專利名稱：一種無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種結核桿菌融合蛋白ESATe-RpfE和其制備方法，以及其在制備結核亞單位疫苗中的應用。
背景技術：
結核病是長期危害人類健康的嚴重疾病之一。全世界仍有近1/3的人感染過結核分枝桿菌。大約有5%的結核感染者在2-5年內(nèi)會發(fā)展為肺結核病人；其余的有可能會形成結核病的潛伏感染者。我國是結核病高負擔的國家之一，每年約有13萬人因結核病而死亡。目前，卡介苗BCG的接種是有效預防結核病的重要措施。然而，不同研究顯示，BCG在不同人群中的保護性不穩(wěn)定，尤其是對成人肺結核的保護效率介于0-80%不等。因此，研制和開發(fā)全面高效的抗結核疫苗是控制結核病的重要途徑?？晒┭芯康目菇Y核疫苗有亞單位疫苗，重組BCG，減毒的MTB活疫苗。而亞單位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒為載體的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明確，使用安全等優(yōu)點，相對易于被人們接受。利用基因工程技術將具有優(yōu)勢的不同的單個結核保護性抗原進行重組，從而構建成融合蛋白。大量研究表明，與單個抗原相比，融合抗原的免疫原性會增強，顯示出更好的保護效果；因此受到國內(nèi)外研究的重視。然而在以往的研究中，為了后期簡便的純化方法，往往構建成帶有各種標簽(如 His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，卻未考慮這種融合蛋白所帶有的標簽是否會影響到動物實驗以及更進一步的臨床學試驗的認可。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供了一種無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白質。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編
碼基因。所述融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白ESAT6_RpfE的 DNA分子。含有上述融合蛋白ESATe-RpfE的編碼基因的重組表達載體，所述重組表達載體為PET30a質粒。 含有上述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的制備方法，包括有以下步驟1)獲得上述結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因；
2)將步驟1)得到的結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因導入重組表達載體；3)將步驟2)載體導入宿主細胞；4)培養(yǎng)步驟3)得到的宿主細胞；5)將步驟4)得到的宿主細胞進行處理得到上述結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE并純化和表達。所述編碼基因為序列1所示的核苷酸序列；所述重組表達載體為PET30a質粒；所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第四個目的是提供一種上述無標簽結核桿菌融合蛋白ESATe-RpfE在制備抗結核的候選疫苗中的應用。本發(fā)明選用的結核分枝桿菌早期分泌蛋白ESAT6，其具有多個T細胞、B細胞表位，是抗結核免疫反應的主要配體，有較強的免疫原性和免疫反應性。ESAT6能成為檢測 MTB抗體的特異性抗原，其優(yōu)勢是能區(qū)分MTB自然感染和BCG接種以及非致病性分枝桿菌感染后產(chǎn)生的抗體。另外RPF (Resuscitation Promoting Factor)是一種細菌復活生長因子，以自分泌或旁分泌的形式促進休眠菌的復蘇和生長，也是細菌生長真正必需的分泌蛋白之一.結核分枝桿菌 H37 Rv 株的基因 Rv0867c (RpfA)、Rvl009 (RpfB)、Rvl884c (RpfC) Rv2389c (RpfD), Rv2450c (Rpf Ε)均編碼具有同源性的RPF樣蛋白，RPF蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第1個能使休眠的細菌恢復生長繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原，能引起較強的免疫應答，刺激宿主機體產(chǎn)生的特異性抗體，能阻斷RPF蛋白對MTB的作用，阻止MTB在體內(nèi)的復蘇和復發(fā)，因此RPF蛋白可能是預防和控制MTB感染的一種新型途徑。基于以上的研究背景情況，本發(fā)明利用基因工程技術，克隆構建了無任何標簽的結核分枝桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE，并且進行了表達和純化，以期望成為抗結核的候選疫
田ο


