專利名稱：固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種用固定化脂肪酶催化制備蔗糖-6-脂肪酸酯的方法，屬于蔗糖-6-酯制備的技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
食品添加劑在食品加工中扮演重要角色，而甜味劑是賦予食品甜味的食品添加劑。三氯蔗糖作為新型非營養(yǎng)型高效甜味劑的杰出代表，因其優(yōu)良的性能而被認為是至今為止人類已開發(fā)的一種最完美最有競爭力的強力甜味劑。三氯蔗糖(TGS，4，1’，6’ -三氯-4，1’，6’ -三脫氧半乳蔗糖的簡稱)是蔗糖分子中的4，1’，6’ -OH被氯原子取代，同時 4-位發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)的產(chǎn)物。它是一種低能量強力甜味劑，具有甜度高、甜味特性好、對抗酸水解穩(wěn)定性好、低熱值、無毒、抗齲齒、溶解性好、絕對安全性等特點，甜度為蔗糖的650倍。 在美國、英國和加拿大等國家已在多種食品中替代蔗糖，廣泛應用于飲料、口香糖、巧克力、 面包、糕點、果凍、果醬等諸多品種中。三氯蔗糖是蔗糖分子中4_、1’ -和6’ -位置的三個羥基被氯原子取代的產(chǎn)物。在蔗糖分子中有8個羥基，其中有3個伯羥基(6-、1’ _、6’ _)，5個仲羥基0-、3-、4-、3’ -、 4’ _)，它們的化學反應活性有較大差異，一般是伯羥基的反應活性高于仲羥基的反應活性。 在三氯蔗糖合成中，涉及到用氯原子取代蔗糖分子中的1’ _、6’ -位兩個伯羥基和4-位仲羥基，同時4-位構(gòu)型發(fā)生翻轉(zhuǎn)，而6-位羥基必須保留，其它羥基保持不變。研究表明蔗糖6-位羥基對于蔗糖氯化衍生物的甜度有重大影響，它對于合成高甜度甜味劑是絕對重要的，任何形式的取代都將影響其甜度?；谏鲜鲈颍捎帽容^容易移除的基團將6-位羥基保護起來(如苯甲?；蛞阴；?使其不被氯化，然后控制合適的氯化條件選擇性地將 4，1’，6’-0H氯化，再將6-位羥基還原脫除保護基團即得到三氯蔗糖，這樣就不需要像全基團保護法那樣，將所有的基團保護起來。蔗糖-6-酯是制備三氯蔗糖的重要中間體，在三氯蔗糖的制備中，以蔗糖為原料制備三氯蔗糖的主要問題是如何向蔗糖分子中4，1’，6’位上引入氯原子進行脫氧氯化，同時保持其它位置的羥基不變，在進行氯化處理之前，必須對蔗糖分子中某些不需要反應的羥基實施保護。無論采用何種羥基保護方法，其目的非常明確，即將蔗糖分子中反應活性較高的6-羥基保護起來，同時將需要氯化的羥基進行活化，這是確定羥基保護的思想。羥基保護是氯化前期的關鍵步驟，必須采用有效的6-位羥基?；椒?。傳統(tǒng)的蔗糖-6-酯中間體的制備主要采用部分?；?、原乙酸三甲酯和二丁基氧化錫法等化學合成方法?；瘜W法存在問題較多，由于蔗糖羥基較多，合成的蔗糖酯副產(chǎn)物較多，酯化位置難以控制、選擇性低，反應步驟復雜而且反應大多需要在較為苛刻的條件下進行，存在較多限制因素。脂肪酶廣泛分布于微生物和動植物中，可以催化解酯、酯交換、酯合成等反應。脂肪酶催化蔗糖酯的合成是近幾年來新興的酶催化合成法，它具有高度立體選擇性、區(qū)域?qū)Ｒ恍?，產(chǎn)物分離簡單；不同來源的酶具有不同的催化特點和催化活力，具有重要的理論意義和應用價值。在吡啶、環(huán)己烷、二甲基酰胺、二甲基亞砜等有機溶劑中進行的酶催化反應，增加了蔗糖溶解性，但酶的活性大大降低，有機溶劑的毒性使蔗糖酯難以用于食品或藥品，因此宜采用低毒性的有機混合溶劑體系。Woudenberg 等(1996 年 49 卷《Biotechnol Bioeng)) 328-333 頁)在毒性較小的叔丁醇體系中用假絲酵母脂肪酶(Candida Antatctica)做生物催化劑合成了等量的蔗糖-6-月桂酸單酯和蔗糖_6’ -月桂酸單酯，酯化率均為50%，蔗糖-6-酯的特異選擇性不
