專利名稱：一種hbv基因分型的pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種HBV基因分型的PCR熔解曲線檢測方法。
背景技術：
乙型肝炎病毒(H印atitis B virus, HBV)主要通過宿主免疫機制引起肝臟損害， 機體免疫系統(tǒng)識別病毒抗原并攻擊受感染的肝細胞引起炎癥，這個過程受包括宿主與病毒 的多個因素影響。病毒基因異質(zhì)性影響著抗原的表達，在此過程中也扮演著重要的角色。不 同的毒株出現(xiàn)某些變異的頻率不同，不同毒株對機體免疫清除抵抗力不同以及其它的因素 均可能導致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜。通常將HBV分為A H八種基因型，分型依據(jù)為全基因序列異質(zhì)性彡8 %，或S 基因序列異質(zhì)性彡4%。HBV基因型呈一定地理區(qū)域分布。我國北方以C型為主，南方以B 型為主，D型多見于少數(shù)民族地區(qū)，如西藏、新疆，不同基因型致病性不同。有研究證明HBV 的基因型不僅影響乙型肝炎患者病情進展，而且與抗病毒療效和臨床預后有一定的相關關 系。因此，HBV基因分型研究對進一步明確乙型肝炎發(fā)病機制、尋找治療對策、實現(xiàn)流行病 學控制、以及對抗病毒治療反應和病情預后評估均有重要意義?，F(xiàn)在已經(jīng)有一些HBV基因 分型的方法，其中測序法提供的信息全面可靠，但該方法繁瑣、費時、實驗條件和要求高，不 適宜廣泛開展。而其他方法的結(jié)果均不如測序法可靠，目前仍然未被標準化和商業(yè)化，如 PCR-RFLP操作繁瑣，且酶切位點易受基因變異的影響影響結(jié)果判斷；PCR微板核酸分子雜 交-ELISA法操作技術簡便，適用于一般實驗室測定，但無法對血清HBsAg陰性的HBV感染 進行基因分型；型特異性引物PCR操作相對簡單、結(jié)果準確，但仍需進行兩輪PCR，產(chǎn)物電泳 的步驟，存在產(chǎn)物污染的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種HBV基因分型的PCR檢測方法，該方法能夠簡便、快 速、準確地鑒定HBV基因型。本發(fā)明的技術方案如下
根據(jù)乙型肝炎病毒基因型的全基因組序列設計引物；在上述引物的存在下，在熒光 PCR儀中，對從血清樣品提取的DNA進行PCR擴增，利用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn) 物的Tm值來判斷基因型，實現(xiàn)乙型肝炎病毒的基因分型。其中所述乙型肝炎病毒基因型為乙型肝炎病毒基因型B，引物序列如下 上游引物 BF :AGTTAATCATTACTTCCAGACGC
下游引物 BR CTGTAGATCTTGTTCCCAAGAAT
所述乙型肝炎病毒基因型為乙型肝炎病毒基因型C，引物序列如下 上游引物 CF TGTTCCGACTACTGCCTCAC 下游引物 CR GGACAAATTGGAGGACAAGAG 上述引物的設計步驟為根據(jù)文獻(吳光華，丁惠國，曾長青.公共核算數(shù)據(jù)庫乙肝病毒全基因組序列概況和中國HBV參照序列的建立.自然科學進展，2008，18:121-129.) 報道的中國HBV B、C型的全基因組序列，按照引物的設計原則，利用I^rimer Premier 5.0 軟件自行設計B、C型特異性引物，之后到Pubmed數(shù)據(jù)庫上進行blast，證實引物的目的擴 增片段為HBV的基因序列；根據(jù)擴增片段的Tm值來判斷基因型。所述PCR擴增的條件為采用50 μ L的反應體系，2倍濃縮的STOR Premix Ex Taq 25 μ L，引物對 10 μ M/L 各 1 μ L，50 倍濃縮的 ROX Reference Dye 1 μ L,HBV DNA 模板 4 μ L， dH20 16yL ；于ABI7000熒光PCR儀進行反應并檢測，PCR反應條件95°C 30s，然后按95°C 5s, 60°C 31s，進行40個循環(huán)，熒光檢測在60°C。熒光通道檢測選擇STOR。針對我國HBV基因型主要以B型和C型為主的特點，本發(fā)明只設計了 B、C型的引 物，建立了 PCR熔解曲線檢測HBV B、C及B/C混合基因型的方法。本方法采用STOR Green I的熔解曲線來檢測HBV基因型，SYBR Green I是一種不對稱腈類熒光素，能非特異性地 嵌合于DNA雙螺旋結(jié)構中的小溝內(nèi)，一般不與單鏈DNA結(jié)合，結(jié)合狀態(tài)的熒光強度較之游離 狀態(tài)的熒光增加數(shù)千倍。HBV雙鏈DNA分子因與STOR Green I結(jié)合而被識別，當兩條DNA 分子復性結(jié)合時熒光最強，隨溫度上升熒光強度降低并出現(xiàn)一較恒定的坡度，當溫度達到 Tm值時熒光強度急劇下降。經(jīng)過軟件分析可得到熔解曲線圖，其波峰所在的溫度代表雙鏈 DNA分子的Tm值。Tm值的大小取決于DNA分子的長度及其序列中G/C含量。本發(fā)明設計 的兩對型特異性引物擴增的DNA分子片段長度不同，其中B型130bp，C型27!3bp，具有不同 的Tm值，因此可根據(jù)PCR產(chǎn)物的Tm值來判斷基因型。PCR熔解曲線法在一個PCR反應體系 中同時加有兩對引物，方法簡單易行，耗時較少，每次可同時檢測96個標本，耗時2小時，由 于整個擴增和檢測過程均為閉管操作，不需開蓋吸取擴增產(chǎn)物進行電泳，避免了 PCR擴增 產(chǎn)物的污染，減少了假陽性結(jié)果。某一型的引物只與相同型的模板結(jié)合才發(fā)生PCR擴增反 應，從而保證了檢測的特異性，同時，本發(fā)明擴增片段短，采用較高的退火溫度，也可以保證 擴增的特異性。反應體系經(jīng)熒光定量PCR儀擴增后即可通過Tm值簡便、快速地鑒別HBV基 因型。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明建立的PCR熔解曲線法操作簡便，與商品化的基因分型試劑盒的檢測結(jié)果相比 有較高的符合率，可用于臨床上HBV基因型的檢測。本發(fā)明在利用PCR技術的基礎上，建立了一種依據(jù)Tm值判斷HBV基因型的PCR熔 解曲線法，能簡便快速、準確地鑒定HBV基因型。