圖1為結核分枝桿菌基因RpfE體外擴增。圖2為重組質粒pET30a_ESAT6的PCR鑒定。圖3為重組質粒pET30a_ESAT6與基因RpfE的連接。其中1 未酶切的質粒pET30a_ESAT6 ；2 雙酶切以及純化的質粒pET30a_ESAT6 ； 3 雙酶切以及純化的基因RpfE。圖4為融合基因ESAT6_RpfE的表達結果。其中，1=Marker ；2 :BL21 空菌上清；3 :ESAT6_RpfE 上清 4 :BL21 空菌沉淀；5 ESAT6-RpfE 沉淀。圖5為結核分枝桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE最終的純化結果。其中，1=Marker ；2 最終純化的 ESAT6_RpfE。
具體實施例方式材料
1、引物:ESAT6上游引物(Es)、ESAT6下游引物(Ea) ,RpfE上游引物(Rs) ,RpfE下游引物(Ra)。ESAT6 上游弓丨物(Es) CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT ；ESAT6 下游引物(Ea) TTGGAATTCTGCGAACATCCCAGTGAC ；RpfE 上游弓丨物(Rs) CGGGAATTCATGGACGACGCGGGCTTGGA ；RpfE 下游弓丨物(Ra) ATAAAGCTTTCAGCCGCGGCGGCCGCAGA。2、引物由上海生物生工工程有限公司合成；結核分枝桿菌株H37Rv及臨床耐藥株來自甘肅省疾病控制中心；質粒pET30a、E. coli DH5 α與BL21(DE3)由復旦大學王洪海教授惠贈；、0.45um 濾器購買于 Beyotime Biotechnoly, lot R0KA590211、尿素購買于 Bio Basic INC, UB0148試劑均購自蘭州市鵬程生物有限公司；IPTG購自蘭州市鵬程生物有限公司 Merck420332。3、下列試劑的配方50 μ g/ml卡那霉素取5mg的卡那霉素粉末溶于IOOml雙蒸水中，0. 22um濾器過
濾后使用。LB液體培養(yǎng)基取Ig胰蛋白胨，0. 5g酵母提取物，Ig氯化鈉加水定容至100ml， 121 度，高壓 20min。20mM PB (pH7. 4)配制方法配制時，先配制 0. 2mol/L 的 NaH2PO4 和 0. 2mol/L 的 Na2HPO4,兩者按19 81的比例混合即成0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)。PBS緩沖液稱取0. 29g磷酸氫二鈉，0. 02g磷酸二氫鉀，0. 02g氯化鉀，0. 8g氯化鈉，加水溶解定容至100ml。4、酶的來源T4DNA連接酶購買于 Fermentas，#EL10014，lot 0042595、限制性內(nèi)切酶EcoR I 購買于 Fermentas，#ER0271，lot00031477。HindIII 購買于 Fermentas, #ER0507 lot 00017410。Nde I 購買于 Fermentas, #ER0585，lot 00025089。5、弱陰離子交換柱 DEAE 購買于 GE healthcare, 17-6002-33，lotl00299 ；HiC Octylg 柱購買于 GE healthcare, 28-4110-07, lot 10034003。實施例1一、重組質粒pET30a-ESAT6_RpfE的克隆構建；1、根據(jù)GenBank中H37Rv中的ESAT6和RpfE的基因序列，設計4對引物，分別為 ESAT6上游引物(Es)含酶切位點Nde I及起始密碼子；ESAT6下游引物(Ea)含酶切位點 EcoR I ；RpfE上游引物(Rs)含酶切位點EcoR I ；RpfE下游引物(Ra)含酶切位點HindIII 及終止密碼子。以H37Rv的DNA為模板，PCR擴增的ESAT6基因；臨床耐藥株為模板， PCR擴增436bp的RpfE基因(見圖1)。ESAT6基因的PCR為98°C變性10s，60°C退火15s， 72°C聚合30s，共30個循環(huán)。RpfE基因的PCR均為98°C變性15s，63°C退火15s，72°C聚合 50s，共35個循環(huán)。2、Nde I、EcoR I雙酶切并純化后的ESAT6基因和質粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進行連接，轉化入E. Coli DH5a中。PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定(北京華大基因科技完成測序)見圖2。即保存菌種為pET30a-ESAT6 (DH5 a )。
3、提取以上鑒定正確的重組質粒pET30a-ESAT6。EcoR I和HindIII雙酶切RpfE 基因和重組質粒pET30a-ESAT6，分別純化后用T4連接酶進行連接，轉化入E. Coli DH5 α。 PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定(北京華大基因科技完成測序)(見圖4)。即保存菌種為 pET30a-ESAT6-RpfE (DH5 α )。二、融合基因ESAT6_RpfE的誘導表達；1、從以上 E. Coli pET30a-ESAT6_RpfE (DH5 α )提取重組質粒 pET30a-ESAT6-RpfE，轉化入Ε. Coli BL21(DE3)中，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定 (北京華大基因科技完成測序)。即為保存菌種為pET30a-ESAT6-RpfE(BL21)。2、將菌種pET30a-ESAT6-RpfE (BL21)接種于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)約3小時，至A600值為0. 