專利名稱：Ugt1a1基因擴(kuò)增用引物對、含有其的ugt1a1基因擴(kuò)增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增UGTlAl基因的引物對，含有該引物對的UGTlAl基因擴(kuò)增用試劑及其用途。
背景技術(shù)：
已知葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶UGT)是一種已知的藥物代謝酶， 是一種催化將葡糖醛酸結(jié)合到藥物、異物、作為內(nèi)源性物質(zhì)的膽紅素、留類激素、膽汁酸等上的反應(yīng)的酶。已報道了 UGT有被分類為UGTl家族和UGT2家族的多種同工酶。這些同工酶中，編碼屬于UGTl家族的UGTlAl的基因(UGT1A1基因)存在基因多態(tài)性，一般而言認(rèn)為這與抗癌劑鹽酸伊立替康(Irinotecan)的副作用的表現(xiàn)相關(guān)。具體而言，據(jù)報道，患者UGTlAl基因具有多態(tài)性時，通過UGT將具有高抗腫瘤活性的伊立替康水解物(SN-38) 解毒的能力下降，因而發(fā)生白血球減少和腹瀉等嚴(yán)重的副作用。與這種副作用相關(guān)的代表性的基因多態(tài)性已知有啟動子區(qū)域的多態(tài)性UGT1AN28，外顯子1的多態(tài)性UGT1A1*6 和UGT1AN27。尤其是據(jù)報道包括日本人在內(nèi)的亞洲人中，由于除了最重要的多態(tài)性 UGT1AN28，還同時具有多態(tài)性UGT1A1*6和UGT1AN27的至少一種，因而容易出現(xiàn)更強的副作用。另外，UGTlAl由于與生物體內(nèi)的由葡糖醛酸產(chǎn)生的結(jié)合膽紅素相關(guān)，因此其多態(tài)性也是吉伯綜合癥等體質(zhì)性黃疸的成因。因此，研究UGTlAl基因的多個多態(tài)性對于預(yù)測抗癌劑所產(chǎn)生的副作用的程度，預(yù)測副作用的發(fā)生十分重要。另一方面，作為在基因水平分析所有疾病的成因、個體間疾病易感性(容易患病性)、個體間藥效差異等的方法，現(xiàn)在廣泛使用點突變，即所謂單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測。作為點突變的一般的檢測方法，可以列舉(1)對于試樣的目標(biāo)DNA，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域，分析其全基因序列的直接測序(Direct Sequencing)法，(2)對于試樣的目標(biāo)DNA，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域，用根據(jù)前述檢測對象序列有無目標(biāo)突變而切斷作用不同的限制酶將其擴(kuò)增產(chǎn)物切斷，通過電泳進(jìn)行分型的RFLP分析，(3)使用目標(biāo)突變位于3’末端區(qū)域的引物進(jìn)行 PCR,通過擴(kuò)增的有無來判斷突變的ASP-PCR法等。但是，這些方法例如由于必須純化從試樣中提取的DNA、電泳、限制酶處理等，因此麻煩又費錢。而且，進(jìn)行PCR后，反應(yīng)容器需要開封一次，因此就存在前述擴(kuò)增產(chǎn)物混入下一個的反應(yīng)體系中，分析精確度降低的擔(dān)憂。而且，由于難以自動化，因此無法分析大量試樣。而且，就前述(3)的ASP-PCR法而言，也存在特異性低的問題。從這些問題出發(fā)，近年來，作為點突變的檢測方法，分析由目標(biāo)核酸與探針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm :melting temperature)的方法正得到實際的應(yīng)用。這種方法由于通過例如Tm分析或者前述雙鏈的融解曲線的分析來進(jìn)行，因此被稱為融解曲線分析。其就是以下這種方法。即，首先，使用與含有檢測目標(biāo)的點突變的檢測對象序列互補的探針， 使檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA與前述探針形成雜交體(雙鏈DNA)。然后，對該雜交產(chǎn)物實施加熱處理，通過吸光度等信號的變動來檢測伴隨溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后， 基于該檢測結(jié)果確定Tm值，由此判斷是否存在點突變。雜交產(chǎn)物的同源性高，則Tm值高， 同源性低，則Tm值低。因此，預(yù)先求出含有點突變的檢測對象序列和與之互補的探針的雜交產(chǎn)物的Tm值(評價基準(zhǔn)值)，再測定檢測試樣的目標(biāo)單鏈DNA和前述探針的Tm值(測定值)。如果前述測定值與評價基準(zhǔn)值程度相同，則可以判斷為匹配，即在目標(biāo)DNA中存在點突變，如果測定值比評價基準(zhǔn)值低，則可以評斷為不匹配，即在目標(biāo)DNA中不存在點突變。 而且，通過該方法可以實現(xiàn)基因分析的自動化。但是，對于這種利用Tm分析的檢測方法而言，存在著在PCR中必須要特異性且高效地擴(kuò)增含有檢測目標(biāo)部位的區(qū)域的問題。尤其是，由于UGT存在許多同工酶，編碼這些酶的序列又極為類似，因此就有這樣的擔(dān)憂，即在PCR中連UGTlAl之外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增。而且，這種連UGTlAl之外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增的情況，也成為例如 UGTlAl基因的特定多態(tài)性(UGT1AN28，UGT1A1*6或UGT1AN27)分析(非專利文獻(xiàn)1)中， 分析結(jié)果的可信度降低的原因。而且，這樣一來，由于分析1個樣本時伴隨過多勞動力，因此存在著實際上不能實現(xiàn)大量分析試樣的問題。非專利文獻(xiàn)PMID:11156391 Cancer Res. 2000 Dec 15 ；60 (24) :6921_6。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明以提供用于通過基因擴(kuò)增法特異性擴(kuò)增UGTlAl基因的目標(biāo)區(qū)域的引物對作為目的。