專利名稱：血細(xì)胞重編程產(chǎn)生多潛能干細(xì)胞和多功能干細(xì)胞的制作方法
血細(xì)胞重編程產(chǎn)生多潛能干細(xì)胞和多功能干細(xì)胞發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，更具體地，涉及將血細(xì)胞重編程為多潛能(pluripotent)和多功能(multipotent)干細(xì)胞。背景信息近年來衍生出了源自患者體細(xì)胞的人類的誘導(dǎo)多潛能干(iPS)細(xì)胞，其有望產(chǎn)生患者和疾病特異性的干細(xì)胞系，用于開發(fā)新的細(xì)胞療法和建立疾病模型。這些人類iPS細(xì)胞展示出與人類胚胎干(hES)細(xì)胞相似的特征，包括在培養(yǎng)基中無限制擴(kuò)增。大部分公布的方案使用載體遞送多種編碼轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因，例如0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC，用于重編程貼壁細(xì)胞，例如皮膚和毛發(fā)的成纖維細(xì)胞和角蛋白細(xì)胞。
非常期望對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行重編程，因其易于獲得，且較少暴露于環(huán)境的誘變劑中。例如，可使用在多個(gè)細(xì)胞庫中收集和貯存的臍帶血(CB)細(xì)胞，作為自體同源或異源的但組織相容的iPS細(xì)胞系的來源。更關(guān)鍵的是，如果希望產(chǎn)生的iPS細(xì)胞含有的體細(xì)胞突變僅限于血細(xì)胞且存在于獲得性血液疾病中，從而以研究這些疾病的機(jī)制，那么重編程血細(xì)胞的能力就至關(guān)重要。之前的研究證明，分化的小鼠B細(xì)胞可以重編程為iPS細(xì)胞，這主要是通過使用轉(zhuǎn)基因(重編程就緒)小鼠完成，其帶有在一定條件下有活性的四種重編程轉(zhuǎn)基因。更近地，由單個(gè)同種造血干細(xì)胞在小鼠中重建了造血作用，用從這樣的小鼠中得到的骨髓祖細(xì)胞衍生出了小鼠iPS細(xì)胞系，這進(jìn)一步證明了小鼠造血細(xì)胞可以重編程為具有多潛能性。此前一直沒有報(bào)道過出生后的人類血細(xì)胞衍生為iPS細(xì)胞，直到最近，報(bào)道稱粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員的健康人外周血(PB)CD34+細(xì)胞可以被重編程為iPS細(xì)胞。但是，并不清楚通過每天的G-CSF治療能否影響重編程過程，或由血細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞的性質(zhì)。因此，仍然需要由體細(xì)胞，特別是血細(xì)胞或臍帶血細(xì)胞，有效地生成誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。發(fā)明概述本發(fā)明是基于臍帶血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞可以重編程為早期干細(xì)胞的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了來源于對(duì)主體的CB和成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞的重編程，且無需任何預(yù)處理。提供了重編程主體血細(xì)胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和產(chǎn)生主體特異性分化細(xì)胞的方法。另外，本發(fā)明提供的方法可用于識(shí)別試劑，所述試劑能改變主體特異性的分化細(xì)胞的功能，以及改變由血細(xì)胞重編程獲得的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞的功能。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生多潛能或多功能干細(xì)胞的方法。所述方法包括向培養(yǎng)基中的血細(xì)胞引入含有至少一種多潛能因子的非病毒載體，從而將血細(xì)胞重編程為多潛能或多功能干細(xì)胞。在一方面，載體包括多個(gè)多潛能基因。在另一方面，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括向培養(yǎng)基中加入至少一種皮質(zhì)類固醇。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇為地塞米松。在另一方面，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括向培養(yǎng)基中加入至少一種細(xì)胞因子。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子選自下組睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在另一方面，所述血細(xì)胞為臍帶血(CB)細(xì)胞、成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+細(xì)胞、或成人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在另一方面，所述主體為哺乳動(dòng)物。在另一方面，所述主體為人類。在另一方面，所述多潛能或多功能干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。在另一方面，所述主體有骨髓增殖性疾病(MPD)。在另一方面，所述至少一種多功能因子包括至少三種因子，所述因子選自下組S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog, LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB, EBF1、C/EBPa、C/EBP β 、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在另一方面，所述至少一種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c-MYC,或其活性片段。在另一方面，所述至少一種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。在一方面，所述非病毒載體為游離型載體。在另一方面，所述方法進(jìn)一步包括向血細(xì)胞中引入第二個(gè)游離型載體。在另一方面，第二個(gè)游離型載體表達(dá)SV40T抗原(Tg)。在另一方面，第一個(gè)游離型載體包括多個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性(operatively)連接以表達(dá)所述因子。在另一方面，所述游離型載體為oriP/EBNAl質(zhì)粒。在另一方面，PBMC來自鐮狀細(xì)胞性貧血患者。在另一方面，PBMC包括S⑶B003細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種確定對(duì)主體細(xì)胞有療效的試劑的方法。所述方法包括使測(cè)試試劑接觸上述任意方法生成的多潛能或多功能干細(xì)胞，并檢測(cè)測(cè)試試劑存在與不存在時(shí)功能的變化。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種生成分化細(xì)胞的方法，所述方法包括誘導(dǎo)上述任意方法生成的多潛能或多功能干細(xì)胞的分化，從而獲得分化細(xì)胞群。在一方面，所述分化細(xì)胞包括血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)締組織、心肌細(xì)胞、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、成腎細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、心臟細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞或上皮細(xì)胞。在另一方面，所述分化細(xì)胞包括胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及上述任意方法產(chǎn)生的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞的富集細(xì)胞群。在一方面，所述分離的多潛能或多功能干細(xì)胞表達(dá)一種選自下組的細(xì)胞表面標(biāo)記SSEAl、SSEA3、SSEA4、TRA-l-60、以及 TRA-1-81。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種治療需要更換或更新細(xì)胞的疾病。所述方法包括給予主體有效量的由上述任意方法生成的多潛能或多功能干細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及重編程的非病毒游離型載體。在一方面，所述非病毒游離型載體包括至少五個(gè)多潛能基因，其與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性連接，以表達(dá)至少五種多潛能因子。在另一方面，所述載體為oriP/EBNAl質(zhì)粒。附圖簡述圖I顯示了由CB衍生的未分化iPS細(xì)胞(U)和在體內(nèi)分化之后得到的畸胎瘤細(xì)胞⑴中，未分化(0CT4和NANOG)和分化標(biāo)記物的基因表達(dá)?？梢杂肦T-PCR分析測(cè)定甲胎蛋白(AFP，內(nèi)胚層)、CD34(中胚層)和PAX6(外胚層)和管家基因GAPDH的表達(dá)。圖2顯示了由PV iPS細(xì)胞生成的造血祖細(xì)胞的紅系分化增加。為了評(píng)估紅系分化潛能，在液體培養(yǎng)基(圖2A和2C)或含有血清和甲基纖維素的培養(yǎng)基(圖2B和2D)中鋪板純化的⑶34+⑶45+細(xì)胞，所述細(xì)胞來源于正常對(duì)照(NC)，或經(jīng)胚狀體介導(dǎo)的造血分化之后的PV iPS細(xì)胞。圖2A顯示了來源于NC(13.5 ±3.6倍)或PV iPS細(xì)胞(27·6±3·3倍)的純化的⑶34+⑶45+細(xì)胞在液體中培養(yǎng)7天之后的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。圖2Β顯示了⑶34+⑶45+細(xì)胞在甲基纖維素中培養(yǎng)14天之后的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，NC為69. 5±24. 7倍，PV iPS細(xì)胞為127±28. 3倍。圖2A和2B的數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(η = 2)表示。圖2C顯示了用FACS分析的培養(yǎng)7天的細(xì)胞的紅系表型(⑶235a+⑶45-)。根據(jù)分選(gating)和與背景染色的比較，將這種細(xì)胞群的百分比在左上象限顯示。圖2D顯示了從含有甲基纖維素的培養(yǎng)基中獲取的培養(yǎng)14天的細(xì)胞的FACS分析。圖3顯示人類iPS生成的造血祖細(xì)胞展示出獨(dú)特的基因表達(dá)類型，其與PV患者和正常對(duì)照的原代CD34+細(xì)胞相似。圖3A顯示了從作為正常對(duì)照(NC)的健康供體或PV患者(MPD183)的原代⑶34+細(xì)胞中分離的總RNA，所述PV-iPS細(xì)胞系衍生自該P(yáng)V患者。在逆轉(zhuǎn)錄RNA之后，可以通過實(shí)時(shí)定量PCR，分析細(xì)胞核因子I-B (NFI-B)、血紅蛋白- Y (HBG)和血紅蛋白-β (HBB)以及β-actin(作為對(duì)照)的基因表達(dá)。繪制了標(biāo)準(zhǔn)化的水平(相對(duì)于β-actin)。圖3Β顯示了，用從PV iPS(iMPD183)產(chǎn)生的、以及從正常成人CD34+細(xì)胞衍生的正常對(duì)照(NC) iPS細(xì)胞所產(chǎn)生的純化的⑶34+⑶45+細(xì)胞，進(jìn)行相同的分析。數(shù)據(jù)用平均值土 SD(n = 2)表示。圖4顯示了用于重編程人類新生兒成纖維細(xì)胞的示例性EBNAl/OriP游離型載體。圖 4A顯示了載體OSNL(0ct4+Sox2+Nanog+Lin28) ,OSTK(0ct4+Sox2+SV40 大 T 抗原 +Klf4)、以及0SMK(0ct4+Sox2+c-Myc+Klf4)的構(gòu)架。圖4B顯示了使用三個(gè)質(zhì)粒的重編程實(shí)施例。圖5顯示了通過改善的EBNAl/oriP質(zhì)粒重編程人類血⑶34+細(xì)胞的示例性圖解。通常，14天之后，細(xì)胞可以被抗TRA-1-60+抗體染色。然后可以檢查細(xì)胞的核型、多潛能性、和/或游離體狀態(tài)。圖6顯示了在重編程的和擴(kuò)增的iPS細(xì)胞中，載體DNA逐漸減少。圖6A表明，未檢測(cè)到載體DNA可能是因?yàn)樵诒碛^遺傳學(xué)上ENBAl的表達(dá)被沉默，而ENBAl的表達(dá)是游離型DNA復(fù)制所必需的。圖6B顯示了 EBNAl載體檢測(cè)的PCR結(jié)果。圖7顯示了重編程CB MNC獲得的多種克隆，其表明較新的血液更好。圖8顯示了 11個(gè)人類ESC系、17個(gè)iPSC系及其親代體細(xì)胞的全基因組表觀遺傳學(xué)特征。使用InfiniumMethylation27平臺(tái)，分析在IMR90胚胎成纖維細(xì)胞、3個(gè)成人骨髓(BM)間質(zhì)細(xì)胞(MSC和BASC)、分離自成人BM、外周血(PB)和臍帶血(CB)的CD34+細(xì)胞的2個(gè)樣品中，27，578個(gè)基因座的DNA甲基化。也使用了這些體細(xì)胞衍生的17個(gè)iPSC系和11個(gè)hESC樣品。圖8A顯示了使用皮爾森相關(guān)系數(shù)產(chǎn)生的樹狀圖。樹狀圖表明iPSC作為一個(gè)組，其與ESC非常相似，且與其親代體細(xì)胞有區(qū)別，并且與MSC/胚胎成纖維細(xì)胞相比，人類CD34+細(xì)胞與ESC/iPSC組更相似。圖SB顯示，K均值集群分析顯示出相似的結(jié)論。為了簡化展示，發(fā)明人省略了iPSC，因?yàn)樗鼈兣cESC非常相似。