尚ο班青、馬萬勇、吳建國等申請的專利CN1733927A公開了一種酶催化生產(chǎn)蔗糖脂肪酸酯的方法，在有機溶劑體系中以固定化脂肪酶催化蔗糖和脂肪酸(C6 C22)合成蔗糖脂肪酸酯，固定化脂肪酶選自Miizomucor miehei，NOVOZym435，豬胰脂肪酶，假單胞桿菌脂肪酶，Lipozyme RM ；產(chǎn)物分離提純簡便；但是蔗糖分子中有8個羥基，可與8分子脂肪酸縮合成酯，合成的蔗糖脂肪酸酯多為單酯、雙酯和三酯，產(chǎn)物較為復雜，難以得到純度高的單酯。 同時直鏈或支鏈脂肪酸較脂肪酸乙烯酯做蔗糖酰基供體反應速率低約100-120倍。產(chǎn)物水的存在阻礙了可逆反應向生成目標產(chǎn)物蔗糖-6-酯的方向進行。歐洲專利申請EP1905838A1公開了一種酶特異性催化蔗糖_6_酯的方法，以蔗糖和脂肪酸酯為原料，溫度30-70度，其中脂肪酸酯選自醋酸丙烯酯、丙酸乙烯酯和丁酸乙烯酯，生物催化劑為唐菖蒲伯克霍爾德菌屬(Buricholderia gladioli )脂肪酶，包括Lipase PL, Lipase QL，Lipase QLM。在實施案例中表明反應20h后Lipase QLM催化蔗糖和醋酸丙烯酯合成蔗糖-6-乙酸酯酯化率為四％，蔗糖和丁酸乙烯酯生產(chǎn)蔗糖-6-酯酯化率為48%， 所采用的脂肪酶催化效率和選擇性較低，伴有1’ -位、6’ -位蔗糖酯和蔗糖二酯的生成。因此，采用合適的脂肪酶催化劑和?；w脂肪酸酯，對于合成特定位置的蔗糖-6-脂肪酸酯顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的在于提供一種綠色環(huán)保、無污染、選擇專一性強、高收率、反應條件溫和、分離提純簡單的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂
肪酸酯的合成方法。技術(shù)方案本發(fā)明的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成， 采用固定化酶作催化劑、脂肪酸乙烯酯作?；w的酯化工藝a).將蔗糖溶解于二
甲基亞砜和叔戊醇的混合溶劑，其中按體積比，二甲基亞砜叔戊醇=1:4-9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100-200r/min，至蔗糖完全溶解，恒溫20°C -60°C，加固定化米曲霉脂肪酶10-100mg/ml，恒溫振蕩后，加入分子篩干燥過夜的脂肪酸乙烯酯，其中按摩爾比計，蔗糖脂肪酸乙烯酯=1:2-10 ；最后加入與脂肪酶等量的4A分子篩10-100mg/ml，反應 0. 05-24h，記錄轉(zhuǎn)化率，所有液體溶劑均預先用4A分子篩干燥72h以上，蔗糖和脂肪酶干燥后儲存于變色硅膠干燥器中；b).反應結(jié)束后將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥備用，反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的脂肪酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合，蔗糖酯用二體積的體積比為1:1的環(huán)己烷/ 丁醇，有機相經(jīng)減壓蒸餾，濃縮經(jīng)柱色譜分離，洗脫液為體積比20:1-1:1的氯仿/甲醇，產(chǎn)物經(jīng)有機溶劑重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-脂肪酸酯。
所述的脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯中的一種。固定化米曲霉脂肪酶是將米曲霉脂肪酶固定在載體上的脂肪酶，載體為硅藻土、 二氧化硅、聚丙烯酰胺凝膠或環(huán)氧乙烷-丙烯酸樹脂聚合物。重結(jié)晶的有機溶劑為乙酸乙酯和丙酮中的一種，或其混合物。恒溫水浴振蕩器轉(zhuǎn)速100-200r/min，優(yōu)選100-150 r/min,以防載體崩解。米曲霉脂肪酶催化蔗糖酯的合成具有高度立體選擇性，可特異性的催化蔗糖6-0H 的酯化；同時反應溫度低，產(chǎn)品分離提純?nèi)菀祝捎玫投拘匀軇?，產(chǎn)率高可得到高純度的蔗糖-6-脂肪酸酯，而且固定化酶可反復多次使用，徹底解決了副產(chǎn)物較多，反應條件苛刻的問題。