專利名稱：一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白 TaAP2及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、鹽堿等逆境脅迫是限制植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占全球陸地面積的三分之一，我國干旱、半干旱地區(qū)占全國陸地面積的二分之一；還有3.6X107hm2的鹽堿地有待開墾利用。小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、鹽堿等逆境我國對小麥造成的減產(chǎn)達(dá)700-800億公斤，嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國小麥糧食生產(chǎn)的快速發(fā)展。因此，改良農(nóng)作物的抗逆性，選育耐旱、農(nóng)作物新品，已經(jīng)成為作物品種改良的重要課題。近年來，隨著植物抗逆分子生物學(xué)研究的深入，初步揭示了植物對逆境脅迫信號(hào)應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控等分子機(jī)理，為利用基因工程技術(shù)改良作物的抗逆性提供了科學(xué)依據(jù)。目前，通過基因工程技術(shù)已將許多抗旱、耐鹽、耐低溫相關(guān)的基因?qū)氲街参镏校岣咧参锏目鼓嫘砸延邢嚓P(guān)研究報(bào)道。近年來，抗逆基因工程的研究重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向與逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄因子大多與生物和非生物脅迫下抗逆基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)，已成為逆境脅迫信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的重點(diǎn)之一。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)145個(gè)成員，一般分為AP2、RAV、DREB、ERF和AL079349 5個(gè)亞族。其中，ERF亞族包括65個(gè)基因，大都參與生物和非生物脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)控下游功能基因的表達(dá)。例如，Cao等分離得到3個(gè)水稻 ERF類轉(zhuǎn)錄因子OsBIERFl、0sBIERF3和0sBIERF4，其表達(dá)受病原菌、鹽、低溫、干旱等脅迫誘導(dǎo)。Tang等將麻瘋樹的JcERF基因在擬南芥中過量表達(dá)，提高了擬南芥的抗鹽性和抗凍性。最近的研究表明，馬鈴薯StEREBPl基因的過量表達(dá)可誘導(dǎo)下游抗性基因表達(dá)，并提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對高鹽和低溫脅迫的耐受力。植物在遭受逆境脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化。長期鹽脅迫將導(dǎo)致葉片中鹽分積累，增加植物葉綠素酶的活性。綜上所述，AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物的逆境反應(yīng)，提高植物的抗逆性中起著至關(guān)重要的作用。過量表達(dá)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因提高了植物的抗逆能力，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育不產(chǎn)生任何負(fù)面作用，這對抗逆育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用和經(jīng)濟(jì)效益。因此， 利用抗逆相關(guān)的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要理論和實(shí)踐意義。利用抗旱小麥種質(zhì)資源，挖掘、篩選出優(yōu)良的抗旱、耐鹽相關(guān)基因改良小麥的抗逆性，為培育小麥等糧食作物抗旱、耐鹽新品種提供重要的抗逆基因資源，對鹽漬化土地的治理與改良等方面均具有重要實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2。
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2的編碼基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2及其基因的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2，來源于小麥京冬17，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。SEQ ID NO. 1

MAPLSQHHMR IRDALAKRPK TRMLAGFGVK PSAAFSKPAQ LQAQALLPAAQPPRRRVRVL60YEDPDATDSD TDDEEEAAVA APASSKRCFE LFLGKAPPAK VFAKPVTPTAAASAVAACTT120SSAEGHRGVR LRKffGKffAAE IRNPF SGKRE WLGTFDTADL ASAAYQAASRSFIEEKRRRR180GQSVAAASPA RSAASTTPTS SSTTPTASSS SSTSAAPFAH PSPSSVLEATKPADESLSPE240PTPVPVMVST TAETAQLPDD PEFYQDLLRG LQLPDIDPMD FRAGLDALDVSEASAYLDGE300QDLLL⑶FAD EELELDMDLD I⑶DFLEMPG CDFGRGMDDF LQTVDFCV 348根據(jù)本發(fā)明的TaAP2基因編碼上述蛋白，可具有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列， TaAP2開放閱讀框(ORF)長度為1047bp。