分析了出生后體細(xì)胞和11個(gè)ESC系中各種基因座(在CpG島內(nèi)或外部)的啟動(dòng)子的DNA甲基化(從O到I)水平。出現(xiàn)四個(gè)不同的集群1)兩者均高；2)體細(xì)胞中高，但ESC中低；3)體細(xì)胞中低，但ESC中高；和4)兩者細(xì)胞類型中均較低。插入表格中列出了 3個(gè)MSC或CD34+細(xì)胞中每個(gè)常見集群中的基因座數(shù)。集群#2和#3由甲基化與ESC不同的基因座組成。結(jié)合兩個(gè)集群，MSC中15. 4%的基因座與ESC不同，⑶34+細(xì)胞中只有10. 8%基因座與ESC不同。圖8C顯示了 ploycomb抑制性復(fù)合物靶基因中2586個(gè)基因座的多維量表分析。沿著前兩維的繪圖揭示了 ESC(和iPSC，繪圖中省略)相互之間難以區(qū)別。相似地，MSC和⑶34+細(xì)胞分別聚集。值得注意的是，在這方面，⑶34+細(xì)胞群集與ESC更近。圖8D顯示了 Thomson/Yu的6#組合(表達(dá)7個(gè)基因的3個(gè)質(zhì)粒)、或EBNAl/OriP組合、pEB-C5(C5)+pEB-Tg(Tg)的重編程效率(表示為用第14天時(shí)每IO6個(gè)核轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRA-l-60+、ESC樣集落數(shù))。pEB-GFP (GFP)用作對(duì)照。圖8E顯示了 TRA-1-60+集落數(shù)占總集落數(shù)的百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-SEM(η = 2)。圖8F和SG顯示了通過將C5與Tg、pEB-p53shRNA (p53shRNA)或 pEB_NAN0G (NANOG)聯(lián)用，或僅用 C5，重編程不同 CD34+ 細(xì)胞樣品的效率。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-SEM(η = 3)。 圖9顯示了通過單個(gè)ENBA-1/OriP質(zhì)粒從成人外周血(PB)和骨髓(BM)產(chǎn)生的人類iPSC。圖9A和9B顯示了從PB CD34+細(xì)胞(圖9A)或BM CD34+細(xì)胞(圖9B)擴(kuò)增的每IO6個(gè)核轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TRA-1-60+集落數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-SEM，η = 6。

圖10顯示了通過單個(gè)ENBA-1/OriP質(zhì)粒從成人外周血(PB)和臍帶血(CB)單核細(xì)胞(MNC)產(chǎn)生的人類iPSC。圖10A顯示了從CB MNC擴(kuò)增的2X IO6個(gè)核轉(zhuǎn)染細(xì)胞重編程之后第14天的TRA-1-60+集落數(shù)。將兩種不同的CB MNC(I. 5個(gè)月之前冷凍(GB/CB)和13. 5年之前(AC/CB)冷凍)培養(yǎng)8天。用l-3個(gè)ENBAl/0riP質(zhì)粒，按指示將2X106個(gè)培養(yǎng)并準(zhǔn)備的細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。C5 pEB-C5 ；Tg pEB-Tg ；Combo#6 Thomson/Yu 組合 #6 (3 個(gè)質(zhì)粒)。再培養(yǎng)2天之后，將細(xì)胞置于用MEF包被的12孔板中的6個(gè)孔中，并在丁酸鈉(NaB)存在和不存在的情況下用ESC培養(yǎng)基培養(yǎng)(從第3天開始)。在第14天對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行TPvA-1-60細(xì)胞表面表達(dá)的染色，計(jì)數(shù)TRA-1-60+(和TRA-60-)集落。TRA-1-60+集落數(shù)表示為平均值+/-SEM，η = 6。圖10Β顯示PB MNC(來自S⑶003供體)由相似的方法被類似地重編程。圖11顯示了從新生兒臍帶血(CB，A)或成人外周血(PB，B)擴(kuò)增的單核細(xì)胞(MNC)的表型。在確定的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天或9天，為重編程作準(zhǔn)備，獲取細(xì)胞，通過1-2個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行核轉(zhuǎn)染，并通過FACS染色對(duì)表面標(biāo)記染色和進(jìn)行分析。也顯示了培養(yǎng)之前(第O天)MNC的表型作為對(duì)照。培養(yǎng)之后(第8天或第9天)，大部分細(xì)胞與表達(dá)高水平CD71 (轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的幼紅細(xì)胞相似，其中一些細(xì)胞也表達(dá)中等水平的CD235a (血型糖蛋白A)。非常少的細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞(⑶3，<2.4% )、B細(xì)胞(⑶19，< 0/4% )、單核細(xì)胞(⑶14，< 0. 4% )和粒細(xì)胞(⑶15，< 1.6% )的標(biāo)記。注意也出現(xiàn)了表達(dá)低水平⑶34(2. 5%至6.8% )的細(xì)胞群。圖12顯示了從成人外周血(PB)擴(kuò)增的單核細(xì)胞(MNC)功能。在培養(yǎng)之前(第O天)和培養(yǎng)之后(第8天)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行造血祖細(xì)胞測(cè)定。在第8天的培養(yǎng)物中，紅系祖細(xì)胞，例如紅系暴發(fā)集落形成單位細(xì)胞(BFU-E，未成熟紅系祖細(xì)胞)和紅系集落形成單位細(xì)胞(CFU-E，更定型的紅系祖細(xì)胞)，的頻率大大增加，而粒系集落生成細(xì)胞和單核細(xì)胞的祖細(xì)胞有適當(dāng)增加。集落形成單位單核細(xì)胞和混合細(xì)胞類型的集落形成單位(多潛能紅系/骨髓祖細(xì)胞)有所降低。圖13顯示了擴(kuò)增的成人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的胚胎和成人血紅蛋白表達(dá)類型。圖13A顯示了在培養(yǎng)之前(第O天)和之后(第9天)，用RT-PCR檢測(cè)編碼Y血紅蛋白(HBB，胚胎/新生兒形式)和β血紅蛋白(ΗΒΒ，成人形式)的基因。未培養(yǎng)的臍帶血單核細(xì)胞(CBMC)用作HBB和HBG mRNA水平的陽性對(duì)照。還包括了從相同PBMC (培養(yǎng)之后)重編程得到的iPSC系(SPE TNCI)的mRNA。培養(yǎng)9天之后，HBB的mRNA水平增加>500倍，HBG增加> 8，000倍。圖13B顯示用特異性單克隆抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBB和HBG蛋白進(jìn)行FACS分析。圖14顯示六個(gè)SPE iPSC不含任何可檢測(cè)到的與定型T細(xì)胞和B細(xì)胞有關(guān)的體細(xì)胞突變。圖14A顯示使用四組PCR引物，以檢測(cè)T細(xì)胞受體(TCR)重排的任何證據(jù)。來源于 克隆的人T細(xì)胞系的基因組DNA作為陽性對(duì)照，而人類ESC系(HI)作為陰性對(duì)照。使用從6個(gè)由(供體S⑶003的)PB MNC產(chǎn)生的iPSC系分離出的等量的基因組DNA(500ng)。它們均未顯示出TCR重排的任何陽性信號(hào)。圖14B顯示，使用三組PCR引物，以檢測(cè)在定型B細(xì)胞中發(fā)生的IgH重排的任何證據(jù)。包括一個(gè)克隆對(duì)照(29)作為陽性對(duì)照。六個(gè)SPE iPSC均未顯示出IgH重排的任何陽性信號(hào)，人類ESC也未顯示出IgH重排的任何陽性信號(hào)。圖14C顯示，從人類ESC和六個(gè)iPSC分離出的基因組DNA的質(zhì)量控制?？梢杂肞CR很容易地?cái)U(kuò)增混合引物，并產(chǎn)生從IOObp到600bp的多個(gè)產(chǎn)物。圖15A顯示，培養(yǎng)的血⑶34+細(xì)胞顯示的特征與hES/iPS細(xì)胞的特征相近度比成纖維細(xì)胞/MSC與hES/iPS細(xì)胞的更接近。圖15B顯示，成人PBMC產(chǎn)生的iPS細(xì)胞不是來源于在TCR基因座有VDJ體細(xì)胞突變的T細(xì)胞。圖15C顯示了本發(fā)明的示例性實(shí)施例的簡短總結(jié)，本發(fā)明中體/血細(xì)胞可以重編程、擴(kuò)增和分化為各種細(xì)胞類型。發(fā)明詳述由體細(xì)胞衍生的人類的誘導(dǎo)多潛能干(iPS)細(xì)胞有望開發(fā)出新的患者特異性的細(xì)胞療法，以及遺傳性和獲得性疾病的研究模型。之前，人類的貼壁細(xì)胞已被重編程，例如將出生后的成纖維細(xì)胞重編程為與粘壁的胚胎干細(xì)胞相似的iPS細(xì)胞。本發(fā)明提供了將出生后的人類血細(xì)胞衍生為iPS細(xì)胞，以及這些多潛能細(xì)胞用于疾病建模的潛力。已經(jīng)從之前冷凍的臍帶血或健康供體的成人CD34+細(xì)胞中產(chǎn)生了多個(gè)人類iPS細(xì)胞系，并可重新定向?yàn)樵煅只?。也可以從兩名患有骨髓增殖性疾?MPD)的患者的外周血⑶34+細(xì)胞中產(chǎn)生多個(gè)iPS細(xì)胞系，這些患者的血細(xì)胞中獲得了 JAK2-V617F體細(xì)胞突變。MPD衍生的含有突變的iPS細(xì)胞在表型、核型和多潛能性上表現(xiàn)正常。定向造血分化之后，由MPD-iPS細(xì)胞衍生的造血祖細(xì)胞(⑶34+⑶45+)可表現(xiàn)出紅細(xì)胞生成增加和特定基因的基因表達(dá)增加，重現(xiàn)了衍生出iPS細(xì)胞的相應(yīng)患者的原代CD34+細(xì)胞的特點(diǎn)。這些iPS細(xì)胞提供了可更新的細(xì)胞源，以及預(yù)期的造血作用模型，以用于研究MPD的疾病機(jī)制。本發(fā)明提供了對(duì)來源于健康供體的人類CB和成人骨髓(BM)⑶34+細(xì)胞的重編程，且無需任何預(yù)處理。而且，含有JAK2-V617F突變的PB⑶34+細(xì)胞可以衍生出多個(gè)iPS細(xì)胞系，JAK2-V617F突變?cè)诨加泄撬柙鲋承约膊?MPD)的成年患者的造血祖細(xì)胞中很常見。BCR/ABL陰性的MPD是疾病的異質(zhì)群體，包括真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、特發(fā)性血小板增多癥(ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)，其特征在于，紅系細(xì)胞、巨核細(xì)胞和骨髓系的增殖單獨(dú)升高或共同升高。> 95% PV和50% ET和PMF患者中出現(xiàn)了獲得性的常見體細(xì)胞突變JAK2-V617F。為了確定這些血細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞系能否作為模型，用于研究正常和異常的人體造血作用，可以使用有效的無血清分化方案將iPS細(xì)胞定向至造血譜系。從PV患者中(其中一人的血衍生的iPS細(xì)胞被使用)分離出的造血祖細(xì)胞(CD34+)的紅細(xì)胞生成增力口，與此相似，由PV-iPS細(xì)胞產(chǎn)生的重分化造血祖細(xì)胞(⑶34+⑶45+)與正常⑶34+細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞相比，也表現(xiàn)出紅細(xì)胞生成的增加。如本文所用，術(shù)語“皮質(zhì)類固醇”是指一組與腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的天然皮質(zhì)類固醇激素相似的藥物。已知皮質(zhì)類固醇通過多種機(jī)制抑制晚期過敏反應(yīng)。皮質(zhì)類固醇包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素。在本發(fā)明的一方面，皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、環(huán)索奈德、氯潑尼醇、可的松、可的伐唑、脫氧皮質(zhì)酮、地奈德、去羥米松、地塞米松、雙氟可龍、氟氯縮松、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟考丁酯、氟可的松、氟可龍、氟米龍、氟氫縮松、氟替卡松、氟氯舒松、氫化可的松、艾可米松、甲潑尼松、甲潑尼龍、莫米松、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、羅氟奈德、RPR 106541、替可的松、去炎松及其可藥用的衍生物。