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的引物對，其特征在于，其為用于通過基因擴(kuò)增法擴(kuò)增 UGTlAl基因的引物對，且含有選自以下引物對(1) (3)所組成的組中的至少一種。引物對(1)包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(Fl)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2120位的腺嘌呤堿基 (A)作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述腺嘌呤堿基(A)作為3’末端和與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中、以第2140位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 34個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一個(Rl)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第22 位的鳥嘌呤堿基 (G)作為第1個堿基朝著3’方向直至第17 27個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以與所述第22 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端
和與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2198位的胞嘧啶堿基(C) 作為第1個堿基朝著3’方向直至第22 39個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第2198位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端中的至少一個引物對(2)包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F2)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第沈22位的鳥嘌呤堿基 (G)作為第1個堿基朝著5’方向直至第15 27個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端(R2)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第沈87位的胞嘧啶堿基 (C)作為第1個堿基朝著3’方向直至第17 沈個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以與所述第2687位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端引物對(3)包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對(F3)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第1863位的胞嘧啶堿基 (C)作為第1個堿基朝著5’方向直至第17 31個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端(R3)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第19 位的胞嘧啶堿基 (C)作為第1個堿基朝著3’方向直至第16 20個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以與所述第1擬8位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端而且，本發(fā)明的基因擴(kuò)增用試劑，其特征在于，其為一種用于通過基因擴(kuò)增法擴(kuò)增 UGTlAl基因的試劑，含有前述本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，其為一種通過基因擴(kuò)增法制備 UGTlAl基因擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，含有下述(I)步驟。(I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，在反應(yīng)液中擴(kuò)增前述UGTlAl基因的步驟本發(fā)明的多態(tài)性分析方法，其特征在于，其為分析UGTlAl基因中的檢測對象部位的多態(tài)性的方法，包括以下步驟(i) (iv)。(i)通過本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法，在反應(yīng)液中擴(kuò)增UGTlAl基因中包含檢測對象部位的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備含有所述步驟(i)中的擴(kuò)增產(chǎn)物和能與所述檢測對象部位雜交的探針的反應(yīng)液的步驟(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的所述信號值的變動，決定所述檢測對象部位的多態(tài)性的步驟
