專利名稱：用于鑒別和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法
用于鑒別和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于篩選、表征和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，由此獲得的 ω-轉(zhuǎn)氨酶及其在各種氨基轉(zhuǎn)移過程中的應(yīng)用。手性胺在制藥、農(nóng)用化學(xué)和化學(xué)工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。它們常被用作中間體或合成子(synthones)以制備各種生理學(xué)，如藥學(xué)活性物質(zhì)，如頭孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性胺的眾多應(yīng)用中，僅有一種特定的光學(xué)活性形式((R)或(S)對(duì)映體)具有生理學(xué)活性。因此，需要提供一種制備光學(xué)活性形式的手性胺的方法。這些需求通過以下方法得到部分滿足，即通過加入手性羧酸使非對(duì)映體鹽結(jié)晶來制備手性胺(Breuer et al.，Angewandte Chemie (2004) 116，806-843)。其它化學(xué)方法使用通過還原含C = N雙鍵的前手性前體的對(duì)映選擇性合成。在已用于合成光學(xué)活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光學(xué)活性胺的不對(duì)稱合成的潛力，ω-轉(zhuǎn)氨酶(ω-TAs)最近已得到更多關(guān)注，其常被用作多種藥物制備的結(jié)構(gòu)單元(building blocks)。ω -轉(zhuǎn)氨酶是PLP (磷酸吡哆醛)依賴性酶，其催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)采用ω -轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，主要可經(jīng)由兩種反應(yīng)策略來制備所謂的對(duì)映體富集和/或純光學(xué)活性胺(i)從酮起始的不對(duì)稱合成，和(ii)從外消旋胺起始的動(dòng)力學(xué)拆分。雖然ω-轉(zhuǎn)氨酶總體上顯示出良好的對(duì)映選擇性，但它們尚未被頻繁地用在不對(duì)稱合成中，盡管在不對(duì)稱合成中理論上可能的產(chǎn)率是100%。使用ω-轉(zhuǎn)氨酶的不對(duì)稱合成的一個(gè)特殊要求是平衡向產(chǎn)物側(cè)移動(dòng)，特別是當(dāng)使用諸如丙氨酸等氨基酸作為氨基供體時(shí)，因?yàn)樵诖饲闆r下平衡狀態(tài)在底物 (酮、丙氨酸)側(cè)，而不在產(chǎn)物(胺、丙酮酸鹽)側(cè)；另一個(gè)要求是酶必須具有最佳的對(duì)映選擇性，而ω-轉(zhuǎn)氨酶并非一向如此。因此，ω-轉(zhuǎn)氨酶主要用于外消旋胺的動(dòng)力學(xué)拆分，其中不需要最佳的對(duì)映選擇性。因此，雖然已經(jīng)研究了外消旋胺的動(dòng)力學(xué)拆分，但50%最大產(chǎn)率的限制很大程度上阻礙了其應(yīng)用。另一方面，不對(duì)稱合成需要將不利的平衡向合成光學(xué)純胺的單個(gè)對(duì)映體的方向移動(dòng)，這是能夠在工業(yè)規(guī)模上使用轉(zhuǎn)氨酶的有效方法的一個(gè)重要先決條件。WO 2007/093372公開了這類方法。EP 0 987 332 Al公開了通過微生物酶，特別是源自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.) 的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶來制備光學(xué)活性氨基化合物，8卩(R)-氨基化合物的方法。EP 1 038 953 Al公開了另一種(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，但其源自金色分支桿菌(Mycobacterium aurum)。Iwasaki 等(Biotechnol. Let. 2003 (25) , 1843-1846) , Koszelewski 等 (Adv. Synth. Catal. 2008 (350),2761-2766)禾口 Iwasaki 等(Appl.Microbiol. Biotechnol. 2006 (69), 499-505)公開了源自節(jié)桿菌的R-特異性轉(zhuǎn)氨酶。通常通過選擇得自于如土壤樣品的微生物并在培養(yǎng)中將其富集來完成提供有用(S)-或(R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的微生物的鑒別(Jun 等，App. Microbiol. Biotechnol. 2004(70)，2529-2534 和 Shin 等(Biosc. Biotechnol. Biochem. 2001 (65)，1782-1788))。特別地，全部所述的 R-選擇性 ω_轉(zhuǎn)氨酶均通過富集培養(yǎng)獲得。此種方法耗時(shí)，這是因?yàn)閷?duì)于有效的方法，通常優(yōu)選在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)等異源生物體中過表達(dá)酶。這需要從野生型生物體中分離基因序列，但DNA序列的克隆不總能成功并且是極為耗時(shí)的過程。特別地，在工藝開發(fā)和新型ω-ΤΑ的鑒別期間，酶的純化及其酶促性質(zhì)的表征很受人關(guān)注。然而，由于通常通過諸如HPLC或毛細(xì)管電泳(CE)等低通量方法確定ω-ΤΑ活性，所以在一定程度上，酶性質(zhì)的確定通常是限速步驟。通常，相比于(S)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，可用的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的數(shù)量更受限制。這與對(duì)(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的高需求形成了鮮明的對(duì)比，所述(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶對(duì)于各種手性胺的(R)-對(duì)映體的不對(duì)稱合成非常適合。