在本發(fā)明的另一方面，皮質(zhì)類固醇選自下組阿氯米松、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、環(huán)索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、可的伐唑、地夫可特、去氧皮質(zhì)酮、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、氟氯縮松、氟氫可的松、氟氫縮松、氟米松、氟尼縮松、氟輕松、醋酸氟輕松、氟可丁、氟可龍、氟米龍、氟培龍、氟替卡松、氟潑尼定、福莫可他、氯氟舒松、鹵米松、醋丙氫可的松、氫化可的松丁丙酸酯、丁酸氫化可的松、氯替潑諾、甲羥松、甲潑尼松、甲潑尼龍、醋丙甲潑尼龍、莫米松糠酸酯、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松、潑尼松龍、潑尼立定、利美索龍、替可的松、曲安西龍和烏倍他索，及其可藥用的衍生物。在本發(fā)明的一方面，皮質(zhì)類固醇是選自下組的糖皮質(zhì)激素醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。在本發(fā)明的另一方面，皮質(zhì)類固醇為地塞米松。 如本文所用，術(shù)語“重編程”是指分化狀態(tài)的細(xì)胞轉(zhuǎn)換為去分化狀態(tài)的細(xì)胞的過程。重編程的細(xì)胞可以是多潛能或多功能細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“多潛能細(xì)胞”是指處于去分化或未分化狀態(tài)，且可分化為各種細(xì)胞類型的細(xì)胞。多潛能細(xì)胞表達(dá)多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記，并具有未分化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(例如，緊密的集落、較高的核質(zhì)比例、和/或明顯的核仁)。典型地，多潛能細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成所有三種胚層(例如內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。當(dāng)通過皮下、肌內(nèi)或睪丸內(nèi)途徑向體內(nèi)引入多功能細(xì)胞時(shí)，可以在免疫受損的動(dòng)物(例如SCID小鼠)中觀察到畸胎瘤的形成(Thomson et al. (1998) Science 282:1145-47)。如本文所用，術(shù)語“多潛能基因”是指與細(xì)胞的多潛能性有關(guān)的基因。通常，多潛能基因僅在多潛能干細(xì)胞中表達(dá)，并且對(duì)于多潛能干細(xì)胞的功能的確定(identity)至關(guān)重要。多潛能干細(xì)胞是處于相對(duì)未分化狀態(tài)的細(xì)胞，并且可以分化為不同類型的細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子0CT4就是多潛能基因的一個(gè)示例，它是建立和維持胚胎干細(xì)胞的未分化表型所必須的(Nichols et al. (1998)Cell 95:379-91 ；Niwa et al. (2000)Nature Genet. 24 :372-76)。Nanog 是多潛能基因的另一個(gè)不例(Chambers et al. O 2003) Cell 113 :643-55 ;Mitsuiet al. (2003) Cellll3 (5) :631-42 ；Bortvin et al. (2003) Development 130(8) :1673-80;Saitou et al. (2002) Nature418 (6895) :293-300)。如本文所用，術(shù)語“多潛能因子”是指
多潛能基因表達(dá)的因子。如本文所用，術(shù)語“多潛能特征”是指與多潛能性有關(guān)的很多特征，包括，例如分化為各種細(xì)胞類型的能力和多潛能細(xì)胞典型的表達(dá)類型，包括多潛能基因的表達(dá)、干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)和與多潛能性有關(guān)的生物標(biāo)記的表達(dá)。例如，一個(gè)重編程細(xì)胞可以表達(dá)堿性磷酸酶，但是不表達(dá)SSEA1，可以增殖超過30代，可以分化為肝細(xì)胞或造血細(xì)胞。另一個(gè)重編程細(xì)胞，例如，可以在細(xì)胞表面表達(dá)SSEA1，可以培養(yǎng)超過一年而不分化，也可以生長為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織?？梢杂靡环N或多種表面標(biāo)記或生物標(biāo)記的存在來定義重編程細(xì)胞。例如，某些重編程細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶。某些重編程細(xì)胞表達(dá)SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、和/或TRA-1-81。某些重編程細(xì)胞表達(dá)0CT4、S0X2、以及Nanog?？梢栽趍RNA水平或蛋白水平測(cè)定表面標(biāo)記或生物標(biāo)記的表達(dá)。 又例如，重編程細(xì)胞可以對(duì)堿性磷酸酶和SSEAl呈陽性，但是對(duì)SSEA4呈陰性。另外一個(gè)重編程細(xì)胞可以對(duì)Nanog、S0X2、以及0CT4呈陽性。在本發(fā)明的一方面，重編程細(xì)胞可以表達(dá)與抗體相互作用的細(xì)胞表面抗原，所述抗體能特異性結(jié)合TRA-1-60 (例如，ATCCHB-4783)和/或TRA-1-81 (例如，ATCC HB-4784)。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的另一方面，可以在沒有滋養(yǎng)層的情況下維持重編程細(xì)胞。本發(fā)明的重編程細(xì)胞可以具有分化為不同譜系的各種細(xì)胞類型的潛能，所述的譜系包括成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌、內(nèi)皮、間質(zhì)、平滑肌、心肌、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰島、或其他細(xì)胞類型。本發(fā)明的重編程細(xì)胞可以具有分化為所有細(xì)胞譜系的潛能。本發(fā)明的重編程細(xì)胞可以分化為很多譜系，包括1、2、3、4、5、6 10、11 20、以及多于20個(gè)譜系。本發(fā)明方法使用的多潛能基因或多潛能因子包括但不限于甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)、八聚體-4(0CT4)、Nanog、GABRB3、LEFTB, NR6A1、PODXL, PTEN、SRY (性別決定區(qū) Y)-框 2(也稱為 S0X2)、Myc、REX-I (也稱為 ZFP42)、整聯(lián)蛋白 α 6、ROXU LIF-R、TDGFl (CRIPTO)、SALL4 (sal 樣 4)、白細(xì)胞衍生趨化因子 I (LECTI)、BUBI、F0XD3、NR5A2、TERT、LIFR、SFRP2、TFCP2L1、LIN28、XIST、以及 Kruppel 樣因子(KLF)例如 KLF4 和 KLF5。本發(fā)明的方法可以使用I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11 20個(gè)、以及多于20個(gè)多潛能基因或多潛能因子。在一方面，本發(fā)明的方法使用至少三個(gè)多潛能基因或多潛能因子。在另一方面，本發(fā)明的方法使用至少四個(gè)多潛能基因或多潛能因子。在另一方面，本發(fā)明的方法使用至少五個(gè)多潛能基因或多潛能因子。在另一方面，本發(fā)明的方法使用至少六個(gè)多潛能基因或多潛能因子。根據(jù)本發(fā)明的方法，測(cè)試試劑可以是，例如，多核苷酸、肽、素?cái)M肽、類肽例如乙烯類肽、有機(jī)小分子、或類似物，并且可以以任何不同的方式作用，以改變細(xì)胞功能。例如，測(cè)試試劑可以通過結(jié)合細(xì)胞表面受體產(chǎn)生細(xì)胞外作用，從而改變由配體結(jié)合介導(dǎo)的功能，所述配體通常與受體結(jié)合并通過受體作用?；蛘撸瑴y(cè)試試劑可以被動(dòng)地或通過主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制橫穿細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生作用改變功能。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，肽測(cè)試試劑可包括大約兩個(gè)至四個(gè)殘基至幾百或幾千個(gè)氨基酸。如本文所用，術(shù)語“肽”并不表示含有分子的氨基酸包含特定大小或數(shù)量，肽測(cè)試試劑可以含有多達(dá)數(shù)個(gè)氨基酸殘基或更多?？梢酝ㄟ^，例如，化學(xué)合成方法制備肽測(cè)試試劑，或使用蛋白純化方法，隨后進(jìn)行蛋白水解，并且如果希望的話，通過色譜法或電泳法進(jìn)一步純化，或者可以通過編碼多核苷酸表達(dá)。此外，肽測(cè)試試劑可以基于已知肽，例如，天然存在的肽，但是可以與天然存在的序列不同，例如，通過在相應(yīng)的L-氨基酸的位置上含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸；或通過含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物，例如，在反應(yīng)性側(cè)鏈有衍生的或修飾的氨基酸。相似地，可以修飾肽測(cè)試試劑中的一個(gè)或多個(gè)肽鍵，或者可以修飾氨基末端或羧基末端或兩端的反應(yīng)性基團(tuán)。這種肽對(duì)蛋白酶、氧化劑或其在生物環(huán)境中可能遇到的其他反應(yīng)物質(zhì)的穩(wěn)定性提高。也可以修飾這種肽測(cè)試試劑以降低其在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性，使得肽在這種環(huán)境中的活性時(shí)間減少。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，多核苷酸測(cè)試試劑可以包括大約兩個(gè)至四個(gè)殘基至幾百或幾千個(gè)核苷酸。如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”并不局限于兩個(gè)或多個(gè)由磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。也可使用磷酸二酯鍵以外的的連接。
術(shù)語“多核苷酸”包括RNA和DNA，可以是基因或其一部分、cDNA、人工合成多聚脫氧核糖核苷酸序列或類似物，且可以是單鏈的或雙鏈的，以及DNA/RNA雜合體。此外，如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”包括可從細(xì)胞中分離的天然存在的核酸分子，以及人工合成分子，人工合成分子可以通過，例如，化學(xué)合成方法或酶法例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備。在不同的實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸可以包括核苷或核苷酸類似物，或磷酸二酯鍵以外的骨架鍵?？偟膩碚f，含有多核苷酸的核苷酸是天然存在的脫氧核糖核苷酸，例如與2，-脫氧核糖連接的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，例如與核糖連接的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶。但是，多核苷酸也可以含有核苷酸類似物，包括非天然存在的人工合成核苷酸或修飾的天然存在的核苷酸。所述核苷酸類似物是本領(lǐng)域已知的，并可通過商業(yè)獲得，如含有所述核苷酸類似物的聚核苷酸(Lin et al. (1994)Nucl. AcidsRes. 22 :5220-34 ；Jellinek et al. (1995)Biochemistry 34 :11363-72 ;Pagratis etal. (1997) Nature Biotechnol. 15 :68_73，每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)。在多核苷酸中連接核苷酸的共價(jià)鍵一般是磷酸二酯鍵。但是，共價(jià)鍵也可以是任意的其他多種鍵，包括二硫酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽樣鍵或現(xiàn)有技術(shù)已知的對(duì)連接核苷酸以產(chǎn)生人工合成聚核苷酸有用的其他任何鍵(參見，例如，Tarn et al. (1994)Nucl. AcidsRes. 22 :977-86 ；Ecker and Crooke (1995) BioTechnology 13 :351-60,每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)。當(dāng)多核苷酸需要暴露于具有核酸降解活性的環(huán)境中時(shí)，例如，在組織培養(yǎng)基中或施用于活的主體時(shí)，摻入非天然存在的核苷酸類似物或連接核苷酸或類似物的鍵將特別有用，因?yàn)樾揎椀亩嗪塑账岵蝗菀妆唤到??？梢酝ㄟ^化學(xué)合成或使用重組DNA方法，使用適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嶙鳛槟０澹陨珊刑烊淮嬖诘暮塑账岷土姿岫ユI的多核苷酸。相比之下，含有核苷酸類似物或非磷酸二酯鍵共價(jià)鍵的多核苷酸一般是通過化學(xué)合成的，雖然如T7聚合酶這樣的酶可以將一定類型的核苷酸類似物結(jié)合為多核苷酸，從而可以用于從適當(dāng)?shù)哪０逋ㄟ^重組生成所述多核苷酸(Jellinek et al. (1995)Biochemistry 34:11363-72)。
可以通過使用本文公開的方法或現(xiàn)有技術(shù)已知的方法將多核苷酸測(cè)試試劑與細(xì)胞接觸或引入細(xì)胞。通常，但不是必需地，將多核苷酸引入細(xì)胞，使其在細(xì)胞中直接、或經(jīng)轉(zhuǎn)錄或翻譯或兩者之后發(fā)揮其作用。例如，多核苷酸可以編碼肽測(cè)試試劑，肽測(cè)試試劑在細(xì)胞中表達(dá)并改變細(xì)胞的功能。多核苷酸測(cè)試試劑也可以是，或可以編碼，反義分子、干擾RNA、小RNA、核酶或三聯(lián)試劑，它們可以設(shè)計(jì)為靶向作用于一個(gè)或多個(gè)特異性的靶核酸分子。反義多核苷酸、核糖酶和三聯(lián)試劑一般設(shè)計(jì)為與靶序列互補(bǔ)，其可以是DNA或RNA序列，例如mRNA，可以是編碼序列、含有內(nèi)含子-外顯子連接的核苷酸序列、調(diào)控序列例如Shine-Delgarno序列等等。其互補(bǔ)的程度使得多核苷酸，例如，反義多核苷酸，可以在細(xì)胞中與靶序列特異性地相互作用。根據(jù)反義或其他多核苷酸的總長度，與靶序列的一個(gè)或幾個(gè)錯(cuò)配序列是容許的，且不會(huì)失去多核苷酸對(duì)其靶序列的特異性。因此，在例如由20個(gè)核苷酸組成的反義分子中，可以容許有少量的錯(cuò)配序列，然而對(duì)于例如與編碼細(xì)胞多肽的靶mRNA全長互補(bǔ)的反義分子而言，數(shù)個(gè)錯(cuò)配序列也不會(huì)影響反義分子的雜交效率。可以容許的錯(cuò)配序列數(shù)量可以通過例如確定雜交動(dòng)力學(xué)的已知公式來估計(jì)(參見Sambrook, J.；Fritsch, E. F. and Maniatis, T. " Molecular Cloning A Laboratory Manual, " vol.