如果使用本發(fā)明的引物對，可以在反應(yīng)液中特異性且高效率地擴(kuò)增UGTlAl基因中的、含有檢測目標(biāo)多態(tài)性(UGT1AN28，UGT1A1*6或UGT1AN27)發(fā)生的部位的目標(biāo)區(qū)域。 因此，與前述以往的方法不同，可以降低麻煩和成本。而且，這樣一來，由于可以特異性擴(kuò)增 UGTlAl基因中的、含有特定的多態(tài)性發(fā)生的檢測對象部位的區(qū)域，因此通過使用與含有檢測對象部位的檢測對象序列互補的探針，可以使用前述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm分析，對前述多態(tài)性進(jìn)行分型。而且，由于可以在一個反應(yīng)液中擴(kuò)增前述目標(biāo)區(qū)域以及實現(xiàn)多態(tài)性分型，因此可以實現(xiàn)操作自動化。進(jìn)而，如果使用本發(fā)明的引物對，即使是例如含有雜質(zhì)的試樣(例如，全血或口腔粘膜等)，由于可以省略前處理，因此可以更迅速且更簡便地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 而且，使用本發(fā)明的引物對，由于可以以比以往更好的擴(kuò)增效率進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此可以縮短擴(kuò)增反應(yīng)。因此，通過本發(fā)明的引物對、含有它們的試劑以及使用這些物質(zhì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備方法和多態(tài)性分析方法，可以迅速且簡便地分析UGTlAl基因的多態(tài)性，因此可以認(rèn)為其在醫(yī)療領(lǐng)域中非常有效。


圖1是表示本發(fā)明的實施例1中Tm分析的結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的前述實施例1中Tm分析的結(jié)果的圖。圖3是表示本發(fā)明的前述實施例1中Tm分析的結(jié)果的圖。圖4是表示本發(fā)明的實施例2中Tm分析的結(jié)果的圖。
具體實施例方式〈UGT1A1基因擴(kuò)增用引物對〉本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，如前所述，其特征在于其含有選自前述引物對(1) (3)所組成的組中的至少一種引物對。由于含有至少任意一種引物對，因此例如可以特異性擴(kuò)增UGTlAl基因中特定的目標(biāo)區(qū)域。本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，例如可以只含有前述引物對⑴ (3)中的任意一種，也可以含有任意兩種或引物對(1) C3)全部?？梢杂靡飳?1)特異性擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是UGTlAl基因中含有多態(tài)性UGT1A1*6發(fā)生的部位的區(qū)域，可以用引物對⑵ 特異性擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是UGTlAl基因中含有多態(tài)性UGT1A1*27發(fā)生的部位的區(qū)域，可以用引物對(3)特異性擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是UGTlAl基因中含有多態(tài)性UGT1A1M8發(fā)生的部位的區(qū)域，這將在后面敘述。如前所述，已知UGTlAl基因的這3種多態(tài)性均為對藥物代謝產(chǎn)生影響的多態(tài)性， 因此不僅要重視研究任意1種，還要重視研究任意2種或所有3種多態(tài)性。但是，在以往的方法中，存在著1個反應(yīng)體系中無法分析多個序列的問題。這被認(rèn)為是因為如前所述， 由于UGT存在很多同工酶，因此PCR中連UGTlAl之外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增。因此，為了研究UGTlAl基因的3種多態(tài)性(UGT1A1*28, UGT1A1*6或UGT1A1*27)中的2種或所有3種時，需要分別在各個反應(yīng)體系中分別擴(kuò)增含有多態(tài)性發(fā)生部位的區(qū)域，單獨分析獲得的產(chǎn)物。這樣一來，以往的方法難以做到僅將UGT基因的UGTlAl基因作為模板且同時在UGTlAl基因中只特異性擴(kuò)增分別含有前述多態(tài)性發(fā)生部位的2種或3種目標(biāo)區(qū)域。而且，這樣一來，由于即使分析1個樣品也伴隨過多勞動力，因此存在無法實現(xiàn)分析大量試樣的問題。與之相對，如果使用本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，則即使在含有前述引物對(1) (3)中的任意2種或所有3種時，也可以在同一反應(yīng)液中同時且特異性地擴(kuò)增各個目標(biāo)區(qū)域。因此，與前述的現(xiàn)有方法不同，可以減少麻煩和成本。而且，這樣一來，由于在同一反應(yīng)液中特異性擴(kuò)增2個或3個目標(biāo)區(qū)域，因此通過使用例如與各個目標(biāo)區(qū)域中的檢測對象序列互補的探針，使用前述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm分析，則可以分別對前述2種或3種多態(tài)性進(jìn)行分型。這樣一來，由于可以在同一反應(yīng)液中分析UGTlAl基因中的2種或3種多態(tài)性，因此本發(fā)明的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，例如在含有引物對(1) (3)任一種時當(dāng)然優(yōu)選，含有任意兩種或所有三種也優(yōu)選。使用這種UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，1個目標(biāo)區(qū)域自不必說，如果同時擴(kuò)增2個或3個目標(biāo)區(qū)域，則可以比以往更有效地進(jìn)行UGTlAl基因的多態(tài)性分析。而且，以下有時將正向引物稱為F引物，將反向引物稱為R引物。前述引物對(1)，如前所述，是包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對。