因此，仍需要提供其他(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶以及獲得它們的裝置和方法，從而產(chǎn)生諸如用于制藥或農(nóng)用化學(xué)應(yīng)用中的 R-對(duì)映體，特別是光學(xué)活性胺，但這些至今仍根本無法獲得或無法以經(jīng)濟(jì)上可行的方法，優(yōu)選以工業(yè)規(guī)模獲得。因此，基于以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了簡單、快速和可靠的裝置和方法，以鑒別、 表征和獲得(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，特別是用于生產(chǎn)所需的(R)-對(duì)映體，優(yōu)選光學(xué)純形式，所述裝置和方法優(yōu)選適用于工業(yè)規(guī)模的鑒別、表征和制備。本發(fā)明通過提供獨(dú)立權(quán)利要求中的教導(dǎo)，特別是所要求保護(hù)的方法以及由此獲得的產(chǎn)品和應(yīng)用解決了其技術(shù)問題。因此，在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的教導(dǎo)提供了用于制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶 (也稱為ω-ΤΑ)的方法，其包括以下步驟a)提供至少一種轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶，優(yōu)選屬于折疊IV型的PLP依賴性酶(fold-type IV of PLP-dependent enzymes)的轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列(query biomolecule sequence),禾口至少一個(gè)生物分子庫，b)用所述查詢生物分子序列檢索所述生物分子庫，以鑒別出第一靶生物分子序列組，其中以氨基酸水平計(jì)算，所述第一靶生物分子序列與所述查詢生物分子序列具有至少 20%，優(yōu)選32%的序列相同性，c)在所述第一靶生物分子序列組中選擇第二生物分子靶序列組，所述第二生物分子靶序列組在氨基酸水平上不包含以下氨基酸序列基序(Hiotives)Cl)至c3)中的至少一種，其中cl)在95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal為氨基酸Ile、Val、Leu、 Met、Phe，且Xa2為氨基酸Arg或Lys，或者c2)在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa為氨基酸，優(yōu)選為常規(guī)氨基酸，和在105位至111位，優(yōu)選在107位至109位區(qū)域中的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3為氨基酸，優(yōu)選為His，或者c3)在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5， 其中Xa4為氨基酸，優(yōu)選為Gly，且Xa5為氨基酸，優(yōu)選為Tyr，而包含c4)在95位除Tyr、Arg、Lys外的另一種氨基酸，或在95位的Tyr，但在97位無 Arg 或 Lys,且 c5)在 40 位無 Lys 或 Arg，且 c6)在161位至165位區(qū)域中，優(yōu)選在163位的Lys，
以鑒別出第二靶生物分子序列組，和d)提供，優(yōu)選制備這樣的生物分子，其具有在步驟C)中鑒別的第二生物分子靶序列，且為具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白或至少部分編碼具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。術(shù)語“為……或至少部分編碼蛋白的生物分子”優(yōu)選是指所述生物分子可為具有 (R)-選擇性ω -轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白，或在此生物分子為核苷酸序列的情況下，至少部分的所述核苷酸序列編碼所述蛋白，優(yōu)選全長蛋白。因此，在所提供的生物分子為核苷酸序列分子的情況下，至少部分的所述核苷酸序列編碼具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白，因此可能另一部分的所述核苷酸分子具有一些其它功能，如調(diào)節(jié)或復(fù)制功能。因此，術(shù)語“提供這樣的生物分子，其具有在步驟C)中鑒別的第二生物分子靶序列，且為具有(R)-選擇性 ω_轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白或至少部分編碼具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白”優(yōu)選等同于術(shù)語“提供這樣的生物分子，其具有在步驟c)中鑒別的第二生物分子靶序列，所述生物分子可為具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白，或可為包含編碼所述蛋白的序列的核苷酸序列分子，只要所述蛋白具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶”。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟c2)中，Arg Xaa Xa3_基序可與107位至109 位相差1-2個(gè)氨基酸，即Arg Xaa Xa3-基序可在105位至111位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟c6)中，Lys的位置可與163位相差1_2個(gè)氨基酸，即Lys可在161位至165位。在本發(fā)明上下文中，除非另有說明，所給出的每個(gè)氨基酸序列，無論使用何者，特別是給出的氨基酸序列基序，或DNA序列或DNA序列基序，都是從氨基端至羧基酸，或5'至 3'方向。優(yōu)選地，無論使用何者，以給定方向給出的序列均作為連續(xù)片段給出，而沒有任何插入的核苷酸或氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟a)中所使用的至少一種轉(zhuǎn)氨酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列優(yōu)選為(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟a)中所使用的至少一種轉(zhuǎn)氨酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列選自(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶、支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(BCAT)和D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(DATA)。