I.2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或可以使用本文公開的方法或現(xiàn)有技術(shù)已知的方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，特別是通過確定細(xì)胞中存在的反義多核苷酸、核酶、或三聯(lián)試劑降低靶序列的水平或細(xì)胞中由靶序列編碼的多肽的表達(dá)?？捎米鞣戳x分子、核酶或三聯(lián)試劑的多核苷酸可以抑制翻譯或剪切核酸分子，從而改變細(xì)胞的功能。反義分子，例如，可以與mRNA結(jié)合，以形成在細(xì)胞中不能被翻譯的雙鏈分子。優(yōu)選至少有約15至25個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀缀铣?，并可以與靶序列特異性雜交，雖然也可以由引入靶細(xì)胞的多核苷酸表達(dá)出較長的反義分子?？梢允褂靡阎椒?，例如，基因步移法(參見，例如，Seimiya et al. (1997) J. Biol. Chez. 272 =4631-36,其在此參考并入)，確定可用作反義分子的特定核苷酸序列。當(dāng)反義分子與靶細(xì)胞直接接觸時(shí)，它可以操作性連接于化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，例如，鐵結(jié)合的EDTA，其在雜交位點(diǎn)將靶RNA剪切。相比之下，三聯(lián)試劑可以使轉(zhuǎn)錄停頓(Maher et al. (1991)Antisense Res. Devel. I :227 ；Helene (1991)Anticancer Drug Design 6:569)。本發(fā)明篩選試驗(yàn)的進(jìn)行可以通過將測(cè)試試劑與細(xì)胞在體內(nèi)接觸，例如，將細(xì)胞施予或植入主體之后進(jìn)行，或者通過將測(cè)試試劑與細(xì)胞在體外接觸，例如，將測(cè)試試劑加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，或加入到向從培養(yǎng)基中分離出的細(xì)胞中。在未分化的多潛能干細(xì)胞中，由于與試劑接觸而導(dǎo)致發(fā)生改變的功能可以是任意的功能。例如，功能可以是在細(xì)胞中通常表達(dá)(或不表達(dá))的基因的表達(dá)，所述試劑對(duì)功能的改變可以通過增加或降低表達(dá)基因的表達(dá)水平(例如，降低階段特異性的表面抗原_4、堿性磷酸酶、或0CT4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá))，或通過開啟細(xì)胞中未表達(dá)基因的表達(dá)(例如誘導(dǎo)階段特異性的表面抗原-I的表達(dá))。在一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)揮細(xì)胞功能的試劑是誘導(dǎo)細(xì)胞分化從而產(chǎn)生分化細(xì)胞的試齊U。所述分化細(xì)胞可以是多功能人類肝細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞)或可以是終末分化細(xì)胞(例如肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血細(xì)胞、結(jié)締組織、或上皮細(xì)胞)。因此，本發(fā)明的方法可用于鑒定試劑，其可誘導(dǎo)細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、或其他細(xì)胞類型。本發(fā)明的篩選方法提供了如下優(yōu)勢(shì)它可適用于高通量分析，從而可用于篩選測(cè)試試劑的組合文庫，以鑒定那些可以改變多潛能或多功能細(xì)胞的功能的試劑?，F(xiàn)有技術(shù)已知多種方法，可用于制備分子組合文庫以供檢測(cè)所需的活性，包括，例如，制備肽的噬菌體展示文庫的方法，所述肽可以是限制性肽(參見，例如，美國專利號(hào)5，622，699 ;美國專利號(hào)5,206, 347 ；Scott and Smith (1992)Science 249 :386-90 ；Markland et al. (1991)Gene109 :13-19 ;每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)；肽文庫(美國專利號(hào)5，264，563，其在此參考并入)；素?cái)M妝文庫(Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14 :83-92 ；a nucleic acidlibrary (0 1 Connell et al. (1996)Proc. Natl. Acad. ScL, USA 93:5883-87 ；Tuerk andGold(1990) Science 249 :505-10 ；Gold et al. (1995) Ann. Rev. Biochem. 64 :763-97 ;每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)；寡糖文庫(York et al. (1996) Carb. Res. 285 :99-128 ；Liang etal. (1996)Science 274 :1520-22 ;Ding et al. (1995)Adv. Expt. Med. Biol. 376 :261-69 ；每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)；脂蛋白文庫(de Kruif et al. (1996)FEBS Lett. 399 =232-36,其在此參考并入)；糖蛋白或糖脂文庫(Karaoglu et al. (1995) J Cell Biol. 130 :567-77,其在此參考并入)；或含有，例如，藥物或其他藥學(xué)制劑的化學(xué)文庫(Gordon et al. (1994)J Med. Chem. 37 :1385-1401 ；Ecker and Crooke (1995) BioTechnologyl3 :351-60 ;每篇文獻(xiàn)均在此參考并入)。 多核苷酸特別適用于作為改變細(xì)胞功能的試劑，因?yàn)樽匀唤缰写嬖趯?duì)細(xì)胞靶點(diǎn)，包括細(xì)胞多肽具有結(jié)合特異性的核酸分子，也因?yàn)榫哂羞@種特異性的合成分子很容易制備和識(shí)別(參見，例如，美國專利號(hào)5，750，342，其在此參考并入)。對(duì)于高通量形式，可以將本發(fā)明的細(xì)胞引入多孔板或載玻片或微芯片的孔中，并且可以與測(cè)試試劑接觸。通常，細(xì)胞的排列方式為陣列，特別是可尋址的陣列，從而可以使用機(jī)器人方便地操作細(xì)胞和溶液，并監(jiān)測(cè)本發(fā)明的細(xì)胞，特別是監(jiān)測(cè)待檢功能。使用高通量形式的優(yōu)勢(shì)是可以平行地檢測(cè)很多測(cè)試試劑，如果需要的話，也可以在與試驗(yàn)條件相同的條件下進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)。因此，本發(fā)明的方法提供了篩選一個(gè)、數(shù)個(gè)或很多測(cè)試試劑的方法，以識(shí)別可以改變細(xì)胞功能的試劑，例如，誘導(dǎo)多潛能或多功能細(xì)胞分化為目標(biāo)細(xì)胞類型的試劑，或防止自發(fā)分化的試劑，例如通過將調(diào)控分子例如0CT4的表達(dá)維持在較高的水平。本發(fā)明的游離型載體包括允許載體在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的組分。例如，已知埃潑斯坦-巴爾oriP/核抗原-I (EBNA-I)組合可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是靈長類動(dòng)物細(xì)胞中支持載體自我復(fù)制。(Lindner and Sugden(2007)Plasmid 58(1) :1-12,在此整體參考并入)。適用于本發(fā)明構(gòu)建表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的，并可以在Sambrook等的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(第三版，Cold Spring harbor Press, ColdSpringHarbor, N. Y. 2001)中找到，其整體在此參考并入。天然存在的脂肪酸和家常營養(yǎng)補(bǔ)充劑大大提高了從人類體細(xì)胞衍生出誘導(dǎo)多潛能干(iPS)細(xì)胞的效率。提供了新型生物活性分子，用于重編程和治療因潛在突變導(dǎo)致的生物學(xué)結(jié)果。提供了將(來源于CB或成人PB的)血細(xì)胞重編程為多潛能或多功能干細(xì)胞的方法，以產(chǎn)生保持了天然和未改變基因組的iPS細(xì)胞(沒有載體插入或體細(xì)胞突變)。提供了制備(準(zhǔn)備(prime))PB和CB單核細(xì)胞以進(jìn)行有效重編程的方法。提供了細(xì)胞因子和激素的混合物。在某些實(shí)施例中，地塞米松的加入(一種人工合成的糖皮質(zhì)激素)是成功有效重編程的關(guān)鍵。提供了地塞米松和其他糖皮質(zhì)激素(天然的或人工合成的)用于重編程體細(xì)胞，包括血細(xì)胞，并產(chǎn)生iPS細(xì)胞的用途。地塞米松和其他糖皮質(zhì)激素已用于建立和擴(kuò)增骨髓間質(zhì)細(xì)胞/間質(zhì)肝細(xì)胞(多功能干細(xì)胞或MSC)和紅系祖細(xì)胞，但是在本發(fā)明之前，它們?cè)谥鼐幊讨械挠猛救匀晃粗Ｌ峁┝藦腃B、成人血液和骨髓⑶34+細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞系，以及它們向造血的定向分化。從臍帶血衍生iPS細(xì)胞的技術(shù)有望很多個(gè)體生成組織相容性的干細(xì)胞，因?yàn)槟殠а獛熘惺占舜罅康哪殠а?。由于從CB和成人來源獲得的造血干/祖細(xì)胞難以在體外擴(kuò)增，因此通過用衍生的iPS細(xì)胞進(jìn)行無限擴(kuò)增，加上進(jìn)一步優(yōu)化的造血分化方法，可以提供一個(gè)重要的備選方法，用于貯存和擴(kuò)增組織相容性干細(xì)胞，以用于血液/BM移植。根據(jù)本發(fā)明，可以比較⑶34+細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞和其他出生后的細(xì)胞類型衍生的iPS細(xì)胞的重編程效率和性質(zhì)。本發(fā)明提供了通過所述的重編程方法，生成具有體細(xì)胞突變的MPD特異性iPS細(xì)胞系，所述體細(xì)胞突變發(fā)生于血細(xì)胞譜系中。當(dāng)衍生自MPD(PV和PMF)患者外周血的iPS細(xì)胞系被作為未分化的多潛能干細(xì)胞維持時(shí)，可以顯示出典型的hES和iPS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生長類型。一旦被誘導(dǎo)，它們就可以分化為源自三種胚胎胚層的各種細(xì)胞類型，包括造 血細(xì)胞。值得注意的是，由PV iPS細(xì)胞重分化的造血祖細(xì)胞可以顯示出與PV患者的原代⑶34+細(xì)胞相似的紅細(xì)胞生成增加的特征，而PV就是一種以紅細(xì)胞生成過剩為特征的造血系統(tǒng)疾病。本發(fā)明也提供了衍生自PMF患者(MPD562)的兩個(gè)iPS細(xì)胞系的完全特征。這些iPS細(xì)胞系可以一起為研究MPD發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)潛在的模型系統(tǒng)。雖然對(duì)JAK2-V617F突變的發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)了對(duì)MPD發(fā)病機(jī)制的理解，但問題仍然存在，包括JAK2-V617F克隆顯性是如何發(fā)生的，一個(gè)突變?nèi)绾未俪扇N不同的疾病。轉(zhuǎn)基因鼠模型表明，JAK2-V617F的劑量效應(yīng)可能會(huì)促成不同的MPD顯性(Tiedt et al. (2008)Bloodlll :3931-40 ；Xing et al. (2008)Blood 111 :5109-17)。很多之前的研究表明，其他遺傳或表觀遺傳事件對(duì)MH)發(fā)展很重要，最近的研究與此前的研究一致，證明了生殖細(xì)胞系中的 SNP 與 JAK2-V617F+MPD 的發(fā)展傾向有關(guān)。(Olcaydu et al. (2009)Nat Genet. 41 450-54 ；Kilpivaara et al. (2009)Nat Genet.41:455-59 ;Jones et al. (2009)NatGenet. 41 :446-49)。作為這些研究的補(bǔ)充，可更新的iPS細(xì)胞系和隨后的造血分化技術(shù)可為研究MPD發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新穎的、潛在的模型。雖然當(dāng)PV iPS衍生的造血祖(⑶34+⑶45+)細(xì)胞和來源于相同PV患者的原代⑶34+細(xì)胞與其各自的正常對(duì)照相比較時(shí)，在紅細(xì)胞生成增加(圖2)和基因表達(dá)類型(圖3)方面顯示出顯著的相似性，但是可能只有少量的iPS克隆可用于闡明其造血潛能的完全特征?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明，分析來源于更多PV和其他MH)患者和正常對(duì)照的其它iPS細(xì)胞系。另外，本發(fā)明提供了使用血細(xì)胞(帶有JAK2-V617F突變)和骨髓間質(zhì)細(xì)胞(缺乏JAK2突變)從相同的患者產(chǎn)生iPS細(xì)胞系的過程(Mercier et al. (2009)Exp Hematol. 37 416-20)，在配對(duì)的iPS細(xì)胞系建立后，可以根據(jù)本發(fā)明比較它們的造血潛能。結(jié)合在人類iPS和ES細(xì)胞中的改進(jìn)的基因打靶技術(shù)，本發(fā)明提供了 iPS細(xì)胞系及其造血子代，作為有力的工具用于研究JAK2-V617F基因劑量和其他遺傳變異如何影響MPD祖細(xì)胞的行為(Zouet al. (2009)Cell Stem Cell 5:97-110)。當(dāng)前iPS技術(shù)的主要顧慮之一是反轉(zhuǎn)錄病毒的使用和基因組整合。本發(fā)明提供了無需永久基因組改變即可獲得人成纖維細(xì)胞重編程的方法，可能也適用于人類血細(xì)胞(ffoltjen et al. (2009)Nature 458 :766-70 ;Yu et al. (2009)Science 324:797-801;Yusa et al. (2009)Nat Methods6 :363-69 ；Zhou et al. (2009)Cell Stem Cell 4 :381-84 ；Kim et al. (2009)Cell Stem Cell4 :472-76)。這些方法使我們可以從血細(xì)胞中衍生出適當(dāng)?shù)幕颊呋蚣膊√禺愋詉PS細(xì)胞，用于研究各種伴有獲得性或遺傳性突變的血液疾病。本發(fā)明也涉及人類血細(xì)胞的獨(dú)特的表觀遺傳標(biāo)記，允許通過非整合質(zhì)粒進(jìn)行有效的iPS細(xì)胞衍生。本發(fā)明提供了，通過I 2個(gè)質(zhì)粒對(duì)人類成人外周血(PB)或臍帶血(CB)細(xì)胞進(jìn)行有效的重編程，以產(chǎn)生基因組未改變的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSC)?？蓪B或CB單核細(xì)胞(MNC)或純化的⑶34+細(xì)胞培養(yǎng)4 9天，然后用表達(dá)重編程基因的新型EBNAl/OriP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一次。兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后十四天，每IO6個(gè)轉(zhuǎn)染的CB和PB⑶34+細(xì)胞可以分別獲得平均250個(gè)和9個(gè)iPSC樣克隆?；蛘?，可以將未分割的MNC培養(yǎng)8 9天，并用同樣的方法產(chǎn)生iPSC。