(Fl)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2120位的腺嘌呤堿基 (A)作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述腺嘌呤堿基(A)作為3’末端和與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2140位的胞嘧啶堿基(C) 作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 34個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一個(Rl)與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第22 位的鳥嘌呤堿基 (G)作為第1個堿基朝著3’方向直至第17 27個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以與所述第22 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端和與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2198位的胞嘧啶堿基(C) 作為第1個堿基朝著3’方向直至第22 39個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第2198位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端中的至少一個序列號1所示的堿基序列是來源于人(Homo Sapiens)的UGTl家族的UGTlAl基因的全長序列，例如，登錄于NCBI登錄號No. AY603772。前述引物對(1)是用于擴(kuò)增序列號1的包含第2121位 2225位區(qū)域、第2141 位 2197位區(qū)域、第2121位 2197位區(qū)域或者第2141位 2225位區(qū)域中的任意一個區(qū)域的DNA鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)的第2160位的堿基(序列號1中第2160 位的堿基)存在對UGTlAl的功能產(chǎn)生影響的點突變Ol60G，2160A)，這種多態(tài)性就是前述的UGT1A1*6。本發(fā)明中，該部位的多態(tài)性，在純合子時，可以用2160G/G、2160A/A表示，在為雜合子時，可以用2160G/A來表示。以下，也將該引物對(1)稱為“UGT1A1*6用引物對”。 而且，在只分析UGT1A1*6的多態(tài)性時，可以只使用UGT1A1*6用引物對。在本發(fā)明中，引物對(1)的Fl引物和Rl引物，只要決定DNA聚合酶的擴(kuò)增起始點的3’末端堿基滿足前述條件即可。這樣一來，通過固定各引物的3’末端的堿基，可以充分防止引物對(1)與例如類似的其它同工酶的基因(例如，UGT1A3基因，UGT1A4基因等)結(jié)合。這樣一來，由于Fl引物和Rl引物其3’末端的堿基被固定，各引物的長度自身沒有特別的限制，可以適當(dāng)調(diào)整到一般長度。作為引物長度的其中一例，例如在13 50mer 的范圍內(nèi)，優(yōu)選14 45mer，更優(yōu)選15 40mer。作為具體的一例，前述Fl引物優(yōu)選如下 與含有序列號1的堿基序列中的、以第2120位的腺嘌呤堿基(A)作為第1個堿基，朝著5’ 方向直至第18 22個堿基(優(yōu)選第19 22個，更優(yōu)選第19 21個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，或者與序列號1的堿基序列中的、以第2140位的胞嘧啶堿基(C) 作為第1個堿基，朝著5’方向直至第18 34個堿基(優(yōu)選第21 33個堿基，更優(yōu)選第 M 31個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸。而且，前述Rl引物優(yōu)選如下與序列號1的堿基序列中的、以第22 位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1個堿基，朝著3’方向直至第17 27個堿基(優(yōu)選第19 沈個堿基，更優(yōu)選第19 23個堿基)的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸；或者與序列號1的堿基序列中的、以第2198位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基朝著3’方向直至第22 39個堿基(優(yōu)選第23 36個堿基，更優(yōu)選第25 34個堿基)的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸。而且，由于Fl引物和Rl引物的3’末端分別被固定，由引物延伸的區(qū)域是例如，如前所述序列號1中第2121位 第2225位的區(qū)域，第 2141位 第2197位的區(qū)域，第2121位 第2197位區(qū)域，或第2141位 第2225位的區(qū)域中的任意一個區(qū)域，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的總長根據(jù)所使用的引物的長度而變化。而且，Rl引物也可以是不與序列號1所示的堿基序列完全互補的寡核苷酸，F(xiàn)l引物也可以是不與前述堿基序列的互補鏈完全互補的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端堿基以外的部分中，可以與完全互補的寡核苷酸有1 5個堿基不同。以下，列舉Fl引物和Rl引物的具體例子，本發(fā)明不限于此。而且，這些Fl引物和 Rl引物的組合沒有任何限制，這其中，特別優(yōu)選包括含有序列號4或序列號81的寡核苷酸的F1’引物、和含有序列號13或序列號91的寡核苷酸的R1’引物的引物對(1’)。而且，下表中的“Tm(°C ) ”是下表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(°C )，是用MELTCALC軟件(http://www.meltcalc. com/)，將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0. 2μΜ，鈉當(dāng)量(Na eq. ) 50mM 計算的值(以下相同)。前述Tm值，可以用例如以往公知的MELTCALC軟件(http://WWW. meltcalc. com/)等計算，而且，還可以用臨近法(Nearest Neighbor Method)測定(以下相同)。表 權(quán)利要求