優(yōu)選地，所述支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來自大腸桿菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟a)中所使用的至少一種裂解酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列為氨基脫氧分支酸裂解酶(ADCL)。本發(fā)明提供了以快速、有效、簡單、可靠且簡便的方式制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法。因此，本發(fā)明能夠鑒別并制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，這是以前不知道或無法達(dá)到的，由此獲得了提供手性胺，優(yōu)選(R)-對(duì)映體的多種途徑，特別是非常有效的不對(duì)稱合成途徑。與預(yù)期相反，其能夠成功地顯示，事實(shí)上即便是與已知的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶具有低序列相同性，如僅35%序列相同性的蛋白也為(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。優(yōu)選地，本發(fā)明能夠以特別有利且預(yù)想不到的方式提供了來自土曲霉(Aspergillus terreus)和百脈根根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，其中來自曲霉(Aspergillus) 的轉(zhuǎn)氨酶為第一真核生物ω-轉(zhuǎn)氨酶且以(R)-選擇性的方式轉(zhuǎn)化底物。基本上，本發(fā)明基于以下教導(dǎo)即便是與已知轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶，特別是(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶具有低序列相同性的蛋白或其編碼核苷酸序列也能用作潛在來源以鑒別和制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，其中通過區(qū)分不希望的蛋白并由此陽性選擇在氨基酸序列中顯示導(dǎo)致所需酶促活性的特定序列基序的蛋白來篩選和制備推定的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。因此，本發(fā)明具體地使用了特定的結(jié)構(gòu)特征，特別是推定的(R)-選擇性ω-ΤΑ中特定氨基酸的缺失和存在，以鑒別和制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。因此，在本發(fā)明方法的第一步驟a)中，提供了至少一種轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶，如已知的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的查詢生物分子序列，或至少此類裂解酶或轉(zhuǎn)氨酶，優(yōu)選(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的特征序列部分，其特別優(yōu)選能夠鑒別折疊IV型的PLP依賴性酶，以及至少一種生物分子庫。優(yōu)選地，查詢生物分子序列為轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶，特別為(R)-選擇性 ω-ΤΑ的ORF(開放閱讀框)，其編碼核苷酸序列或其特征部分。在另一實(shí)施方式中，查詢生物分子序列為ORF-氨基酸序列本身或其特征部分。在本發(fā)明的上下文中，至少一種轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶，特別是已知的(R)-選擇性 ω-轉(zhuǎn)氨酶的查詢生物分子序列的特征部分為這樣的生物分子序列，其DNA序列分子的形式在以下條件下與全長查詢生物分子序列，特別是與ORF的DNA序列雜交。用于諸如DNA等核酸雜交的方法是已知的，且描述在如Molecular Cloning, Third Edition(2001) ；Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994)； Immunology methods manual, Academic Press (Molecular)禾口許多其它標(biāo)準(zhǔn)教材中。嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的實(shí)例如下。在42°C下，將其上固定有核酸的濾器和用作探針的核酸在包含50%甲酰胺、5XSSC(750mM氯化鈉和75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6)、 5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/Ι變性鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜。孵育后，將濾器用0.2 X SSC溶液(約65°C)中清洗。可通過調(diào)節(jié)甲酰胺濃度(隨著甲酰胺濃度降低，條件變得較不嚴(yán)謹(jǐn))以及改變鹽濃度和溫度條件來修改這些嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件。在較不嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交通過例如在37°C下，將其上固定有核酸的濾器和用作探針的核酸在包含6XSSCE(20XSSCE :3mol/l氯化鈉、0. 2mol/l磷酸二氫鈉和0. 02mol/l EDTA, pH 7. 4)、0. 5% SDS.30%甲酰胺和100 μ g/1變性鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜， 并將濾器用含0. 1% SDS的IX SSC溶液(50°C )清洗來進(jìn)行。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明將術(shù)語“至少一種轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列”理解為這樣的生物分子序列，其適合用于根據(jù)本文定義的序列基序Cl) 至c6)的存在或缺失來選擇生物分子序列。