在一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)5個(gè)細(xì)胞因子的單個(gè)EBNAl/OriP質(zhì)粒也可以從所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型中產(chǎn)生iPSC，雖然有效性比使用成人PB細(xì)胞低 5倍。重編程和擴(kuò)增之后，游離型DNA逐漸在增殖的iPSC中消失。這些iPSC有未改變的核基因組和正常的核型，并且是多潛能性的。本發(fā)明提供了產(chǎn)生無整合的人類iPSC的方法，通過向短暫培養(yǎng)和準(zhǔn)備的成人PB和CB MNC中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，這些成人PB和CB MNC顯示出期望的表觀遺傳標(biāo) 記，這會(huì)加速它們?cè)谘芯亢蛯砼R床應(yīng)用中的使用。自2007年以來，通過用病毒載體表達(dá)具體的重編程因子，以及從多種體細(xì)胞類型中產(chǎn)生了在形態(tài)學(xué)上和功能上與人類胚胎干細(xì)胞(ESC)相似的人類iPSC。從血液MNC中產(chǎn)生人類iPSC比其他細(xì)胞類型有若干優(yōu)勢(shì)(Yamanaka(2010)Cell Stem Cell 7(1) :1_2)。PB比表皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞更加容易獲得，且損傷性更小，因?yàn)楸砥こ衫w維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞需要從皮膚活組織中經(jīng)數(shù)周時(shí)間建立原代細(xì)胞培養(yǎng)物。發(fā)明人和其他人通過從臍帶CB、成人PB和骨髓(BM)產(chǎn)生的表達(dá)⑶34或⑶133標(biāo)記的人類未成熟MNC，使用表達(dá)4個(gè)或更少重編程基因的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)過2 4天培養(yǎng)之后，已經(jīng)成功地了產(chǎn)生 iPSC(Ye et al. (2009)Blood 114 :5473-80 ;Loh et al. (2009)Blood 113:5476-79;Giorgetti et al. (2009) Cell Stem Cell 5:353-57)。隨后，5 個(gè)組通過使用病毒載體，將未分割的MNC經(jīng)較長時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)以使它們活化為增殖狀態(tài)，并生成了人類iPSC。因?yàn)門細(xì)胞在PBMNC中最充足，并且易于擴(kuò)增和被病毒載體感染，所以5項(xiàng)研究中所有或絕大部分衍生的iPSC均在T細(xì)胞受體(TCR)基因座有重排的核基因組，這也就不足為奇了。目前正在測(cè)試多種無病毒和無整合的方法，以有效地重編程人類出生后的細(xì)胞。但是，這些使用質(zhì)粒或蛋白的公開的研究中，大部分報(bào)道的效率都極低，甚至當(dāng)使用最簡單的細(xì)胞類型時(shí)也是如此。相比于其他基于質(zhì)粒的遞送方法，例如piggyBac DNA轉(zhuǎn)座子和延長表達(dá)并激活重編程人類出生后細(xì)胞的微環(huán)質(zhì)粒，過去的二十年中已廣泛使用的EBNAl/OriP游離型載體系統(tǒng)具有若干優(yōu)勢(shì)。從EBV基因組衍生的反式EBNAl元件和順式OriP元件能使一個(gè)簡單的質(zhì)粒在增殖的人類細(xì)胞中復(fù)制并作為游離體持續(xù)存在。它也可以在人類ESC中以游離形式留存，且?guī)缀醪挥绊懫渥晕腋潞投酀撃苄?。在沒有任何選擇的情況下，遞送至人類ESC的游離型EBNAl/OriP質(zhì)粒逐漸消失，這可能是由于質(zhì)粒的表觀遺傳修飾(例如DNA甲基化)導(dǎo)致ENBAl表達(dá)和/或OriP功能的喪失。利用EBNAl/OriP質(zhì)粒的獨(dú)特性質(zhì)，Thomson Yu的小組成功地將人類新生兒的成纖維細(xì)胞重編程為無整合的iPSC系(Yu et al. (2009) Science 324:797-801)。但是，即使使用了表達(dá)7個(gè)基因的3個(gè)ENBAl/OriP質(zhì)粒，其效率仍然較低(每IO6個(gè)新生兒的成纖維細(xì)胞約3 6個(gè))。隨后，有報(bào)道表明，用表達(dá)較少基因的游離型載體重編程了人類胎兒神經(jīng)干細(xì)胞。但是，為發(fā)展細(xì)胞療法和建立疾病模型，非常需要開發(fā)一種有效的方法，從成人體細(xì)胞中產(chǎn)生無整合和無病毒的人類iPSC，而成人體細(xì)胞比其對(duì)應(yīng)的胎兒/新生兒細(xì)胞在重編程方面的容許性更小。本發(fā)明提供了改善的EBNAl/oriP質(zhì)粒，用于測(cè)試是否可以通過一個(gè)多順反子的質(zhì)粒，對(duì)出生后的體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效的重編程。另外，本發(fā)明提供了更好的出生后的人類細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型容易獲得、制備或準(zhǔn)備以用于重編程，可被質(zhì)粒有效地轉(zhuǎn)染，并且更重要的是，可有效地生成高質(zhì)量的iPSC。觀察到人類⑶34+造血細(xì)胞具有較高的效率，這可能是因?yàn)榕ciPSC生成相關(guān)或必需的基因的表達(dá)水平較高，或者是因?yàn)樵诓捎玫呐囵B(yǎng)條件下具有較高的增殖活性。并非相互排斥，高效率可能是由于未成熟的人類造血細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞因子活化之后具有的有利的表觀遺傳標(biāo)記。本發(fā)明提供了對(duì)以下細(xì)胞的全基因組啟動(dòng)子的DNA甲基化特征的分析來源于CB、成人PB和BM的培養(yǎng)的人類CD34+細(xì)胞(每個(gè)2份樣品)，成人BM衍生的培養(yǎng)的MSC (4份樣品)和IMR90胚胎成纖維細(xì)胞，以及通過各種載體從這些體細(xì)胞衍生的17個(gè)iPSC系。另外,包括了至少11份ESC樣品,用于建立本底水平。使用IUumina' slnfinium Methylation27平臺(tái)，以單核苷酸的分辨率，在啟動(dòng)子區(qū)附近的27，578個(gè)有信息的CpG位點(diǎn)處檢測(cè)DNA的甲基化，其超甲基化與基因表達(dá)的抑制有關(guān)。排除位于X和Y染色體的1091個(gè)基因座，使用皮爾森相關(guān)系數(shù)的樹狀圖表明，來源于各種體細(xì)胞的17個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的iPSC系與ESC高度相似，但是與其親代細(xì)胞不同(圖8A)。本發(fā)明提供培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞集群，與MSC/胚胎成纖維細(xì)胞組相比，CD34+細(xì)胞集群與ESC/iPSC組更近。為了更密切地檢查該特征，本發(fā)明提供了對(duì)數(shù)據(jù)的K均值集群分析(圖SB)。分析了 26，487個(gè)常染色體基因座的啟動(dòng)子的DNA甲基化水平(從O到I)。根據(jù)體細(xì)胞中啟動(dòng)子DNA甲基化與作為本底的11個(gè)ESC的相對(duì)水平，得到四個(gè)不同的集群。集群2(體細(xì)胞中較高，但是ESC中較低，含有最多的多潛能基因)和集群3 (體細(xì)胞中較低，ESC中較高)含有的基因座表明體細(xì)胞和ESC之間的啟動(dòng)子DNA甲基化水平不同。MSC中有15. 4%的基因座與ESC不同，⑶34+細(xì)胞中只有10. 8%的基因座與ESC不同，表明通過該整體分析，⑶34+HSPC更接近于ESC(和iPSC，未顯示)。當(dāng)發(fā)明人進(jìn)一步研究在MSC中超甲基化而在⑶34+細(xì)胞和ESC/iPSC中低甲基化的基因時(shí)，發(fā)明人注意到這些基因與多潛能性有關(guān)，例如HMGAl和CD34標(biāo)記基因(X，Y)。將新型ENBAl/OriP質(zhì)粒組合用于重編程具有有利的表觀遺傳標(biāo)記的CB⑶34+細(xì)胞。在第一個(gè)ENBAl/OriP質(zhì)粒(稱為pEB_C5)中，5個(gè)重編程因子(0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC和LIN28)被表達(dá)為單個(gè)多順反子單元。在第二個(gè)ENBAl/OriP質(zhì)粒組合中，各自表達(dá)了 SV40大T抗原(Tg)、NANOG或靶向作用于p53的小發(fā)夾RNA(p53shRNA)。在第一組3項(xiàng)試驗(yàn)中，使用pEB-C5和pEB-Tg質(zhì)粒,與Thomson/Yu的含有3個(gè)質(zhì)粒的6號(hào)組合相比較。用細(xì)胞因子擴(kuò)增(大約5倍)4天之后，CB CD34+細(xì)胞被轉(zhuǎn)染一次，然后根據(jù)衍生人類iPSC的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明提供了產(chǎn)生iPSC的方法，其中將分離的CBCD34+細(xì)胞用細(xì)胞因子培養(yǎng)4天，然后在第O天用2個(gè)或3個(gè)質(zhì)粒(總共10 μ g DNA)進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞再培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移至包被有MEF滋養(yǎng)細(xì)胞的6個(gè)孔。在第3天，使用含有或不含有NaB (0. 25mM)或VPA (0. 5mM)的ESC培養(yǎng)基。第9天之后，使用MEF衍生的條件培養(yǎng)基(CM)替代普通ESC培養(yǎng)基。與2質(zhì)粒組合(pEB-C5+pEB-Tg)相比，Thomson/Yu的6號(hào)組合能更有效地產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的集落。在第14天，用TRA-1-60抗體將培養(yǎng)物進(jìn)行活細(xì)胞染色。計(jì)數(shù)所有的集落，然后挑選出有ESC樣形態(tài)學(xué)的TRA-1-60+集落。但是，即使到了第10-14天時(shí)，6號(hào)組合的大部分集落仍然不是ESC樣，與之前的新生兒成纖維細(xì)胞的報(bào)道一致。少數(shù)對(duì)TRA-1-60染色陽性，TRA-1-60是在人類ESC和iPSC中表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記。已表明，獲得TRA-1-60或相關(guān)抗原TRA_1_81的細(xì)胞表面表達(dá)是監(jiān)測(cè)人類體細(xì)胞完全重編程的更好的標(biāo)記。本發(fā)明提供了在第14天對(duì)全部培養(yǎng)基進(jìn)行活細(xì) 胞染色，并計(jì)算出TRA-1-60陽性和陰性集落。2質(zhì)粒組合產(chǎn)生的TRA-1-60+集落在數(shù)量上與6號(hào)組合相似(圖8D)，但是它們?cè)诳偧渲兴嫉陌俜直雀?圖SE)。丁酸鈉( NaB)，一種刺激人類成纖維細(xì)胞重編程的HDAC(組蛋白去乙酰化酶)抑制劑，也可以通過任何一種載體組合始終提高TRA-1-60+集落的數(shù)量(和百分比)(圖8D和8E)。在第二組實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人用NANOG或p53shRNA替換Tg，或完全省略Tg(圖8F和8G)。通過向pEB-C5質(zhì)粒中加入pEB-Tg質(zhì)粒產(chǎn)生TRA-1-60+集落的總效率與通過表達(dá)p53shRNA或NANOG的EBNAl/OriP質(zhì)粒產(chǎn)生TRA-1-60+集落的總效率(程度較小)相似，但是p53shRNA產(chǎn)生更多不需要的TRA-1-60-集落。單獨(dú)用pEB_C5質(zhì)粒也能夠從IO6個(gè)核轉(zhuǎn)染細(xì)胞中(從最初大約O. 2 X IO6個(gè)⑶34+細(xì)胞擴(kuò)增4天之后)產(chǎn)生大約50個(gè)TRA-1-60+集落。當(dāng)在重編程過程中，在NaB存在時(shí)使用pEB-C5，產(chǎn)生大約160個(gè)TRA-1-60+集落(圖8F)。TRA-1-60染色之后，發(fā)明人挑選出單個(gè)的ESC樣集落，這些集落是通過用單獨(dú)的PEB-C5 (C)、pEB-C5+pEB-Tg (CT)或在NaB存在時(shí)(CTN)轉(zhuǎn)染而衍生得到。檢測(cè)了每種類別中通過標(biāo)準(zhǔn)方法得到的至少兩個(gè)CB衍生的克隆?？梢杂^察到一種代表性克隆，CT5，的未分化表型。通過C5+Tg游離型載體從CB⑶34+細(xì)胞(男性)衍生的iPSC(克隆CT5)的未分化表型可以被各種抗選擇性標(biāo)記的抗體染色。0CT4、NANOG、SSEA4以及TRA-1-60標(biāo)記的免疫熒光染色可以表明，擴(kuò)增的CT5克隆顯示出對(duì)人類ESC/iPSC獨(dú)特的未分化表型。也可以以相似的方式檢查其它的克隆，例如CTN4和C7。本發(fā)明提供了 6個(gè)克隆中的5個(gè)具有正常核型(CT5和CTN4)?？梢詸z查iPSC克隆CT5和CTN4 (由C5+Tg載體加上NaB衍生的另外一個(gè)代表性克隆)的核型，并表現(xiàn)出正常的男性核型。也可以觀察到來源于女性樣品的由單個(gè)質(zhì)粒(PEB-C5)的核轉(zhuǎn)染衍生的兩個(gè)iPSC系(C7和CNl)的正常核型。由單個(gè)載體(PEB-C5)衍生的兩個(gè)擴(kuò)增iPSC克隆的核型也均正常，并表現(xiàn)出未分化的表型。本發(fā)明提供了全基因組SNP分析，以檢查CT5和CTN4基因組與來自相同CB供體的原代CB⑶34-細(xì)胞的相似性。全基因組數(shù)據(jù)(覆蓋> IO6SNP)表明，CT5和CTMiPSC在本質(zhì)上與CB供體的CD34-細(xì)胞相同，并且游離型載體的重編程不會(huì)導(dǎo)致基因組發(fā)生可檢測(cè)的改變。本發(fā)明也提供了不同時(shí)期重編程細(xì)胞中游離型DNA存在的分析。本發(fā)明提供了使用EBNAUTg或β-actin (基因組DNA)的特異引物，對(duì)游離型DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。未轉(zhuǎn)染(天然)細(xì)胞和在PEB-C5轉(zhuǎn)染之后第2天收集的細(xì)胞可以分別作為陰性或陽性對(duì)照。pEB-Tg質(zhì)粒(含有EBNAl和Tg DNA)可以用作普通的DNA對(duì)照，數(shù)量相當(dāng)于每個(gè)細(xì)胞DNA基因組I個(gè)或O. 2個(gè)拷貝。通常，在重編程(14天)和擴(kuò)增9代(大約50天)之后，可以檢測(cè)到痕量的游離型DNA (每個(gè)細(xì)胞< O. 2個(gè)拷貝)，但是到第11 12代，就檢測(cè)不到了。該數(shù)據(jù)與之前的新生兒成纖維細(xì)胞或胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞的報(bào)道一致，即人類iPSC中EBNAl/OriP游離型DNA在重編程之后逐漸消失。對(duì)具有或沒有Tg(CT5、CTN4和C7)短暫表達(dá)而衍生的iPSC系也進(jìn)行了多潛能性的測(cè)定。本發(fā)明提供了通過胚狀體(EB)形成而進(jìn)行的體外多潛能性試驗(yàn)?？梢园l(fā)現(xiàn)由外胚層(β_3-微管蛋白)、中胚層(平滑肌肌動(dòng)蛋白)和內(nèi)胚層(α-胎蛋白或AFP)衍生的細(xì)胞類型。本發(fā)明也提供通過畸胎瘤形成而進(jìn)行的體內(nèi)多潛能性試驗(yàn)?？梢园l(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞類型，例如神經(jīng)菊形團(tuán)(外胚層)、軟骨(中胚層)和腺狀結(jié)構(gòu)(內(nèi)胚層)?？梢杂^察到CTMiPSC克隆的多潛能性數(shù)據(jù)?；旧希?個(gè)克隆(CT5、CTN4和C7)顯示出的多潛能性與人類ESC和其他確證的iPSC均無差別。CT5和CTN4的全基因組啟動(dòng)子DNA甲基化分析也表明，它們相互接近，并且與其他iPSC和ESC密切相關(guān)(圖8A)。相同的分析也揭示了，多潛能基因，例如CT5和CTMiPSC中的0CT4，的啟動(dòng)子上的DNA甲基化。