有益效果本發(fā)明中采用米曲霉脂肪酶催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯合成蔗糖-6-脂肪酸酯。首先，脂肪酸乙烯酯作為?；w，是較強的親核試劑，產(chǎn)物乙醛沸點較低，易于分離，從而促使酯交換反應向生產(chǎn)蔗糖酯的方向進行。其次，采用固定化的米曲霉脂肪酶可以特異性催化蔗糖6-位羥基的?；磻?，固定酶成本較低，可以反復使用，節(jié)約生產(chǎn)成本； 第三，混合溶劑的使用，不僅增加了酶的穩(wěn)定性，而且蔗糖的溶解性也大大提高，低毒性溶劑可以用于食品和藥品行業(yè)。第四，反應條件比較溫和，避免了環(huán)境污染和設備的損耗；生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)物提純簡便。
具體實施例方式本發(fā)明采用叔戊醇、二甲基亞砜作混合有機溶劑，利用固定化米曲霉脂肪酶催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯的酯交換反應將蔗糖溶解于二甲基亞砜和叔戊醇的混合溶劑，其中二甲基亞砜叔戊醇(V/V) =1:4-9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100-200r/min，至蔗糖完全溶解，恒溫20°C -60°C，加固定化米曲霉脂肪酶10-100mg/ml，恒溫振蕩0.證后，加入分子篩干燥過夜的脂肪酸乙烯酯，其中蔗糖/脂肪酸乙烯酯(mol/mol) =1:2-10 ；最后加入與脂肪酶等量的4A分子篩10-100mg/ml，反應0. 05_24h，記錄轉(zhuǎn)化率，所有液體溶劑均預先用 4A分子篩干燥72h以上，蔗糖和脂肪酶干燥后儲存于變色硅膠干燥器中。反應結(jié)束后將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥，備用。反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的脂肪酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合，蔗糖酯用二體積的環(huán)己烷/ 丁醇(V/V=l:l)提取，有機相經(jīng)減壓蒸餾濃縮，經(jīng)柱色譜分離，洗脫液氯仿/甲醇(20 1-1 1)梯度洗脫，TLC監(jiān)測合并產(chǎn)物部分， 重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-脂肪酸酯。本發(fā)明采用的脂肪酸乙烯酯為直鏈的或支鏈的含2至 18個碳原子的脂肪酸乙烯酯。重結(jié)晶采用的有機溶劑為乙酸乙酯或丙酮。固定化米曲霉脂肪酶是將米曲霉脂肪酶固定在載體上的脂肪酶，載體為硅藻土、二氧化硅、聚丙烯酰胺凝膠、環(huán)氧乙烷丙烯酸樹脂聚合物。TLC薄層色譜測定反應產(chǎn)物展開劑氯仿/甲醇(V/V)=4/l，顯色劑10%硫酸甲醇溶液，120°C烘干5min炭化顯色。高效液相色譜(HPLC)分析條件島津LC-10AT型高效液相色譜儀LC_10AT高壓輸送泵，色譜柱 Venusil HILIC (250mmX 4. 6mm, 5um, 100A)，柱溫 40°C ；檢測器，RID-10A; 連接器CBM-10A VP PLUS ；流動相，乙腈/水(V/V=90/10);進樣量，20 μ L，流速 1. 0ml/min。
下面通過實施例進一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。TLC薄層色譜測定反應產(chǎn)物展開劑氯仿/甲醇(V/V) =4/1，顯色劑10%硫酸甲醇溶液，120°C烘干5min炭化顯色。高效液相色譜(HPLC)分析條件島津LC-10AT型高效液相色譜儀LC_10AT高壓輸送泵，色譜柱 Venusil HILIC (250mmX 4. 6mm, 5um, 100A)，柱溫 40°C ；檢測器，RID-10A ；連接器 CBM-10A VP PLUS;流動相乙腈 / 水(V/V=90/10)；進樣量，20 μ L，流速 1. Oml/min。