因此，這類查詢生物分子序列為用于篩選和鑒別下述生物分子序列的序列，所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含氨基酸序列基序 cl)至c3)中的至少一個(gè)，且在氨基酸水平上包含序列基序c4)、c5)和c6)。這類查詢生物分子序列可體現(xiàn)為氨基酸序列信息、或DNA序列分子、或DNA序列信息。在優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟a)所用的查詢生物分子序列的特征部分包含，優(yōu)選由以下組成轉(zhuǎn)氨酶，優(yōu)選(R)"選擇性ω -轉(zhuǎn)氨酶，或裂解酶的ORF的30位至170位區(qū)域，最優(yōu)選30位至120位。在隨后的步驟b)中，使用所述查詢生物分子序列檢索所述生物分子庫以鑒別出第一靶生物分子序列組，基于氨基酸水平，所述第一靶生物分子序列組與所述查詢生物分子序列具有至少20%的的序列相同性，優(yōu)選25%，優(yōu)選32%，優(yōu)選至少33%，最優(yōu)選34%， 至少35 %，至少36 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %和至少80 %，至少90 %或至少95%的序列相同性，且其中所述第一靶生物分子組代表從步驟a)中所用生物分子庫的第一次選擇。所述的序列相同性優(yōu)選為所述查詢生物分子序列的ORF的至少特征部分，優(yōu)選基本完整，特別是完整ORF的至少特征部分與所篩選生物分子序列的ORF的至少特征部分，優(yōu)選基本完整，特別是完整ORF的至少特征部分之間的序列相同性。在所述步驟b) 后，在此第一靶生物分子序列組中，在步驟c)中選擇那些序列，其不包含95位至97位的作為序列基序cl)的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal為氨基酸lie、Val、Leu、Met、Phe, 且Xa2為氨基酸Arg或Lys ；或者其不包含97位至99位的作為序列基序c2)的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa為氨基酸，優(yōu)選常規(guī)氨基酸，且在105位至111位，優(yōu)選107位至 109位區(qū)域中，且不包含氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3為氨基酸，優(yōu)選常規(guī)氨基酸，優(yōu)選His ；或者其不包含序列基序c3) 38位的Thr、97位的Lys和107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4為氨基酸，優(yōu)選常規(guī)氨基酸，優(yōu)選Gly，且Xa5為氨基酸，優(yōu)選常規(guī)氨基酸，優(yōu)選Tyr，以此來區(qū)分和排除體現(xiàn)出以上確定的序列基序cl)、c2)或c3)中至少一個(gè)的那些序列。在隨后或同時(shí)進(jìn)行的選擇中，選擇以下那些生物分子序列，所述生物分子序列根據(jù)序列基序c4)在95位顯示為除Tyr、Arg、Lys外的其它氨基酸，或在95位顯示為 Tyr,但在97位不為Arg和Lys，且根據(jù)序列基序c5)在40位不為Lys和Arg，且根據(jù)序列基序c6)在161位至165位的區(qū)域中具有至少一個(gè)Lys，優(yōu)選為一個(gè)Lys，優(yōu)選在163位為 Lys,以此選擇和鑒別出第二生物分子靶序列組。由上述確定的序列基序鑒別和篩選出的第二靶生物分子序列組代表作為具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白或編碼具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白的生物分子，從而提供所述具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。在本發(fā)明的上下文中，轉(zhuǎn)氨酶為催化氨基轉(zhuǎn)移的磷酸吡哆醛依賴性酶，其優(yōu)選屬于折疊IV型。轉(zhuǎn)氨酶歸類為Ε. C. 2. 6.1. X。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)氨酶為 (R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，在優(yōu)選實(shí)施方式中，特別地為ω-轉(zhuǎn)氨酶。在本發(fā)明的上下文中，具有 (R)“選擇性ω -轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白為下述蛋白，其能夠在適合反應(yīng)條件下催化諸如氨基等含氮基團(tuán)從供體向受體的轉(zhuǎn)移，例如(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶(β-丙氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶) 即能如此。在本發(fā)明的上下文中，(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶優(yōu)選為分類編號(hào)Ε. C. 2. 6. 1. 18的酶。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“光學(xué)活性的手性胺”與術(shù)語“對(duì)映體活性的手性胺”涉及相同的主題。這些術(shù)語特別是指基本上不含不良對(duì)映體的制備物，且在更優(yōu)選的實(shí)施方式中是指不含不良對(duì)映體的制備物。因此，光學(xué)活性的手性胺基本上包含過量的一種對(duì)映體，或甚至僅由一種對(duì)映體組成。特別地，在本發(fā)明的上下文中，光學(xué)活性的手性胺具有至少70%、80%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%和特別是至少99. 9%的光學(xué)純度。在本發(fā)明中，光學(xué)純度表示為一種對(duì)映體超過另一種對(duì)映體的過量％。因此，光學(xué)純度％為(R)對(duì)映體和(S)對(duì)映體濃度之差除以兩種對(duì)映體濃度之和(Α的光學(xué)純度％ = ([A]-[B]) ([Α] + [Β])χ 100，其中A和B代表(R)對(duì)映體和⑶對(duì)映體的濃度，反之亦然)。在本發(fā)明的上下文中，生物分子庫為生物分子本身的來源或生物分子序列數(shù)據(jù)的集合，特別是多核苷酸或多肽序列數(shù)據(jù)的集合。在本發(fā)明的上下文中，生物分子優(yōu)選為攜帶遺傳信息的多核苷酸分子，特別是DNA分子。