本發(fā)明提供了一種通過I個(gè)或2個(gè)EBNAl/OriP質(zhì)粒從人類成人PB或BM CD34+細(xì)胞衍生iPSC的方法。4天培養(yǎng)和擴(kuò)增之后，用相同的質(zhì)粒組對(duì)IO6個(gè)準(zhǔn)備的細(xì)胞進(jìn)行核 轉(zhuǎn)染。在第10 12天出現(xiàn)ESC樣克隆，比那些來源于⑶34+細(xì)胞的克隆晚大約4天。在第14天進(jìn)行活細(xì)胞染色之后，可以計(jì)數(shù)TRA-1-60+重編程集落的數(shù)量(圖9A和9B)。由同樣的載體組轉(zhuǎn)染的每IO6個(gè)細(xì)胞中，成人CD34+細(xì)胞的重編程效率比CB CD34+細(xì)胞低大約20 40倍。如前所述，挑選并擴(kuò)增通過單個(gè)PEB-C5載體(即沒有Tg)從成人⑶34+細(xì)胞衍生的人類iPSC克隆。在5-12次傳代之后，對(duì)來源于PB⑶34+細(xì)胞(PCI)的一個(gè)克隆和來源于BM⑶34+細(xì)胞(BCl)的一個(gè)克隆進(jìn)一步進(jìn)行表征。人類血細(xì)胞，特別是來源于CB、成人BM和PB的HSPC富集的⑶34+組群，與年齡匹配的成纖維細(xì)胞或成人BM衍生的MSC相比，更傾向于被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和質(zhì)粒重編程。這可能是部分因?yàn)镃D34+HSPC中獨(dú)特的表觀遺傳標(biāo)記。通過三種不同的方法分析全基因組啟動(dòng)子DNA甲基化的數(shù)據(jù)，其均指向一個(gè)相似的結(jié)論，即人類CD34+HSPC與ESC/iPSC的相關(guān)性比其與成人MSC的相關(guān)性更密切(圖8)。但是，這些表觀遺傳的差異還不足以解釋所觀察到的CB和成人PB CD34+HSPC之間20 40倍的差異。一個(gè)可能的因素是CBCD34+細(xì)胞比成人CD34+HSPC增殖更快，這會(huì)通過細(xì)胞分裂依賴性的機(jī)制促進(jìn)(表觀遺傳學(xué)的)重編程。第二個(gè)促成CB⑶34+細(xì)胞較高效率的可能因素與個(gè)體發(fā)生學(xué)有關(guān)，因?yàn)檫@些細(xì)胞是來源于新生兒。更多的表觀遺傳學(xué)測(cè)量和更好的DNA甲基化覆蓋度會(huì)使我們能夠解釋支配重編程或總體細(xì)胞命運(yùn)確定的分子機(jī)制。本發(fā)明的EBNAl/OriP載體系統(tǒng)在幾個(gè)方面優(yōu)于之前的載體組合，例如6號(hào)組合。首先，PEB-C5質(zhì)粒(+/-pEB-Tg)產(chǎn)生較高百分比的TRA-1-60+前-iPSC集落，特別是在NaB存在的情況下，可促進(jìn)目標(biāo)TRA-1-60+集落的分離。其次，如果需要省略或用其他因子替換Tg，那么該平臺(tái)會(huì)更靈活。本發(fā)明提供了在其他成人體細(xì)胞類型(例如成人MSC)中的pEB-C5+/-pEB-Tg質(zhì)粒系統(tǒng)，當(dāng)在這些細(xì)胞中使用6號(hào)組合時(shí)，效率較低(每IO6個(gè)細(xì)胞< 2個(gè)集落)。本發(fā)明靈活的載體系統(tǒng)允許直接比較Tg過度表達(dá)和p53敲除對(duì)重編程的效應(yīng)。Tg可以阻斷p53和RB蛋白的功能，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，p53和RB蛋白是細(xì)胞周期進(jìn)展的主要負(fù)調(diào)控物。本發(fā)明提供了，當(dāng)使用Tg或p53shRNA進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，人類出生后的血細(xì)胞的重編程效率可以激活3 6倍(圖9和10)。重要的是，沒有觀察到基因組改變。因此，當(dāng)使用游離體介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，使用Tg或p53shRNA的益處(提高重編程效率)對(duì)比于風(fēng)險(xiǎn)(改變基因組的完整性)更有利。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明可以用單個(gè)ENBAl/OriP質(zhì)粒遞送5 6個(gè)基因以進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，使用多少因子已不再重要。本發(fā)明使用I 2個(gè)質(zhì)粒，用完整的基因組衍生出iPSC系的簡便方法相比于病毒介導(dǎo)方法的具有多種優(yōu)勢(shì)，包括將來在GMP條件下可能更易于轉(zhuǎn)換以生成臨床級(jí)別的IPSC0 一旦未分割的PBMC的培養(yǎng)有進(jìn)一步的改進(jìn)，并且有一種更有效地轉(zhuǎn)染更少細(xì)胞的方法，本發(fā)明就能提供通過EBNAl/OriP質(zhì)粒更有效和一致地重編程這些細(xì)胞的能力。從少量血液中有效地衍生出無整合的iPSC會(huì)把iPSC技術(shù)引入一個(gè)新水平。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種重編程主體血細(xì)胞的方法。所述方法包括將多種因子引入血細(xì)胞，從而將血細(xì)胞重編程為多潛能或多功能干細(xì)胞。在一方面，生成了一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系。在一方面，在血細(xì)胞中引入表達(dá)多種因子的病毒DNA構(gòu)建體。在其它方面，病毒構(gòu)建體是慢病毒構(gòu)建體或腺病毒構(gòu)建體。在另一方面，病毒DNA構(gòu)建體包括多種多潛能因子，其與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性連接，以表達(dá)所述多種多潛能基因。在另一方面，使用非病毒 構(gòu)建體在血細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述多種因子。在另一方面，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括向細(xì)胞加入至少一種皮質(zhì)類固醇。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括人工合成的糖皮質(zhì)激素。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。在另一方面，所述方法進(jìn)一步包括向細(xì)胞中加入至少一種細(xì)胞因子。在一方面，所述至少一種細(xì)胞因子選自下組睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)、以及白介素3(IL-3)。在另一方面，所述多種因子包括多潛能因子。在另一方面，血細(xì)胞為臍帶血(CB)細(xì)胞、成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+細(xì)胞、或成人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在其它方面，PBMC來源于鐮狀細(xì)胞性貧血患者。在其它另一方面，PBMC包括S⑶B003細(xì)胞。在另一方面，所述主體獲得體細(xì)胞突變。在另一方面，所述主體為哺乳動(dòng)物。在其它方面，所述主體為人類。在另一方面，所述主體有骨髓增殖性疾病(MPD)并獲得JAK2-V617F體細(xì)胞突變。在另一方面，多潛性或多功能干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。在另一方面，多種因子包括至少四個(gè)選自下組的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB,EBFU C/EBPa、C/EBP β、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在另一方面，多種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c_Myc，或其活性片段。在另一方面，多種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種重編程主體血細(xì)胞的方法。所述方法包括(a)將第一個(gè)游離型載體引入血細(xì)胞；(b)從(a)的細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系；以及(c)通過多次傳代，(b)的穩(wěn)定細(xì)胞系中失去第一個(gè)游離型載體，從而將血細(xì)胞重編程為多潛能或多功能干細(xì)胞。在一方面，所述方法進(jìn)一步包括向血細(xì)胞中引入第二個(gè)游離型載體。在其它方面，所述第二個(gè)游離型載體表達(dá)SV40T抗原(Tg)。在另一方面，所述第一個(gè)游離型載體包括多個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)多種多潛能因子。在其它方面，所述游離型載體為oriP/EBNAl質(zhì)粒。在另一方面，所述方法進(jìn)一步包括向細(xì)胞中加入至少一種皮質(zhì)類固醇。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括人工合成的糖皮質(zhì)激素。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。在另一方面，所述方法進(jìn)一步包括向(a)細(xì)胞中加入至少一種細(xì)胞因子。在一方面，所述至少一種細(xì)胞因子選自下組睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在 另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)、以及白介素3(IL-3)。在另一方面，血細(xì)胞為臍帶血(CB)細(xì)胞、成人骨髓(BM)⑶34+細(xì)胞、成人外周血(PB)細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+細(xì)胞、或成人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在其它方面，PBMC來源于鐮狀細(xì)胞性貧血患者。在其它另一方面，PBMC包括SCDB003細(xì)胞。在另一方面，所述主體為哺乳動(dòng)物。在其它方面，所述主體為人類。在另一方面，多潛能或多功能干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。在另一方面，所述第一個(gè)oriP/EBNAl表達(dá)至少四個(gè)選自下組的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB,EBFl、C/EBPa、C/EBP0、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在其它方面，所述第一個(gè)oriP/EBNAl表達(dá)0CT4、S0X2、KLF4、Myc、以及LIN28，或其活性片段。在另一方面，在步驟(c)之后，所述第一個(gè)游離型載體不管是作為游離體還是在穩(wěn)定細(xì)胞系的基因組中均檢測(cè)不到。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種建立疾病模型的方法。所述方法包括用待測(cè)試劑以如上所述任何方法接觸多潛能或多功能干細(xì)胞，并檢測(cè)待測(cè)試劑存在與待測(cè)試劑不存在時(shí)相比，功能的改變。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生主體特異性分化細(xì)胞的方法。所述方法包括對(duì)如上所述的任何方法產(chǎn)生的多潛能或多功能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，從而獲得分化細(xì)胞群。在一方面，所述分化細(xì)胞包括血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)締組織、或上皮細(xì)胞。在另一方面，所述分化細(xì)胞包括血細(xì)胞。在備選的一方面，所述分化細(xì)胞不包括血細(xì)胞。在另一方面，所述分化細(xì)胞包括胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、或骨骼肌細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種確定試劑的方法，所述試劑能改變主體特異性的分化細(xì)胞的功能。所述方法包括用待測(cè)試劑接觸上述任何方法中描述的主體特異性分化細(xì)胞，并檢測(cè)在待測(cè)試劑存在與待測(cè)試劑不存在時(shí)相比，功能的改變，從而確定所述待測(cè)試劑是改變主體特異性分化細(xì)胞的功能的試劑。在一方面，所述功能包括至少一種生物標(biāo)記的表達(dá)水平。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及多種從血細(xì)胞重編程的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞。在一方面，所述分離的多潛能或多功能干細(xì)胞根據(jù)如上所述的任何方法產(chǎn)生。在另一方面，所述分離的多潛能或多功能干細(xì)胞表達(dá)一種選自下組的細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-l-60、以及 TRA-1-81。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及多種分離的主體特異性分化細(xì)胞，其中所述主體特異性分化細(xì)胞根據(jù)如上所述的任何方法產(chǎn)生。在一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞包括血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)締組織、或上皮細(xì)胞。在額外的一方面,所述主體特異性分化細(xì)胞包括血細(xì)胞。在備選的一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞不包括血細(xì)胞。在另一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞包括胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、或骨骼肌細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及未分化的多潛能或多功能干細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包括根據(jù)如上所述任何方法產(chǎn)生的多潛能或多功能干細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及主體特異性分化細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包括根據(jù)如上所述任何方法產(chǎn)生的主體特異性分化細(xì)胞。在一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞包括血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)締組織、或上皮細(xì)胞。在其它方面，所述主體特異性分化細(xì)胞包括血細(xì)胞。在備選的一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞不包括血細(xì)胞。在另一方面，所述主體特異性分化細(xì)胞包括胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、或骨骼肌細(xì)胞。 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種治療需更換或更新細(xì)胞的疾病的方法。所述方法包括給予主體有效量的根據(jù)如上所述任何方法產(chǎn)生的多潛能或多功能干細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種治療需更換或更新細(xì)胞的疾病的方法。所述方法包括給予主體有效量的根據(jù)如上所述任何方法產(chǎn)生的分化細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種重編程非病毒游離型載體。