SEQ ID NO. 2 atggccccgt tgagccagca ccacatgcgc atcagggacg cgctggccaa aaggcccaag60accaggatgc tcgccgggtt cggcgtcaag ccctccgccg ccttctccaa gccggcgcag 120ctgcaggcgc aggcgctgct gcccgccgcg cagccgccga ggcggcgcgt gcgcgtcctg 180tacgaggacc ccgacgccac cgactccgac accgacgacg aggaggaggc ggcggtcgcc 240gcacctgctt cgtccaagcg ctgcttcgag ctgttccttg gcaaggcccc gccggccaag 300gtgtttgcca agccggtcac tccgaccgcc gctgcttctg ctgtcgctgc ctgcaccacc 360agcagcgccg agggccaccg cggtgtgcgc ctccgcaagt ggggcaagtg ggcggccgag 420atccgcaacc cgttctccgg caagagggag tggcttggca ccttcgacac cgccgacttg 480gcctccgccg cctaccaggc cgcctcccgg agctttatcg aggagaagcg tcgccgccgt 540ggccagtctg tggccgcggc ctcgcccgct cggtctgctg cgtcaacaac accgacgtcg 600tcttctacta caccgacggc atcttcgtcg tcctccacct ctgctgctcc gttcgcgcac 660ccgtcgccgt cctctgtcct tgaagccacg aagccagcag atgagtccct gtcgcctgag 720ccgactccag ttccggtcat ggtgtccacc acggctgaga ccgcgcagct gcctgacgac 780ccagagttct accaggacct cctgcgcggt cttcagctgc cggacatcga cccgatggac 840ttccgcgccg ggcttgatgc cctggacgtc tccgaggcgt cggcttactt ggacggcgaa 900caggacctgc tgctcggtga cttcgccgat gaggagctgg agctggacat ggacctcgac 960atcggcgacg acttcctgga gatgcccggc tgcgacttcg gccgaggcat ggatgatttc 1020ctgcaaaccg tcgatttctg cgtgtga1047另外，干旱和高鹽脅迫處理表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明TaAP2基因受干旱誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，對高鹽處理敏感。同時(shí)，構(gòu)建該基因的過量表達(dá)載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將TaAP2 轉(zhuǎn)入煙草，PEG脅迫處理實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)TaAP2基因煙草具有抗旱性，證明了 TaAP2基因在煙草中成功表達(dá)，且提高了煙草的抗旱能力，可以作為煙草抗旱育種的優(yōu)質(zhì)候選基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗旱、耐鹽植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗旱耐鹽植物的方法，是將上述任一種含有TaAP2基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。所述植物耐逆性具體可為對非生物脅迫的耐逆性，如對干旱或鹽脅迫的耐逆性。本發(fā)明以抗旱、耐鹽性較強(qiáng)小麥京冬17 (Triticum aestivum L.)為實(shí)驗(yàn)材料，得到了抗旱、耐鹽性TaAP2基因，并將其導(dǎo)入煙草，顯著提高了植物的抗旱、耐鹽性。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)植物抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。


圖1 TaAP2基因在逆境誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析，A、將小麥幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，分別在0、1、2、5、10、24小時(shí)取樣提取RNA，進(jìn)行干旱脅迫表達(dá)特性分析；B、將小麥幼苗置于200mM NaCl溶液中，分別在0、1、2、5、10、24小時(shí)取樣提取 RNA，進(jìn)行高鹽脅迫表達(dá)特性分析；C、將小麥幼苗置于4°C中，分別在0、1、2、5、10、24小時(shí)取樣提取RNA，進(jìn)行冷脅迫表達(dá)特性分析。圖2 35S_TaAP2轉(zhuǎn)基因煙草耐旱、耐鹽性鑒定，A、35S_TaAP2轉(zhuǎn)基因煙草和W38(對照)在含有200mMNaCl培養(yǎng)基上的生長情況；B、35S_TaAP2轉(zhuǎn)基因煙草和W38 (對照)在含有2% PEG培養(yǎng)基上的處理0天生長情況；C、35S-TaAP2轉(zhuǎn)基因煙草和W38 (對照)在含有 2% PEG培養(yǎng)基上的處理60天生長情況。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例1、TaAP2基因的克隆及序列基序分析1、將25°C光照培養(yǎng)2周左右的小麥京冬17植株進(jìn)行干旱、高鹽(200mM NaCl)脅迫處理，分別在他^！！二?。×?！^川?。《幒笕?，迅速置于液氮冷凍，-80°C保存?zhèn)溆?。根?jù) RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)完成植物葉片組織的總RNA提取，之后以提取的總RNA為模板，以AP序列為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的cDNA模板。設(shè)計(jì)一對引物Taap2-F 5， -TAAGAGGAGGAAGAAGAAGAGGCAG-3，Taap2-R 5’ -GCCCATCACACCACAGCATT-3’本發(fā)明得到一個(gè)基因TaAP2，TaAP2開放閱讀框(ORF)長度1047bp，編碼348個(gè)氨基 酸，在NCBI上比對分析，最高一致性最高僅在66%，證明為新基因?qū)嵤├?、逆境脅迫處理下小麥TaAP2基因的表達(dá)特征將小麥種子種在盆中，生長3周后取幼苗進(jìn)行如下脅迫處理1)干旱處理將新疆偃麥草幼苗從土中取出吸干根 上的水分，置于干燥的濾紙上；2)鹽處理將新疆偃麥草幼苗置于200mM NaCl溶液中；分別在上述各種處理后O、1、2、5、10、24小時(shí)取樣，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆?。