6 0. 8，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 37°C誘導表達6 8h，收集菌體。3、上述菌體重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴下超聲破碎40min左右至液體澄清， 40C，IOOOOrpm離心20min后，將上清和沉淀分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE凝膠電泳)。4、經(jīng)SDS-PAGE分析，與BL21空菌相比，有明顯的特異蛋白表達條帶，以包涵體形式表達為主，上清中蛋白很少(見圖5)。三、融合蛋白ESAT6_RpfE的純化步驟；1、配制以下緩沖液1 液 20mM PB (pH7. 4) ；II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4) ；III 液 20mM PB+2M NaCl(ρΗ7· 4) ·2、大量表達融合蛋白ESAT6-RpfE，收集的菌體重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴下超聲破碎Ih左右，4°C，IOOOOrpm離心20min離心后收集沉淀，8M尿素溶解。3、預先處理透析袋，配制復性液6M尿素，4M尿素，2M尿素，IM尿素，OM尿素各 5000ml，4 0C下進行梯度透析復性。4、用0.45um濾器過濾復性后的蛋白，并測定蛋白濃度(mg/ml)，根據(jù)所選層析柱的載量，計算確定蛋白的上樣量。5、第一步純化離子交換層析。選用弱陰離子交換柱DEAE進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得初步純化物。6、第二步純化疏水層析。經(jīng)過離子交換層析初步純化后的蛋白，加入等體積的III液，使蛋白含高鹽上柱。選用HiC Octyl柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行 SDS-PAGE分析得最終純化物。7、將最終得到的蛋白純化物，在PBS溶液中進行透析后即可用。
權利要求
1.一種無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白質。
2.權利要求1所述的無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述融合蛋白ESAT6-RpfE的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因的重組表達載體，所述重組表達載體為PET30a質粒。
5.含有權利要求4所述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。
6.一種如權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的制備方法，其特征在于 包括有以下步驟1)獲得如權利要求2所述的結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因；2)將步驟1)得到的結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE的編碼基因導入重組表達載體；3)將步驟2、載體導入宿主細胞；4)培養(yǎng)步驟幻得到的宿主細胞；5)將步驟4)得到的宿主細胞進行處理得到如權利要求2所述的結核桿菌融合蛋白 ESAT6-RpfE并純化和表達。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述編碼基因為序列1所示的核苷酸序列；所述重組表達載體為PET30a質粒；所述宿主細胞為大腸桿菌BL21。
8.—種如權利要求1所述的結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE在制備抗結核的候選疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無標簽結核桿菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白質，并提供了其制備方法和制備疫苗的應用。本發(fā)明選用的結核分枝桿菌早期分泌蛋白ESAT6，是抗結核免疫反應的主要配體，有較強的免疫原性和免疫反應性。RPF是一種細菌復活生長因子，以自分泌或旁分泌的形式促進休眠菌的復蘇和生長，也是細菌生長真正必需的分泌蛋白之一。RPF蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第1個能使休眠的細菌恢復生長繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原，能引起較強的免疫應答，刺激宿主機體產(chǎn)生的特異性抗體，能阻斷RPF蛋白對MTB的作用，阻止MTB在體內(nèi)的復蘇和復發(fā)，因此RPF蛋白可能是預防和控制MTB感染的一種新型途徑。
文檔編號C12N1/21GK102190733SQ201110068819
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權日2011年3月22日
發(fā)明者張穎, 李志 , 王秉祥, 祝秉東, 章國平, 胡麗娜, 達澤蛟 申請人:蘭州大學