所述非病毒游離型載體包括至少四個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少四個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)至少四種多潛能因子。在一方面，所述非病毒游離型載體包括oriP/EBNAl質(zhì)粒。在另一方面，所述非病毒游離型載體是oriP/EBNAl質(zhì)粒。在一方面，所述非病毒游離型載體包括至少五個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少五個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)至少五種多潛能因子。在另一方面，所述非病毒游離型載體包括至少六個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少六個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)至少六種多潛能因子。在另一方面，所述非病毒游離型載體包括至少七個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少七個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)至少七種多潛能因子。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種提高細(xì)胞重編程效率的方法。所述方法包括向細(xì)胞中加入至少一種皮質(zhì)類固醇。在另一實(shí)施例中，所述方法涉及一種使多潛能或多功能干細(xì)胞生成增加的方法。所述方法包括向細(xì)胞中加入至少一種皮質(zhì)類固醇。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括人工合成的糖皮質(zhì)激素。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一種皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。在另一方面，所述方法進(jìn)一步包括向細(xì)胞中加入至少一種細(xì)胞因子。在一方面，所述至少一種細(xì)胞因子選自下組睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3(IL_3)。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一種細(xì)胞因子包括睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3(IL-3)。提供了以下實(shí)施例以進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，但并不旨在限制本發(fā)明的范圍。雖然它們代表了那些可能使用的實(shí)施例，但是也可以選擇使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他程序、方法或技術(shù)。除非另有說明，否則所有引用文獻(xiàn)均參考并入。
實(shí)施例實(shí)施例I人類CD34+細(xì)胞和通過轉(zhuǎn)基因重編程人類ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基和條件人類iPS細(xì)胞的衍生、擴(kuò)增和核型分析(G帶顯帶技術(shù))的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件之前已有描述(Mali et al. (2008) Stemcells26 :1998-2005)。
來源于CB和成人BM的冷凍的人類CD34+細(xì)胞購自AllCells and Poietics (現(xiàn)在是Lonza的一部分)。在本研究中也使用了來源于在約翰霍普金斯慢性骨髓增殖性疾病中心(Moliterno et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)登記的兩名患者的之前冷凍的PB⑶34+細(xì)胞，并獲得了這兩名患者的書面同意。用G-CSF動(dòng)員之后分離的PB⑶34+細(xì)胞購自AllCells,并用作正常對(duì)照以分析基因表達(dá)。從Addgene (www. addgene. org)獲得了由Dr. Yamanaka實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的四個(gè)典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,pMXs-0ct4、pMXs-Sox2、pMXs_Klf4以及pMXs_c_Myc,其編碼(小鼠)重編程因子。由三種質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。得到逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液，這三個(gè)質(zhì)粒為一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)(重編程)載體，一個(gè)表達(dá)VSV-G包膜蛋白的質(zhì)粒和一個(gè)表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag/Pol基因的輔助質(zhì)粒。解凍后，將CD34+細(xì)胞與細(xì)胞因子SCF(100ng/ml)、FL(50 100ng/ml)和TP0(20ng/ml)培養(yǎng)2 4天，然后用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。將刺激后的⑶34+細(xì)胞(2X105)與含有4ng/ml聚凝胺的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液混合，并用相同的培養(yǎng)基和三種細(xì)胞因子培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)和培養(yǎng)2 3天之后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后的第5天以4X IO5細(xì)胞/孔的密度置于6孔板中。在預(yù)鋪板的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)滋養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，以進(jìn)行與之前描述相似的重編程(Mail et al. (2008) Stem Cells 26:1998-2005)。在第 7 天，使用 hES 細(xì)胞培養(yǎng)基直到最后。實(shí)施例2對(duì)未分化的iPS細(xì)胞及其衍牛物講行免疫染色TRA-1-60 活細(xì)胞染色在 hES 培養(yǎng)基中稀釋 TRA-1-60 抗體(Millipore，l 300)和Alexa555-結(jié)合二抗抗鼠IgM(Invitrogen, I : 400),并將其加入重編程板。將平板在37°C下孵育I小時(shí)，然后將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r的條件培養(yǎng)基。在倒置熒光顯微鏡下鑒定TRA-1-60陽性集落。按照之前描述的方法，對(duì)iPS克隆進(jìn)行未分化標(biāo)記物的免疫染色，并在胚狀體(EB)形成之后，對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫染色(Mail et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ；Chen et al. (2008)Cell Stem Cell 2 :345-55 ；Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2 461-71)。實(shí)施例3多潛能性的畸胎瘤形成試驗(yàn)
通過膠原酶IV (Sigma)消化獲取三至五百萬iPS細(xì)胞，用PBS洗滌，在200 μ L稀釋(I I)基質(zhì)膠溶液中重懸浮。將細(xì)胞經(jīng)肌肉內(nèi)注射進(jìn)入Rag-/-Y C-/-小鼠，或其他改良的天然殺傷細(xì)胞水平進(jìn)一步降低的免疫缺陷小鼠體內(nèi)。注射6 10周之后切除腫瘤。如前所述進(jìn)行組織學(xué)處理(Mail et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ;Chen et al. (2008)Cell Stem Cell2 :345-55 ;Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71)。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦條件，使用Trizol試劑(Invitrogen)提取畸胎瘤RNA。如前所述對(duì)AFP、CD34、PAX6、0CT4 和 NANOG 人類基因進(jìn)行 RT-PCR(MaiI et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ;Chenet al. (2008)Cell Stem Cell 2 :345-55 ;Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71)。實(shí)施例4DNA指紋圖譜和TAK2V617F等位某閔分析根據(jù)所述方法,進(jìn)行基因組DNA分離，并使用Invitrogen的用于PCR的MapPairs引物測(cè)定DNA指紋圖譜。如前所述，使用JAK2-V617F的定制TaqMan SNP基因分型試驗(yàn)(Applied Biosystems)進(jìn)行 JAK2 等位基因分析(Moliterno et al. (2006)Blood 108 3913-15 ；Molitemo et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)。實(shí)施例5分化和數(shù)據(jù)分析造血分化和分析通過改進(jìn)的EB形成方法(稱為spin-EB)和在無滋養(yǎng)細(xì)胞和無血清的條件下進(jìn)行造血分化，檢查⑶34+細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞的造血分化潛能，方法與之前描述的相似(Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71 ；Ng et al. (2005)Blood 106 1601-03 ；Ng etal(2008)NatProtoc. 3 :768-76)。在第 2 3 周之間收獲 EB，并如前所述，通過造血集落形成實(shí)驗(yàn)和FACS，分析是否存在造血標(biāo)記(Yu et al. (2008) Cell Stem Cell2 :461-71 ；Zhan et al. (2004) Lancet 364 :163-71)。如前所述，使用細(xì)胞離心涂片器(Zhanet al. (2004) Lancet364 :163-71),并用 Hema 3 染色組合(Fisher Diagnostics)染色載玻片。液體培養(yǎng)基中的紅系分化和擴(kuò)增spin-EB造血分化之后二至三周，用FACS分選從年齡匹配的正常iPS EB和PV-iPS EB，從中收集CD34+CD45+細(xì)胞群。在含有SCF(20ng/ml)、IL-3(50ng/ml)和EP0(lU/ml)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 X IO4個(gè)CD34+CD45+細(xì)胞。在第7天收獲細(xì)胞，并計(jì)數(shù)相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。也用抗⑶235a抗體(BD Biosciences)和抗⑶45抗體(Invitrogen)將分化的細(xì)胞染色，以進(jìn)行FACS分析。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)和統(tǒng)計(jì)對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)分析，收集并分析至少10，000個(gè)事件。顯示了總活細(xì)胞中所選細(xì)胞群的百分比(基于使用同種型配對(duì)的抗體時(shí)與顯示的背景染色的對(duì)比)。直方圖中顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。當(dāng)復(fù)制次數(shù)(η)較小時(shí)(η < 10)，應(yīng)用Wilcoxon雙樣本檢驗(yàn)。用SAS 9. I包(SAS Institute, Cary, NC, USA)在無監(jiān)督下進(jìn)行該檢驗(yàn)。如果P為O. 05或更小，結(jié)果就判斷為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例6基因表汰的定量實(shí)時(shí)PCR分析EB介導(dǎo)的造血分化(21天)之后，分選來源于正常BM⑶34+細(xì)胞衍生的iPS和MPD183CD34+細(xì)胞衍生的iPS的CD34+CD45+細(xì)胞，并根據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen)的方案使用Trizol試劑對(duì)其進(jìn)行RNA提取。使用隨機(jī)的六聚物制備cDNA，并使用由AppliedBiosystems供應(yīng)的針對(duì)核因子I-B(NFI-B)、血紅蛋白(HBG)、和血紅蛋白-β (HBB)基因的引物和探針進(jìn)行定量PCR。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR0使用人類白血病細(xì)胞系DAMI生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。用相同細(xì)胞樣品中的β-acin對(duì)單個(gè)基因的表達(dá)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例7臍帶血和成人CD34+細(xì)胞的重編程為了檢測(cè)出生后的人類血細(xì)胞能否通過常規(guī)的四種重編程因子進(jìn)行重編程，測(cè)試了從CB和成人BM純化的、在培養(yǎng)基中顯示出廣泛的增殖潛能的⑶34+細(xì)胞(Novelli etal. (1999)Hum Gene Ther. 10 =2927-40)。將CD34+細(xì)胞解凍，培養(yǎng)并活化2 4天以刺激細(xì)胞增殖(Novelli et al. (1999) Hum Gene Ther. 10 :2927-40)，然后用 4 種標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(Takahashi et al. (2007)Cell 131 :861-72)。在CB樣品中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因之后大約第16天，以及在成人BM CD34+細(xì)胞中大約第21天，出現(xiàn)了與人類ES/iPS細(xì)胞相 似的集落。一周之后，用TRA-1-60抗體對(duì)整個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行活細(xì)胞染色，抗體可以識(shí)別未分化的hES和iPS細(xì)胞上的細(xì)胞表面表位。本發(fā)明提供了，在CB⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)之后3 4周，活的培養(yǎng)物可以被TRA-1-60抗體染色?？梢栽诘?周首次見到TRA-1-60+集落，并在第4周挑選(再次染色之后)。本發(fā)明提供了，TRA-1-60染色也是一種簡便、可靠的鑒定人類血細(xì)胞衍生的候選iPS集落的方法。BM⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)之后4周，用TRA-1-60和第二熒光試劑進(jìn)行活細(xì)胞染色之后，可以識(shí)別出多個(gè)集落。小部分形成的集落是TRA-1-60+。單獨(dú)挑選出TRA-1-60+集落并生成iPS克隆。