分別將干旱處理、鹽處理后0、1、2、5、10、24小時(shí)的樣品提取總RNA，以TaAP2DNA為探針(序列表中的序列1)，進(jìn)行熒光定量分析。半定量分析結(jié)果見圖2。A為干旱處理的樣本；B為NaCl處理的樣本。結(jié)果表明在干旱脅迫1小時(shí)TaAP2基因表達(dá)達(dá)到高峰；在高鹽(200mM NaCl)脅迫1小時(shí)TaAP2基因表達(dá)達(dá)到高峰，在冷脅迫2小時(shí)TaAP2基因表達(dá)達(dá)到高峰，說明該基因受干旱、高鹽和冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)TaAP2基因植株耐旱、耐鹽性鑒定1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建以小麥的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有SmaI和XbaI接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后SmaI和XbaI雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶切產(chǎn)物正向插入載體 PBI121的CaMV 35S啟動(dòng)子之后的SmaI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體353_TaAP2。引物序列如下ErNAC7[SmaI]5'-GCGCCCGGGatggccccgttgagccagca-3，ErNAC7[XbaI]5， -TGCTCTAGA agtgtgcgtctttagct-3，2、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和鑒定將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體35S_TaAP2分別用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，再用葉盤法分別將整合有35S-TaAP2的根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化煙草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選10-15天，得到陽性轉(zhuǎn)基因植株。將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因植株用PCR做進(jìn)一步鑒定篩選，PCR所用的一對引物為P3和P4。P3 (上游引物)5，-TCGCCGTCCTCTGTCCTTGA-3，，P4 (下游引物)5，-AGGTCCTGTTCGCCGTCCAA-3，。對35S_TaAP2轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR鑒定，陽性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得240b 左右條帶，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)35S-TaAP2煙草40株。同時(shí)將pBI121空載體導(dǎo)入煙草W38，方法同上，作為對照，獲得10個(gè)株系的轉(zhuǎn)空載體煙草(篩選獲得的轉(zhuǎn)基因煙草用T1代表示)。將T1代轉(zhuǎn)35S_TaAP2基因煙草種子及T1代轉(zhuǎn)空載體對照植株的3周齡苗的根系分別移入含有200mM NaCl的培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理60天，觀察表型并拍照。結(jié)果表明脅迫處理60天后，35S-TaAP2轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下能夠正常生長，根系發(fā)達(dá)、葉片顏色深綠；所有空載體轉(zhuǎn)基因植株葉片、根系生長緩慢。轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定結(jié)果證明TaAP2 基因可以提高植物耐鹽性。將T1代轉(zhuǎn)35S_TaAP2基因煙草種子及T1代轉(zhuǎn)空載體對照植株的3周齡苗的根系分別移入含有2%PEG的培養(yǎng)基中進(jìn)行干旱脅迫處理60天，觀察表型并拍照。結(jié)果表明脅迫處理60天后，35S-TaAP2轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下能夠正常生長，根系發(fā)達(dá)、葉片顏色深綠；所有空載體轉(zhuǎn)基因植株葉片生長緩慢。轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性鑒定結(jié)果證明TaAP2基因可以提高植物的耐旱性。
權(quán)利要求
1.植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2，其特征在于，其具有如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因TaAP2，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因TaAP2，其特征在于，其具有如SEQID NO. 2所示的堿基序列。
4.包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因TaAP2的重組載體
5.權(quán)利要求1所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因TaAP2的應(yīng)用。
7.一種培育抗旱、耐鹽植物的方法，所述方法包括將含有權(quán)利要求2所述TaAP2基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中、得到抗旱植物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白TaAP2及其編碼基因和應(yīng)用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)煙草抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102206260SQ20111007672
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者唐益苗, 張朝, 張風(fēng)廷, 柳珊, 趙昌平, 陳京瑞, 馬錦繡, 高世慶 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院