實施例1 0. 6846g蔗糖溶于10毫升二甲基亞砜后加入40毫升叔戊醇，叔戊醇和二甲基亞砜預先經(jīng)4A分子篩干燥72h以上，置于TDA-8002型水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速 100r/min,恒溫40°C，至蔗糖完全溶解后加固定化米曲霉脂肪酶5克，恒溫振蕩0. 5小時后， 加入0.8609g經(jīng)4A分子篩干燥過夜的醋酸乙烯酯，最后加入5g 4A分子篩，反應6小時。將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥，備用。反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的醋酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合， 蔗糖-6-乙酸酯用二體積的環(huán)己烷/ 丁醇(V/V=l:l)提取，有機相經(jīng)減壓蒸餾，濃縮經(jīng)柱色譜分離，洗脫液氯仿/甲醇(20 1-1 1)梯度洗脫，TLC監(jiān)測蔗糖Rf =0. 2，蔗糖-6-乙酸酯Rf =0. 7 ；合并產(chǎn)物部分，重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-乙酸酯，產(chǎn)品由HPLC分析顯示蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率為61. 3%。實施例2 0. 2567g蔗糖溶于5毫升二甲基亞砜后加入20毫升叔戊醇，叔戊醇和二甲基亞砜預先經(jīng)4A分子篩干燥72h以上，置于TDA-8002型水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速 lOOr/min，恒溫40°C，至蔗糖完全溶解后加固定化米曲霉脂肪酶2. 5克，恒溫振蕩0. 5小時后，加入1. 6977g經(jīng)4A分子篩干燥過夜的月桂酸乙烯酯，最后加入2. 5g 4A分子篩，反應6 小時。將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥，備用。反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的月桂酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合，蔗糖-6-月桂酸酯用二體積的環(huán)己烷/ 丁醇(V/V=l:l)提取，有機相經(jīng)減壓蒸餾，濃縮經(jīng)柱色譜分離，洗脫液氯仿/甲醇(20:1-1:1)梯度洗脫，TLC監(jiān)測蔗糖Rf =0.2，蔗糖-6-月桂酸酯Rf =1. 5 ；合并產(chǎn)物部分，重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-月桂酸酯，產(chǎn)品由HPLC 分析顯示蔗糖-6-月桂酸酯產(chǎn)率為89. 3%。實施例3 0. 2567g蔗糖溶于5毫升二甲基亞砜后加入20毫升叔戊醇，叔戊醇和二甲基亞砜預先經(jīng)4A分子篩干燥72h以上，置于TDA-8002型水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速 120r/min，恒溫40°C，至蔗糖完全溶解后加固定化米曲霉脂肪酶2. 5克，恒溫振蕩0. 5小時后，加入2. 1185g經(jīng)4A分子篩干燥過夜的棕櫚酸乙烯酯，最后加入2. 5g 4A分子篩，反應6 小時。將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥，備用。反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的棕櫚酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合，蔗糖-6-棕櫚酸酯用二體積的環(huán)己烷/ 丁醇(V/V=l:l)提取，有機相經(jīng)減壓蒸餾，濃縮經(jīng)柱色譜分離，洗脫液氯仿/甲醇(20:1-1:1)梯度洗脫，TLC監(jiān)測蔗糖Rf =0.2，蔗糖-6-棕櫚酸酯Rf =1. 8 ；合并產(chǎn)物部分，重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-月桂酸酯，產(chǎn)品由HPLC 分析顯示蔗糖-6-月桂酸酯產(chǎn)率為97. m。