擴(kuò)增之后，挑選的TRA-1-60陽性的克隆顯示出特征性的hES/iPS細(xì)胞形態(tài)，并表達(dá)了包括TRA-1-60在內(nèi)的其他多潛能標(biāo)記?？梢杂^察到從CB擴(kuò)增的iPS細(xì)胞的免疫熒光染色圖像。除了 TRA-1-60，它們也表達(dá)其他多潛能標(biāo)記，包括NANOG和SSEA4。它們不再表達(dá)⑶34或⑶45標(biāo)記，反而從內(nèi)源性的基因座表達(dá)0CT4和NANOG基因(圖I)。擴(kuò)增> 9代之后，檢查的多個(gè)iPS系仍保持正常的核型。通過分化實(shí)驗(yàn)，例如體外胚狀體(EB)形成和體內(nèi)畸胎瘤形成，證明了這些iPS克隆的多潛能性，其生成了由三個(gè)胚層衍生的多種細(xì)胞類型。通過胚狀體(EB)形成(10天)并進(jìn)行體外分化之后，可以觀察到CB衍生的iPS細(xì)胞的分化潛能，可以觀察到內(nèi)胚層的AFP染色，中胚層的CD34染色和外胚層的b-III微管蛋白染色。另外，CB衍生的iPS細(xì)胞形成畸胎瘤之后，可以觀察到體內(nèi)的分化潛能。切片之后，各種載玻片的蘇木精-伊紅染色可以顯示來源于三個(gè)胚層的各種組織腸上皮(內(nèi)胚層)、軟骨(中胚層)和糖原生成上皮(外胚層)。免疫熒光染色之后，可以看見表達(dá)AFP、⑶34和β-III微管蛋白(一種外胚層標(biāo)記)的分化細(xì)胞。將特定染色的圖像與細(xì)胞核的DAPI染色疊加。因此，由人類CB和成人BM⑶34+細(xì)胞系衍生的iPS細(xì)胞在形態(tài)上、表型上和功能上均與hES細(xì)胞和成纖維細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞相似。由MPD患者的外周血細(xì)胞衍生的人類iPS細(xì)胞系測(cè)試了從兩名MPD患者(沒有G-CSF 動(dòng)員)的外周血中分離的 CD34+細(xì)胞(Moliterno et al. (2008)Exp Hemotal. 36 :1480-86)。在> 95%的PV患者、大約50%的ET和PMF患者的血細(xì)胞中，具有JAK2基因的獲得性常見體細(xì)胞突變(1849G > T，導(dǎo)致使細(xì)胞內(nèi)激酶活化的V617F替換)(James etal. (2005)Nature434 :1144-48 ；Kralovics et al. (2005)N. Engl J Med. 352 :1779-90 ；Levine et al. (2005 ；Cancer Cell 7 :387-97 ；Zhao et al. (2005)J. Biol. Chem. 280 22788-92 ;Baxter et al. (2005)Lancet365 :1054-61 ；Moliterno et al. (2006)Blood108 :3913-15 ；Levine and Gi11iland (2008)Bloodl12 :2190-98 ;Skoda R. (2007)Hematology Am Soc Hemotol Educ Program 1-10)。在兩名 MPD 患者(伴有 PV 的 MPD183和伴有PMF的MPD562)的PB⑶34+細(xì)胞中，100 %的集落形成紅系祖細(xì)胞都具有雜合的JAK2-V617F 基因型(Moliterno et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)。使用相同的定量等位基因特異性 PCR 分析(Moliterno et al. (2006)Bloodl08 :3913-15 ；Moliterno etal. (2008) Exp Hematol. 36 :1480-86)，本發(fā)明提供了，突變的(1849T 導(dǎo)致 V617F) JAK2 等位基因在每名患者的解凍的⑶34+細(xì)胞中的百分比為大約50% (表I)。應(yīng)用在正常人類CD34+細(xì)胞中使用的相同的重編程方案，本發(fā)明提供了來源于兩名患者中每一名的多個(gè)iPS克隆(表I)。所有成功擴(kuò)增的iPS克隆對(duì)于JAK2-V617F均是雜合的，這與親代CD34+細(xì)胞相同(表I)。與由成纖維細(xì)胞和正常CD34+細(xì)胞衍生的人類iPS細(xì)胞相似，擴(kuò)增的JAK2-V617F iPS克隆可以展現(xiàn)出特征性的未分化的hES/iPS細(xì)胞形態(tài)和標(biāo)記物的表達(dá)。對(duì)由MPD 183衍生的代表性iPS系(克隆8)的不同集落進(jìn)行免疫染色，顯示其表達(dá)了未分化的細(xì)胞標(biāo)記TRA-1-60、SSEA4和NAN0G。在EB形成和畸胎瘤形成后對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行分析，揭示其存在來源于三個(gè)胚層的各種細(xì)胞類型，表明這些患者特異性 iPS系具有多潛能性。與之前對(duì)人類ES細(xì)胞和其他(正常)iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)一樣，本發(fā)明提供了在EB形成(第10天)之后，對(duì)來源于MPD183(iMPD183.C8)的iPS克隆8進(jìn)行的多潛能性試驗(yàn)，其顯示了 JAK2-V617F iPS細(xì)胞也可以分化為表達(dá)三個(gè)胚層標(biāo)記的各種細(xì)胞類型。在EB介導(dǎo)的分化之前和之后，從第二名MPD患者(iMPD562. C3)的iPS克隆3中也獲得了相似的結(jié)果。本發(fā)明也提供了，由MPD 183衍生的iPS細(xì)胞在畸胎瘤形成之后的體內(nèi)分化潛能。切片之后，各種載玻片的蘇木精-伊紅染色可以顯示來源于三個(gè)胚層的各種組織腸上皮(內(nèi)胚層)、軟骨(中胚層)和糖原生成上皮(外胚層)。通過G帶顯帶分析顯示，來源于兩名MH)患者的擴(kuò)增的JAK2-V617F iPS細(xì)胞系具有正常的核型?？梢杂^察到，來源于兩名女性MPD患者(MPD 183和MPD562)的擴(kuò)增的iPS系分別在10和11代之后仍保持正常的核型(46，XX)。血細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞的定向造血分化通過改進(jìn)的EB形成方法和無滋養(yǎng)層和無血清條件下的分化，檢查正常的和PV⑶34+細(xì)胞衍生的人類iPS細(xì)胞的造血分化潛能(Yu et al. (2008)CelI Stem Cell 2 :461-71 ；Ng et al. (2005)Blood 106 :1601-03 ；Ng etal. (2008)Nat Protoc. 3 :768-76)。到第2周，很多與造血細(xì)胞相似的小細(xì)胞長出EB0正常對(duì)照(NC)和成人CD34+細(xì)胞或PV CD34+細(xì)胞衍生的人類iPS細(xì)胞可以置于微量滴定孔中，并聚集以進(jìn)行EB形成和定向造血分化。大約10 14天之后，可以發(fā)現(xiàn)EB周圍出現(xiàn)大量與未成熟的造血細(xì)胞相似的小圓細(xì)胞，并在接下來的幾天中增長。隨后收集這些細(xì)胞，并用造血集落形成實(shí)驗(yàn)和FACS，分析造血標(biāo)記是否存在。隨后收集全部細(xì)胞，并分析是否存在造血標(biāo)記，以及在半固體甲基纖維素培養(yǎng)基中(正常對(duì)照iPS和PV-iPS)是否存在造血集落形成單位(CFU)。再培養(yǎng)10 14天之后，可以在培養(yǎng)基中觀察到CFU-粒細(xì)胞/單核細(xì)胞和CFU-紅系集落。使用從NC和PV樣品中純化的⑶34+⑶45+細(xì)胞，進(jìn)行了一次相似的CFU測(cè)定。本發(fā)明提供了，從正常⑶34+細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞產(chǎn)生的髓系和紅系集落中挑選單個(gè)集落，在離心涂片之后進(jìn)行賴-吉染色?？梢杂^察到與幼紅細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的多個(gè)譜系相似的細(xì)胞。使用hES細(xì)胞可以如之前一樣檢測(cè)出髓系和紅系集落(Zhan et al. (2004)Lancet 364 :163-71)。使用分化的iPS細(xì)胞產(chǎn)生的純化⑶34+⑶45+細(xì)胞證實(shí)了這一點(diǎn)，所述分化的iPS細(xì)胞衍生自正?；騊V⑶34+血細(xì)胞。挑選的造血集落中的單個(gè)細(xì)胞的染色證實(shí)了各種髓系和紅系細(xì)胞類型的存在。表I.衍生自MPD患者的iPS細(xì)胞系的JAK2-V617F基因分型
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生多潛能或多功能干細(xì)胞的方法，包括向培養(yǎng)基中的血細(xì)胞中引入含有至少一種多潛能因子的非病毒載體，從而將所述血細(xì)胞重編程為多潛能或多功能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述載體包括多個(gè)多潛能基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，進(jìn)一步包括向所述培養(yǎng)基中加入至少一種皮質(zhì)類固醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述至少一種皮質(zhì)類固醇選自下組醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、氟氫可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、以及曲安西龍。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一種皮質(zhì)類固醇為地塞米松。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的方法，進(jìn)一步包括向所述培養(yǎng)基中加入至少一種細(xì)胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述至少一種細(xì)胞因子選自下組睪丸支持細(xì)胞因子(SCF)、Fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述血細(xì)胞為臍帶血(CB)細(xì)胞、成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+細(xì)胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+細(xì)胞、或成人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述主體為哺乳動(dòng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其中所述主體為人類。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多潛能或多功能干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其中所述主體有骨髓增殖性疾病(MPD)。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種多潛能因子包括至少三個(gè)選自下組的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB, EBFU C/EBPa、C/EBP P、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c-MYC，或其活性片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述非病毒載體為游離型載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括向所述血細(xì)胞中引入第二個(gè)游離型載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第二個(gè)游離型載體表達(dá)SV40T抗原(Tg)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第一個(gè)游離型載體包括多個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性連接以表達(dá)所述因子。
20.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述游離型載體為oriP/EBNAl質(zhì)粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述PBMC來自鐮狀細(xì)胞性貧血患者。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述PBMC包括S⑶B003細(xì)胞。
23.一種確定對(duì)主體細(xì)胞有療效的試劑的方法，包括用待測(cè)試劑接觸如權(quán)利要求I或.20所述的多潛能或多功能干細(xì)胞，并檢測(cè)在待測(cè)試劑存在與待測(cè)試劑不存在時(shí)相比，功能的改變。
24.一種產(chǎn)生分化細(xì)胞的方法，包括對(duì)由權(quán)利要求I所述方法產(chǎn)生的多潛能或多功能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，從而獲得分化細(xì)胞群。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分化細(xì)胞包括血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、結(jié)締組織、心肌細(xì)胞、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、成腎細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、心臟細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述分化細(xì)胞包括胰腺P細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法產(chǎn)生的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞的富集細(xì)胞群。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞，其中所述分離的多潛能或多功能干細(xì)胞表達(dá)選自下組的細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、以及TRA-1-81。
29.一種需更換或更新細(xì)胞的疾病的治療方法，包括給予主體有效量的根據(jù)權(quán)利要求I產(chǎn)生的多潛能或多功能干細(xì)胞。
30.一種重編程的非病毒游離型載體，包括至少五個(gè)多潛能基因，所述多潛能基因與至少一個(gè)調(diào)控序列操作性連接，以表達(dá)至少五種多潛能因子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的載體，其中所述載體為oriP/EBNAl質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明是基于臍帶血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞可以重編程為早期干細(xì)胞的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了對(duì)來源于主體的CB和成人骨髓(BM)CD34+細(xì)胞的重編程，且無需任何預(yù)處理。提供了重編程主體血細(xì)胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和產(chǎn)生主體特異性分化細(xì)胞的方法。另外，本發(fā)明提供的方法可用于識(shí)別試劑，所述試劑能改變主體特異性的分化細(xì)胞的功能，以及改變由血細(xì)胞重編程獲得的分離的多潛能或多功能干細(xì)胞的功能。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102803476SQ201080051633
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月14日
發(fā)明者程臨釗 申請(qǐng)人:程臨釗