專利名稱：立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種病毒的增殖工藝，特別涉及一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝。
背景技術(shù)：
美國(guó)白蛾自1979年在遼寧省發(fā)現(xiàn)以來(lái)，現(xiàn)疫情已在天津、北京、河北等多個(gè)省市蔓延。天津薊縣是美國(guó)白蛾發(fā)生的重點(diǎn)地區(qū)，年發(fā)生面積4萬(wàn)多公頃，每年投入防治資金 1000多萬(wàn)元，白蛾幼蟲在北方年可繁殖2-3代，具有食性雜、適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖量大、傳播途徑廣，危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，對(duì)林果、農(nóng)作物及綠色植物都會(huì)造成直接危害。美國(guó)白蛾核型多角體病毒，是美國(guó)白蛾的天然病原體，是美國(guó)白蛾幼蟲的克星，對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的致死率可達(dá)100%，具有高效專一、不殺天敵、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。但是，目前還不能人工合成，只能依靠活體幼蟲進(jìn)行增殖才能獲得大量的病毒。目前，依靠活體幼蟲進(jìn)行增殖獲得大量核型多角體病毒的工藝主要有以下兩種方法1、圍欄增殖。選在灌木林或苗圃中進(jìn)行，面積大小依據(jù)林地情況和增殖量而定，四周用塑料布圍住防止幼蟲逃逸，按需要從野外采集美國(guó)白蛾幼蟲投入到圍欄內(nèi)，接種病毒養(yǎng)殖，如食物不足，采集新鮮枝葉隨時(shí)填加，一周后開始收集蟲尸，半月后收集完成。該法優(yōu)點(diǎn)是就地取材，缺點(diǎn)是受風(fēng)雨影響大、幼蟲容易逃跑、蟲體不便收集、單位面積多角體病毒量低。2、工廠化生產(chǎn)。多角體病毒工廠化生產(chǎn)全部工作在控溫、控濕室內(nèi)進(jìn)行，按需要養(yǎng)殖成蟲繁殖幼蟲，選用專用飼料，用養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)，采用飼料接種病毒。優(yōu)點(diǎn)是依據(jù)需要數(shù)量， 可以常年生產(chǎn)。缺點(diǎn)是需購(gòu)置相關(guān)設(shè)備、飼料、技術(shù)難度大、成本高，不適宜在農(nóng)村應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，而提供一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，該工藝技術(shù)簡(jiǎn)單、可提高病毒增殖的數(shù)量、降低病毒增殖成本、便于感染病毒死蟲的收集，適宜在廣大鄉(xiāng)村推廣應(yīng)用。如上構(gòu)思，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝， 其特征在于依照下列步驟完成①選擇面積> 50m2、周圍有天然或人工栽植的植物飼料并且附近有水源的場(chǎng)地作為增殖室；②在增殖室內(nèi)搭建用于幼蟲養(yǎng)殖的立體梯形平臺(tái)，平臺(tái)底部距地面8-12cm ；③封閉增殖室門窗；④采集齡期在2-2. 5齡之間的美國(guó)白蛾幼蟲，并將幼蟲擺放在增殖室平臺(tái)上；⑤向擺放好的美國(guó)白蛾幼蟲噴施病毒液，每天早晚兩次連噴3天，以后每天早晚各添加一次新鮮的枝葉，一般需喂養(yǎng)15-18天；