權(quán)利要求
1.一種固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成，其特征在于該合成方法采用固定化酶作催化劑、脂肪酸乙烯酯作?；w的酯化工藝a).將蔗糖溶解于二甲基亞砜和叔戊醇的混合溶劑，其中按體積比，二甲基亞砜叔戊醇=1:4-9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100-200r/min，至蔗糖完全溶解，恒溫20°C _60°C，加固定化米曲霉脂肪酶10-100mg/ml，恒溫振蕩后，加入分子篩干燥過夜的脂肪酸乙烯酯，其中按摩爾比計，蔗糖脂肪酸乙烯酯=1:2-10 ；最后加入與脂肪酶等量的4A分子篩10-100mg/ml，反應 0. 05-24h，記錄轉(zhuǎn)化率，所有液體溶劑均預先用4A分子篩干燥72h以上，蔗糖和脂肪酶干燥后儲存于變色硅膠干燥器中；b).反應結(jié)束后將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，用叔戊醇清洗，真空干燥備用，反應產(chǎn)物冷卻至室溫，叔戊醇減壓蒸餾，殘留的脂肪酸乙烯酯用正己烷提取，剩余部分與一體積水混合，蔗糖酯用二體積的體積比為1:1的環(huán)己烷/ 丁醇，有機相經(jīng)減壓蒸餾，濃縮經(jīng)柱色譜分離，洗脫液為體積比20:1-1:1的氯仿/甲醇，產(chǎn)物經(jīng)有機溶劑重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-脂肪酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成， 其特征在于所述的脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成， 其特征在于固定化米曲霉脂肪酶是將米曲霉脂肪酶固定在載體上的脂肪酶，載體為硅藻土、二氧化硅、聚丙烯酰胺凝膠或環(huán)氧乙烷-丙烯酸樹脂聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成， 其特征在于重結(jié)晶的有機溶劑為乙酸乙酯和丙酮中的一種，或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成， 其特征在于恒溫水浴振蕩器轉(zhuǎn)速100-200r/min，優(yōu)選100-150 r/min,以防載體崩解。
全文摘要
固定化米曲霉脂肪酶選擇性催化蔗糖-6-脂肪酸酯的合成，將蔗糖溶解于二甲基亞砜和叔戊醇的混合溶劑，恒溫20℃-60℃至蔗糖完全溶解，加固定化米曲霉脂肪酶恒溫振蕩后，再加入脂肪酸乙烯酯反應，記錄轉(zhuǎn)化率。反應結(jié)束后將催化劑脂肪酶和分子篩從混合物中過濾分離，清洗后真空干燥備用。反應產(chǎn)物冷卻至室溫，經(jīng)減壓蒸餾、有機相提取殘留反應物后，剩余部分與水混合，再用有機溶液提取蔗糖酯，有機相經(jīng)減壓蒸餾、濃縮、色譜分離，TLC監(jiān)測合并產(chǎn)物部分，重結(jié)晶處理得到蔗糖-6-脂肪酸酯。該方法是一種綠色環(huán)保、無污染、專一性強、高收率、反應條件溫和、分離提純簡單的固定化米曲霉脂肪酶催化制備蔗糖-6-脂肪酸酯的方法。
文檔編號C12P7/62GK102181494SQ20111006766
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者吳金山, 朱國廷, 沈彬 申請人:鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司