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子為包含大量氨基酸的多肽，特別是蛋白。因此，生物分子庫可為生物分子的物理來源，特別地可為基因庫，特別是cDNA或基因組文庫， 或?yàn)橛嘘P(guān)所述生物分子的信息集合，特別是序列數(shù)據(jù)的集合，特別是氨基酸序列或多核苷酸序列數(shù)據(jù)的集合，特別是DNA序列數(shù)據(jù)的集合。本發(fā)明也涉及生物分子序列、氨基酸序列、多核苷酸序列或核苷酸序列，特別是 DNA序列，因此，所述措辭一方面是指物理物質(zhì)本身，即蛋白、多肽或DNA分子，另一方面是指所述化學(xué)物質(zhì)的信息內(nèi)容，其中在多核苷酸的情況下，所述信息內(nèi)容是指其核苷酸的類型、順序和數(shù)量，且在多肽的情況下，所述信息內(nèi)容是指形成所述多肽的單個(gè)氨基酸的類型、順序和數(shù)量。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“生物分子”、“DNA分子”、“多核苷酸分子”、“多肽”或 “蛋白”是指化學(xué)物質(zhì)本身。在此情況下，本發(fā)明特別是指氨基酸序列信息、DNA序列信息、 多核苷酸序列信息或生物分子序列信息，其不是指生物分子的物理形式，而是指其中所含的信息，即其組成物(即，氨基酸或核苷酸)的類型、順序和數(shù)量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式A)中，在其步驟a)至c)中，本發(fā)明適用于作為序列數(shù)據(jù)集合的生物分子庫，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子庫為多核苷酸序列，特別是DNA序列的序列數(shù)據(jù)集合，或在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子庫為氨基酸序列的序列數(shù)據(jù)集合，兩種序列數(shù)據(jù)集合均在步驟b)中用序列比對(duì)工具，優(yōu)選如BLAST (基本的局部比對(duì)檢索工具) 進(jìn)行檢索，以鑒別出第一靶生物分子序列組(Altschul,S. F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215 403 ；Altschul, S. F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25 :3389_3402)。其它適合的程序包括威斯康辛遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)，Madison, WI, USA)中的 GAP、BESTFIT 和 FASTA。在進(jìn)一步的步驟 c)中，對(duì)所鑒別的第一生物分子序列組進(jìn)行進(jìn)一步的選擇步驟，在此期間，使用所鑒別的序列基序由序列基序cl)至c3)進(jìn)行否定地鑒別和選擇，且由序列基序c4)至c6)來肯定地選擇所希望的生物分子序列。一旦鑒別出第二組生物分子序列，本發(fā)明使用所述序列信息來制備對(duì)應(yīng)的寡核苷酸或多核苷酸分子，如雜交引物，以在物理形式的生物分子庫中篩選和選擇編碼在第二組中所鑒別的酶的DNA序列分子。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟c)中所得的序列信息可用于從基因組DNA或cDNA文庫中克隆對(duì)應(yīng)的基因，以及在諸如大腸桿菌、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等中表達(dá)所述蛋白。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟c)中所得的序列信息用于從頭(de novo)合成所希望的 (R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。在此類優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用步驟c)中所得的序列信息，通過諸如優(yōu)化的密碼子應(yīng)用和mRNA穩(wěn)定性來合成基因，以及克隆和表達(dá)此基因。根據(jù)此類優(yōu)選實(shí)施方式，可將包含DNA序列信息或氨基酸序列信息的生物分子庫用作步驟a)中的至少一個(gè)生物分子庫。在這種情況下，生物分子庫包含DNA序列信息，所述信息或者已被翻譯為氨基酸序列信息以根據(jù)步驟b)至c)來處理，其中氨基酸序列被用作查詢生物分子序列和氨基酸序列基序，或者使用查詢生物分子序列和被翻譯回DNA序列信息的序列基序cl)至 c6)在DNA序列庫中實(shí)施所述步驟b)至c)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的教導(dǎo)適用于實(shí)施方式B)的步驟a)中的生物分子庫，所述生物分子庫以物理形式的基因庫存在，特別是以諸如cDNA、宏基因組或基因組文庫等基因文庫存在，使用編碼至少一種(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的全部或至少特征部分的DNA分子，以檢索、鑒別和選擇第一生物分子序列組，特別是DNA序列分子，其基于氨基酸水平計(jì)算與所述查詢DNA序列分子具有至少20%，優(yōu)選32%的序列相同性。隨后的步驟c)優(yōu)選在所述第一組DNA分子中進(jìn)行，使用核苷酸分子引物來鑒別以及肯定和否定選擇所希望序列基序cl)至c6)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“序列基序”是指所要求保護(hù)的方法的步驟c)中具體鑒別的推定(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列的特異選擇性特征。特別地，第一序列基序cl)為在95位至97位中鑒別的序列基序，其為此順序的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中 Xal為氨基酸lie、Val, Leu、Met、Phe，且Xa2為氨基酸Arg或Lys，且其根據(jù)本發(fā)明，其不應(yīng)存在于最終選擇的生物分子序列中。第二序列基序c2)為在97位至99位鑒別的序列基序，其為此順序的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa為氨基酸，和在105位至111位，優(yōu)選在107位至109位區(qū)域的為此順序的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xaa為氨基酸，且Xa3 為氨基酸，優(yōu)選為His，且其也不應(yīng)存在于最終選擇的生物分子序列中。