⑥收集病死的蟲尸放入盛有無(wú)菌水的容器內(nèi)浸泡2-4天，然后用勻漿破碎機(jī)研磨粉碎，得到的勻漿液用紗網(wǎng)過濾，過濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次研磨，再用同樣紗網(wǎng)過濾，即成為美國(guó)白蛾多角體病毒液。上述立體梯形平臺(tái)分為上、中、下三層，下層距地面10cm。上述病毒增殖室的溫度在20-25°C之間；相對(duì)濕度在70% -85%之間。上述幼蟲擺放在增殖室平臺(tái)上的密度為3500頭/m2。上述病毒液的濃度為每毫升含100萬(wàn)個(gè)美國(guó)白蛾核型多角體病毒。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、投資少。本工藝增殖核型多角體病毒投資少，一是不需要建工廠和圍欄，不需要設(shè)備投資，搭建增殖平臺(tái)購(gòu)些竹竿等投資不過幾百元。二是喂養(yǎng)的飼料不用購(gòu)買，就地取材應(yīng)用充足的天然植物飼料。2、產(chǎn)量高。應(yīng)用工廠化增殖美國(guó)白蛾核型多角體病毒最多養(yǎng)蟲1000頭/m2，應(yīng)用圍欄法增殖最多養(yǎng)蟲500頭/m2，應(yīng)用新工藝增殖美國(guó)白蛾核型多角體病毒最多養(yǎng)蟲3500 頭/m2。本工藝方法增殖病毒是工廠化增殖方法的3. 5倍，是圍欄方法的7倍。3、質(zhì)量好。本工藝方法不改變幼蟲原食物種類，有利于幼蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)出的病毒液質(zhì)量好。據(jù)武漢病毒所檢測(cè)應(yīng)用本工藝生產(chǎn)的美國(guó)白蛾核型多角體病毒液可達(dá)到 328億/ml，而一般方法生產(chǎn)的美國(guó)白蛾核型多角體病毒液僅200億/ml，病毒數(shù)量提高1 億/ml。4、技術(shù)簡(jiǎn)單。新工藝方法增殖美國(guó)白蛾核型多角體病毒比工廠化方法、圍欄增殖方法技術(shù)簡(jiǎn)單，不用技術(shù)培訓(xùn)容易掌握，最適宜在農(nóng)村推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，依照下列步驟完成1、增殖室場(chǎng)地的選擇一是增殖室要求面積不低于50m2，通風(fēng)透光，有照明設(shè)施； 二是周圍有充足的天然或人工栽植的植物飼料。三是室內(nèi)或附近有水源，方便配制病毒藥液，便于進(jìn)行病毒增殖工作。2、搭建平臺(tái)。用粗1.5-2cm竹竿、鐵絲、無(wú)紡布等材料搭建高100-120cm，上寬60-80cm，下寬 90cm。分上中下3層(長(zhǎng)度依實(shí)地空間而定)，下層距地面IOcm上窄下寬的立體梯形平臺(tái)。 平臺(tái)之間留100-120cm寬的工作道。增殖室配置長(zhǎng)60-80cm、寬20cm、高25-30cm的小板凳10條，以備上層操作時(shí)可當(dāng)腳蹬，在收集下層蟲尸時(shí)當(dāng)小座用。3、嚴(yán)格封閉門窗。平臺(tái)搭好后即開始封閉門窗，為保證通風(fēng)透光采用窗紗封閉門窗，窗子可用單層紗封閉，為了防止幼蟲逃逸，門需要采取雙層封閉措施，兩道封閉線中的間隔距離IOOcm以上，工作人員進(jìn)出時(shí)需隨時(shí)關(guān)好兩道封閉門。4、幼蟲采集。用于病毒增殖的美國(guó)白蛾幼蟲齡期應(yīng)在2-2. 5齡為宜，幼蟲野外采集工作應(yīng)在 1-2天內(nèi)突擊完成為好。采蟲時(shí)隨采隨裝袋，自然裝滿扎緊袋子口，存蔭涼處，運(yùn)輸時(shí)間盡可能縮短，以免幼蟲窒息死亡。采集到的幼蟲要及時(shí)擺放到增殖室平臺(tái)上，做到蟲體分布均勻，合理密度為3500頭/m2。5、接種病毒。病毒增殖室溫度25°C左右；相對(duì)濕度70% -85%最為適宜。按密度擺放幼蟲后立即向幼蟲體及葉片上噴施病毒液(接種病毒)，使其感染病毒，幼蟲接種病毒濃度不宜過大，理想的濃度為每毫升含100萬(wàn)個(gè)美國(guó)白蛾核型多角體病毒。每天早晚兩次連噴3天。以后每天早晚各添加一次新鮮的枝葉，一般需喂養(yǎng)15-18天。6、蟲尸收集與病毒的提取。接種病毒7天后，個(gè)別齡期小的幼蟲開始死亡，要及時(shí)撿拾致病死蟲，并收集保存。接種病毒10天后死蟲進(jìn)入高峰，17天后幼蟲全部老熟可徹底收撿。將收集的蟲尸在研磨破碎前3天放入容器加適量無(wú)菌水，以淹沒蟲尸為宜。用勻漿破碎機(jī)研磨粉碎，研磨時(shí)加入少量水，避免產(chǎn)生高溫。