1.一種探針，其特征在于，其為用于檢測UGTlAl基因的多態(tài)性的探針，其由下述(1)的寡核苷酸構(gòu)成，與序列號1中的、以第2173位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基，朝著5’方向直至第 17 25個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶堿基作為 3’末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，所述寡核苷酸(1)為序列號51 58中的任意一種寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，所述寡核苷酸(1)為序列號55的寡核苷酸和序列號 56的寡核苷酸中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
5.一種試劑，其特征在于，其為用于檢測UGTlAl基因的多態(tài)性的試劑，含有權(quán)利要求1 所述的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其還含有由下述(2-1)的寡核苷酸構(gòu)成的探針、由下述 (2-2)的寡核苷酸構(gòu)成的探針和由下述(3)的寡核苷酸構(gòu)成的探針組成的組中的至少一種探針，(2-1)與序列號1中的、以第沈45位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基，朝著5’方向直至第15 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶堿基作為3’末端，禾口(2-2)與序列號1中的、以第沈25位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1個堿基，朝著3’方向直至第17 22個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤堿基互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一種，(3)與序列號1中的、以第1892位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基，朝著3’方向直至第25 31個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶堿基作為3’末端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，所述的寡核苷酸為序列號59 66中的任意一種寡核苷酸，所述0-2)的寡核苷酸為序列號100 105中的任意一種寡核苷酸，所述(3) 的寡核苷酸為序列號6773中的任意一種寡核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，所述的寡核苷酸為由序列號62的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，所述0-2)的寡核苷酸為序列號102的寡核苷酸，所述C3)的寡核苷酸為序列號69的寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，所述探針為熒光標(biāo)記探針。
10.一種多態(tài)性分析方法，其特征在于，其為分析UGTlAl基因中的檢測對象部位的多態(tài)性的方法，包括以下步驟(i) (iv)(i)以試樣中的核酸為模板，在反應(yīng)液中擴(kuò)增UGTlAl基因中包含檢測對象部位的區(qū)域的步驟；( )準(zhǔn)備含有所述步驟⑴中的擴(kuò)增產(chǎn)物和權(quán)利要求5所述的試劑的反應(yīng)液的步驟;(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述試劑中的探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的步驟；(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的所述信號值的變動，決定所述檢測對象部位的多態(tài)性的步馬聚ο
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，在所述(i)步驟中，在擴(kuò)增反應(yīng)之前，向所述反應(yīng)液中添加權(quán)利要求5所述的試劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，所述試樣為生物體試樣。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性解析方法，所述生物體試樣為全血。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，所述試劑還含有由下述的寡核苷酸構(gòu)成的探針、由下述0-2)的寡核苷酸構(gòu)成的探針和由下述(3)的寡核苷酸構(gòu)成的探針組成的組中的至少一種探針，(2-1)與序列號1中的、以第沈45位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基，朝著5’方向直至第15 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶堿基作為3’末端， 禾口(2-2)與序列號1中的、以第沈25位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1個堿基，朝著3’方向直至第17 22個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤堿基互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一種，(3)與序列號1中的、以第1892位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基，朝著3’方向直至第25 31個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶堿基作為3’末端。