第三序列基序c3) 為這樣的序列基序，其表征為在38位存在Thr、在97位存在Lys以及在107位至109位存在氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4為氨基酸，優(yōu)選為Gly，且Xa5為氨基酸，優(yōu)選為Tyr，基序c3)不應(yīng)存在于最終選擇的生物分子序列中。第四序列基序c4)要求在95位為除Tyr、Arg、Lys外的另一種氨基酸，或在95位為Tyr，但在97位無Arg或Lys存在，從而使其適合充當(dāng)本發(fā)明制備的推定的(R)-選擇性 ω-轉(zhuǎn)氨酶。第五序列基序c5)要求在最終制備并鑒別的推定的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的 40位不存在Lys和Arg。第六序列基序c6)要求在最終制備并鑒別的推定的(R)-選擇性 ω-TA的161位至165位存在至少一個(gè)Lys，優(yōu)選存在一個(gè)Lys，優(yōu)選在163位為Lys。在本發(fā)明的上下文中，氨基酸位置的鑒別和定位確定如下所述。將第一靶生物分子序列彼此和與查詢生物分子序列比對(duì)，優(yōu)選多比對(duì)。比對(duì)可使用常規(guī)比對(duì)軟件，如STRAP， 特別是ClustalW，優(yōu)選ClustalW3D完成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，也可將序列成對(duì)地比對(duì)，即每個(gè)第一靶生物分子序列與查詢生物分子序列比對(duì)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，將第一靶生物分子序列與大腸桿菌的BCAT比對(duì)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，將第一靶生物分子序列與本發(fā)明所用的另一查詢生物分子序列，如(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶比對(duì)。本發(fā)明中給出的氨基酸位置的注釋通過對(duì)應(yīng)序列基序在用作位置標(biāo)準(zhǔn)的查詢生物分子序列中的位置來確定。上述比對(duì)將第一靶生物分子序列的對(duì)應(yīng)氨基酸位置與存在于查詢生物分子序列中的序列基序進(jìn)行比對(duì)。例如，使用大腸桿菌BCAT作為位置注釋的標(biāo)準(zhǔn)，使用大腸桿菌BCAT的92位至100 位的已知氨基酸序列，即TSAYIRPLI (SEQ ID no. 9)來鑒別推定的ω -轉(zhuǎn)氨酶中95位至99 位，對(duì)所述推定的《-轉(zhuǎn)氨酶的序列基序(1)、(32)、(33)的缺失和c4)的存在進(jìn)行分析。大腸桿菌BCAT的35位至42位的已知氨基酸序列，即VFEGIRCY(SEQ ID no. 10)標(biāo)記出用于序列基序c3)和c5)的位于38位的G的位置。大腸桿菌BCAT的氨基酸序列中的氨基酸序列DVGMGVNP(SEQ ID no. 11)標(biāo)記出用于105位至111位的序列基序c3)的104位至111 位。已知大腸桿菌BCAT的159位至167位的氨基酸序列PTAAKAGGN(SEQ ID no. 12)標(biāo)記出用于序列基序c6)的163位的K。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子為蛋白，且生物分子序列為氨基酸序列。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子庫為庫，特別是數(shù)據(jù)庫，所述庫是具有各種蛋白信息，特別是氨基酸序列信息的集合的庫。優(yōu)選的數(shù)據(jù)資料庫為NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫， UniProtKB/SwissProt 和 Uni-ProtKB/TrEMBL 數(shù)據(jù)庫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子也可為DNA分子，且生物分子序列也可為DNA序列。 因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述生物分子庫是具有各種多核苷酸序列信息，特別是DNA 序列信息的集合的庫，特別是數(shù)據(jù)庫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明使用上述方法，其中所述生物分子庫為生物分子數(shù)據(jù)庫，且在步驟b)中使用生物分子序列比對(duì)程序，特別是BLAST檢索所述生物分子數(shù)據(jù)庫。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可預(yù)期如果生物分子庫為生物分子數(shù)據(jù)庫，則在步驟b)中使用氨基酸序列(如果生物分子數(shù)據(jù)庫為氨基酸序列數(shù)據(jù)庫)，或使用DNA序列(如果生物分子數(shù)據(jù)庫為 DNA序列數(shù)據(jù)庫)檢索所述生物分子數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明預(yù)期通過轉(zhuǎn)氨酶的從頭合成，或借助引物(在第二生物分子序列的基礎(chǔ)上定義)從物理基因庫中分離編碼所希望轉(zhuǎn)氨酶的多核苷酸，以最終在步驟d)中提供生物分子，優(yōu)選DNA分子或氨基酸序列分子，即蛋白。將所得多核苷酸，特別是DNA序列分子用于在合適條件下，在合適培養(yǎng)基中表達(dá)所希望的轉(zhuǎn)氨酶。本發(fā)明還涉及篩選和鑒別(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，包括以上確定的步驟a) 至c)，特別是提供至少一種(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列和至少一個(gè)生物分子庫，用所述查詢生物分子序列檢索所述生物分子庫以鑒別出第一靶生物分子序列組，其中以氨基酸水平計(jì)算，第一生物分子序列與所述查詢生物分子序列具有至少20%、 優(yōu)選25%、優(yōu)選32%的序列相同性，在第一靶生物分子序列組中選擇以下生物分子序列， 所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含Cl)至c3)中的任一個(gè)序列基序，其中cl)為在 95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal為氨基酸Ile、Val、Leu、Met、Phe，且Xa2 