勻漿液用120目的紗網(wǎng)過濾，過濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次研磨，再用同樣紗網(wǎng)過濾，即成為美國(guó)白蛾多角體病毒液。7、病毒液濃度的檢測(cè)與貯存。取混合均勻的病毒原液1ml，稀釋1000倍后用血球計(jì)數(shù)板在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)， 計(jì)數(shù)時(shí)在計(jì)數(shù)板一個(gè)視野里見到的病毒量太少(每視野低于5個(gè))，可再降低稀釋倍數(shù)；反之，(每視野多于20個(gè))提高稀釋倍數(shù)。病毒濃度=(80小格內(nèi)數(shù)量+80) X 400 X IO4X稀釋倍數(shù)病毒懸液在密閉容器中0-4°C保存，在用于防治時(shí)按照施用濃度對(duì)水配兌即可。
權(quán)利要求
1.一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，其特征在于依照下列步驟完成①選擇面積>50m2、周圍有天然或人工栽植的植物飼料并且附近有水源的場(chǎng)地作為增殖室；②在增殖室內(nèi)搭建用于幼蟲養(yǎng)殖的立體梯形平臺(tái)，平臺(tái)底部距地面8-12cm；③封閉增殖室門窗；④采集齡期在2-2.5齡之間的美國(guó)白蛾幼蟲，將幼蟲擺放在增殖室平臺(tái)上；⑤向擺放好的美國(guó)白蛾幼蟲噴施病毒液，每天早、晚兩次連噴3天，以后每天早晚各添加一次新鮮的枝葉，一般需喂養(yǎng)15-18天；⑥收集病死的蟲尸放入盛有無(wú)菌水的容器內(nèi)浸泡2-4天，然后用勻漿破碎機(jī)研磨粉碎，得到的勻漿液用紗網(wǎng)過濾，過濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次研磨，再用同樣紗網(wǎng)過濾，即成為美國(guó)白蛾多角體病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，其特征在于上述立體梯形平臺(tái)分為上、中、下三層，下層距地面10cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，其特征在于上述病毒增殖室的溫度在20-25°C之間；相對(duì)濕度在70% -85%之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，其特征在于上述幼蟲擺放在增殖室平臺(tái)上的密度為3500頭/m2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，其特征在于上述病毒液的濃度為每毫升含100萬(wàn)個(gè)美國(guó)白蛾核型多角體病毒。
全文摘要
一種立體多層封閉式核型多角體病毒增殖工藝，依照下列步驟完成①選擇面積≥50m2、周圍有天然或人工栽植的植物飼料并且附近有水源的場(chǎng)地作為增殖室；②在增殖室內(nèi)搭建用于幼蟲養(yǎng)殖的立體梯形平臺(tái)；③封閉增殖室門窗；④采集齡期在2-2.5齡之間的美國(guó)白蛾幼蟲，將幼蟲擺放在增殖室平臺(tái)上；⑤向擺放好的美國(guó)白蛾幼蟲噴施病毒液；⑥收集病死的蟲尸放入盛有無(wú)菌水的容器內(nèi)浸泡2-4天，然后用勻漿破碎機(jī)研磨粉碎，得到的勻漿液用紗網(wǎng)過濾，過濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次研磨，再用同樣紗網(wǎng)過濾，即成為美國(guó)白蛾多角體病毒液。該工藝技術(shù)簡(jiǎn)單、可提高病毒增殖的數(shù)量、降低病毒增殖成本、便于感染病毒死蟲的收集，適宜在廣大鄉(xiāng)村推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102154222SQ20111009126
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者劉玉書, 孟麗慧, 張紹清, 李春野, 李銀, 王海燕, 祁振坤, 趙占豐, 郭志安 申請(qǐng)人:薊縣林業(yè)局林業(yè)科技推廣中心