫至38°C，用于接種培養(yǎng)；取甘油600ml，121°C滅菌20min，用于發(fā)酵過程中補(bǔ)加。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的10)洗滌液和母液合并用于進(jìn)一步回收L-鳥氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品。合并母液中L-鳥氨酸鹽酸鹽進(jìn)一步的結(jié)晶方法是向合并有洗滌液的母液中，加入一定量的活性炭60°C脫色45分鐘，將母液真空濃縮至起始體積的1/5左右，用6M左右的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5. 0，加等量的95%乙醇，攪拌均勻，置 0°C鹽水中降溫8小時(shí)，第二批L-鳥氨酸鹽酸鹽結(jié)晶析出，離心機(jī)分離晶體，用少量85%的酒精直到結(jié)晶濕重等量的85%乙醇洗滌后用離心機(jī)甩干，得到第二批結(jié)晶，烘干，合并兩次產(chǎn)品，得到所要的L-鳥氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)L-鳥氨酸鹽酸鹽的方法，該菌株能夠表達(dá)產(chǎn)生超量的枯草芽孢桿菌精氨酸酶，高效的轉(zhuǎn)化L-精氨酸成為L(zhǎng)-鳥氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/10GK102191291SQ201110103160
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者劉愛福, 易清明, 王君英, 王炯 申請(qǐng)人:武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司, 武漢遠(yuǎn)大弘元藥業(yè)有限公司