為氨基酸Arg或Lys，或者c2)為在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa為氨基酸，和在105位至111位，優(yōu)選在107位至109位區(qū)域的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中優(yōu)選Xa3為氨基酸，優(yōu)選為His，或者c3)為在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至 109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4為氨基酸，優(yōu)選為Gly，且Xa5為氨基酸，優(yōu)選為 Tyr,且所述生物分子序列務(wù)必包含序列基序c4)、c5)和c6)，其中c4)為在95位除Tyr、 Arg、Lys外的氨基酸，或在95位為Tyr，但在97位無Arg或Lys，且c5)在40位無Lys或 Arg，且c6)為在161位至165位區(qū)域，優(yōu)選在163位的Lys，以鑒別出第二靶生物分子序列組，所述第二靶生物分子序列組為(R)-選擇性ω-TA的生物分子序列。在本發(fā)明的進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的教導(dǎo)提供了可根據(jù)本發(fā)明制備方法獲得的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。特別地，本發(fā)明提供了蛋白和DNA序列，特別是DNA分子，其編碼來自百脈根根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)和土曲霉(Aspergillus terreus)的所述蛋白，如SEQ ID no. 1和2所確定百脈根根瘤菌的蛋白以及SEQ ID no. 3和4所確定的土曲霉的蛋白。在特別的和最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了這樣的教導(dǎo)，即可根據(jù)本發(fā)明獲得或制備的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，如SEQ ID no. 1和3中確定的那些，可用在轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中，特別是可用在制備光學(xué)活性的手性胺，優(yōu)選手性胺的(R)-對(duì)映體的方法中，包括將至少一個(gè)氨基受體和至少一個(gè)氨基供體與本發(fā)明的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶(特別是 SEQ ID no. 1或3)反應(yīng)，并獲得光學(xué)活性的手性胺。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于制備光學(xué)活性的手性胺的方法為使用的含酮基的化合物，優(yōu)選酮，和氨基供體的不對(duì)稱合成。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述制備方法使用動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)。氨基供體優(yōu)選為外消旋胺的混合物，而氨基受體優(yōu)選作為離析物(educts)的酮。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，在從酮起始的不對(duì)稱合成中合成光學(xué)活性的手性胺，向所希望的光學(xué)活性的手性胺，即(R)-對(duì)映體的優(yōu)選轉(zhuǎn)化率為至少70%、80%、90%、95%、98%、99%、99. 5%和最優(yōu)選100%。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，將本發(fā)明的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶用在從外消旋胺起始的動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)中，向光學(xué)活性的手性胺，優(yōu)選(S)-對(duì)映體的優(yōu)選轉(zhuǎn)化率為至少 30%、40%、45%、46%、47%、48%、49%，特別是 50%。用于分析光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率的濃度可通過使用諸如HPLC、毛細(xì)管電泳(CE)、氣相色譜(GC)或光度測定或熒光測定法來測定。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于制備光學(xué)活性手性胺的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)氨酶，特別是(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶存在下，將包含酮基的氨基受體化合物與胺的外消旋混合物反應(yīng)，以獲得手性胺的(S)-對(duì)映體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了制備光學(xué)活性的手性胺，特別是所述胺的(R)-對(duì)映體的方法，所述方法包括在(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，特別是可根據(jù)本發(fā)明獲得的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶存在下，將包含酮基的氨基受體化合物和氨基供體反應(yīng)，以獲得胺的(R)-對(duì)映體。在本發(fā)明的上下文中，氨基受體為這樣的分子，其能夠接受由轉(zhuǎn)氨酶，特別是 ω _轉(zhuǎn)氨酶從氨基供體轉(zhuǎn)移的氨基。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基受體包含酮官能團(tuán)(ketone functionality)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基受體選自苯丙酮酸或其鹽、丙酮酸或其鹽、 苯乙酮、2-酮戊二酸鹽、3-氧代丁酸鹽、2- 丁酮、3-氧代吡咯烷(3-0P)、3_吡啶基甲基酮 (3-PMK)、3_氧代丁酸乙酯(3-0BEE)、3_氧代戊酸甲酯(3-0PME)、N-1-boc-氧代哌啶酮、 N-l-boc-3-氧代吡咯烷(B30P)、3-氧代-哌啶、N-l-boc-3 氧代哌啶(B30Pi)、l_Cbz_3-氧代哌啶(C30Pi)、l-Cbz-3氧代吡咯烷(C30P)、烷基-3-氧代-丁酸酯(butonoates)、甲氧基丙酮和1-氧代四氫萘酮組成的組。