圖1為PCR熔解曲線法檢測HBV基因型B、C的典型曲線圖，其中橫坐標為溫度 (0C),縱坐標為熒光值的二次導數(shù)。圖2為PCR熔解曲線法檢測HBV基因型B/C混合型的典型曲線圖，其中橫坐標為 溫度rc )，縱坐標為熒光值的二次導數(shù)。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的具體實施例子，進一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實施例1一、對象
2009年福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院及門診的186例HBV感染患者，男IM例，平 均年齡35. 21歲，女69例，平均年齡35. 71歲，其血清熒光定量PCR檢測均為HBV DNA陽性 (IO3 IO8拷貝/ml)，保存于-80°C。所有患者均排除了甲、丙和戊型肝炎病毒感染和其他 導致肝臟病變的疾病，且診斷符合2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲學分會(西安)修訂的 診斷標準。二、方法
1.主要的實驗儀器與試劑ABI7000熒光定量PCR儀(美國)，病毒基因組DNA提取試 劑盒(購自上海捷瑞生物工程有限公司)，STOR Premix Ex Taq (購自大連寶生物工程 有限公司)，乙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試劑盒(購自上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限 公司)，其它化學試劑均為國產(chǎn)化學純。2.引物設計根據(jù)文獻(吳光華，丁惠國，曾長青.公共核算數(shù)據(jù)庫乙肝病毒全 基因組序列概況和中國HBV參照序列的建立.自然科學進展，2008, 18:121-129.)提供的 B、C型的全基因組序列，共設計四條引物，由大連寶生物工程有限公司合成，具體情況見表 1。表1本發(fā)明的PCR熔解曲線法所用引物
權利要求
1.一種HBV基因分型的PCR檢測方法，其特征在于所述方法的步驟為根據(jù)乙型肝炎 病毒基因型的全基因組序列設計引物；在上述引物的存在下，在熒光PCR儀中，對從血清樣 品提取的DNA進行PCR擴增，利用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物的Tm值來判斷基 因型，實現(xiàn)乙型肝炎病毒的基因分型。
2.根據(jù)權利要求1所述的HBV基因分型的PCR檢測方法，其特征在于所述乙型肝炎 病毒基因型為乙型肝炎病毒基因型B，引物序列如下上游引物 BF :AGTTAATCATTACTTCCAGACGC下游引物 BR :CTGTAGATCTTGTTCCCAAGAAT。
3.根據(jù)權利要求1所述的HBV基因分型的PCR檢測方法，其特征在于所述乙型肝炎 病毒基因型為乙型肝炎病毒基因型C，引物序列如下上游引物 CF TGTTCCGACTACTGCCTCAC下游引物 CR GGACAAATTGGAGGACAAGAG
4.根據(jù)權利要求1所述的HBV基因分型的PCR檢測方法，其特征在于所述PCR擴增的 條件為采用50 μ L的反應體系，2倍濃縮的STOR Premix Ex Taq 25 μ L，引物對10 μ M/L各 1 μ L，50 倍濃縮的 ROX Reference Dye 1 μ L, HBV DNA 模板 4 μ L，dH20 16 μ L ；于 ΑΒΙ7000 熒光PCR儀進行反應并檢測，PCR反應條件95°C 30s，然后按95°C 5s, 60°C 31s，進行40 個循環(huán)，熒光檢測在60°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HBV基因分型的PCR檢測方法。該方法根據(jù)乙型肝炎病毒基因型的全基因組序列設計引物；在上述引物的存在下，在熒光PCR儀中，對從血清樣品提取的DNA進行PCR擴增，利用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物的Tm值來判斷基因型，實現(xiàn)乙型肝炎病毒的基因分型。本發(fā)明建立的PCR熔解曲線法操作簡便，與商品化的基因分型試劑盒的檢測結(jié)果相比有較高的符合率，可用于臨床上HBV基因型的檢測。本發(fā)明在利用PCR技術的基礎上，建立了一種依據(jù)Tm值判斷HBV基因型的PCR熔解曲線法，能簡便快速、準確地鑒定HBV基因型。
文檔編號C12Q1/70GK102140537SQ20111002410
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月19日 優(yōu)先權日2011年1月19日
發(fā)明者商紅艷, 歐啟水, 程祖建 申請人:福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院