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多態(tài)性解析方法，在所述(i)步驟中，使用下述引物對(1) 在反應(yīng)液中進(jìn)行所述UGTlAl的擴(kuò)增，引物對⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對，(Fl):與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2120位的腺嘌呤堿基㈧ 作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以所述腺嘌呤堿基(A)作為3’末端， 禾口與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中、以第2140位的胞嘧啶堿基(C)作為第 1個堿基朝著5’方向直至第18 34個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一種寡核苷酸；(Rl):與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第22 位的鳥嘌呤堿基(G) 作為第1個堿基朝著3’方向直至第17 27個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第22 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端， 禾口與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2198位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基朝著3’方向直至第22 39個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第2198位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端中的至少一種寡核苷酸。
16.一種UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，其特征在于，該引物對為用于通過基因擴(kuò)增法擴(kuò)增UGTlAl基因的引物對，含有下述引物對(1)引物對⑴包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個引物對，(Fl):與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2120位的腺嘌呤堿基㈧ 作為第1個堿基朝著5’方向直至第18 22個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸， 該寡核苷酸以所述腺嘌呤堿基(A)作為3’末端， 禾口與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中、以第2140位的胞嘧啶堿基(C)作為第 1個堿基朝著5’方向直至第18 34個堿基的區(qū)域序列相同的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端中的至少一種寡核苷酸；(Rl):與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第22 位的鳥嘌呤堿基(G) 作為第1個堿基朝著3’方向直至第17 27個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第22 位的鳥嘌呤堿基(G)互補的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端， 禾口與含有序列號1的堿基序列的UGTlAl基因中的、以第2198位的胞嘧啶堿基(C)作為第1個堿基朝著3’方向直至第22 39個堿基的區(qū)域互補的至少一種寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第2198位的胞嘧啶堿基(C)互補的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端中的至少一種寡核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的UGTlAl基因擴(kuò)增用引物對，其特征在于，所述引物對(1) 為下述引物對(1，)，弓丨物對(1’ )包含由下述(Fl’ )的寡核苷酸構(gòu)成的正向引物和由下述(Rl’ )的寡核苷酸構(gòu)成的反向引物的一個引物對，(Fl’ )由序列號4的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號81的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸，(R1’)由序列號13的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸和由序列號91的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
提供用于通過基因擴(kuò)增法擴(kuò)增UGT1A1基因中含有檢測目標(biāo)部位的目標(biāo)區(qū)域的引物對，該引物對可以特異性擴(kuò)增前述區(qū)域。使用3對引物對，各個引物對分別包含含有序列號4或序列號81、序列號21和序列號42的堿基序列的正向引物、和含有序列號13或序列號91、序列號29和序列號48的堿基序列的反向引物。通過使用這種引物對，可以在同一反應(yīng)液中，同時擴(kuò)增UGT1A1基因的分別含有3種多態(tài)性(UGT1A1*6，UGT1A1*27，UGT1A1*28)發(fā)生部分的3個目標(biāo)區(qū)域。
文檔編號C12N15/11GK102168140SQ20111004688
公開日2011年8月31日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者平井光春, 間島智史 申請人:愛科來株式會社