在本發(fā)明的上下文中，氨基供體為這樣的分子，其能夠使用轉(zhuǎn)氨酶，特別是ω-轉(zhuǎn)氨酶向氨基受體提供氨基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基供體為胺或氨基酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基供體選自β-丙氨酸、丙氨酸、α-甲基芐胺 (α -MBA)、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、3-氨基丁酸、異丙胺、2-氨基丁烷和Y -氨基丁酸或其中任意一種的鹽，如氯化物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所得的酮產(chǎn)物可為苯丙酮酸或其鹽、丙酮酸或其鹽、乙醛酸或其鹽、苯乙酮、2-酮戊二酸鹽、丙酮、3-氧代丁酸、2-丁酮、 氧代丁酸鹽、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-0P)、3-吡啶基甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯 (3-0BEE)、3-氧代戊酸甲酯(3-0PME)、N-1-boc-氧代哌啶酮和N-l-boc-3-氧代吡咯烷 (B30P)或其中任意一種的鹽，如氯化物。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備光學(xué)活性手性胺的方法，所述光學(xué)活性手性胺選自具有光學(xué)活性氨基的胺的組，特別是具有烷基、支鏈烷基或芳基烷基的胺。特別地，這些胺，特別是單環(huán)或二環(huán)胺為5元或6元環(huán)的胺，或S-、0-或N-取代的雜環(huán)烴或芳胺，特別是烷基或烷氧基取代的芳胺。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所得的手性胺選自苯丙氨酸、丙氨酸、3-氨基哌啶、烷基-3-氨基-丁酸鹽、3-氨基吡咯烷(3-AP)、3_吡啶基-1-乙胺(3-PEA)、N-l-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、N-l-boc-3-氨基哌啶(B3APi)、l_Cbz_3-氨基哌啶(C3APi)、l-Cbz-3-氨基吡咯烷(C3AP)、3-氨基丁酸乙酯(3-ABEE)、3_氨基戊酸甲酯(3APME)、α-甲基芐胺(α-ΜΒΑ)、1_氨基四氫化萘、3，4_ 二甲氧基苯基丙酮、α-甲基-4-(3-吡啶基)-丁胺、Y-氨基丁酸鹽、谷氨酸鹽、異丙胺、β-氨基丁酸鹽、仲丁胺、甲氧基異丙胺、3-氨基吡咯烷的衍生物、l-N-Boc-3-氨基哌啶、頭孢菌素和頭孢菌素的衍生物組成的組。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明由此預(yù)見到將30P與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)_3AP。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將3-PMK與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)3_PEA。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將3-0BEE與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R) 3-ΑΒΕΕ。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將3-0ΡΜΕ與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)3-APME。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將B30P與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)_B3AP。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將B30Pi與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)_B3APi。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將C30Pi與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)_C3APi。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將C30P與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R)_C3AP。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將苯乙酮與(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶和氨基供體反應(yīng)以提供光學(xué)活性的(R) α-ΜΒΑ。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)見到將氨基受體，特別是單環(huán)或二環(huán)、含氧代基團(tuán)的5元或6元環(huán)，或S-、0-或N-取代的雜環(huán)烴或芳香族化合物，特別是烷基或烷氧基取代的芳香族化合物作為氨基受體與氨基供體和(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)，以獲得胺，特別是單環(huán)或二環(huán)胺，特別是5元或6元環(huán)的胺，或S-、0_或N-取代的雜環(huán)烴或芳胺，特別是烷基或烷氧基取代的芳胺，特別是(R)形式。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在諸如生理緩沖液等水性介質(zhì)中將氨基受體和氨基供體與轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)在pH5-9，特別是在pH 7-8.5 范圍內(nèi)的PH下進(jìn)行。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)在10°C至65°C，優(yōu)選20°C至50°C，特別是18°C至25°C，優(yōu)選室溫或34°C至39°C，特別在37°C下進(jìn)行。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，以1 1至1 5，特別為1 1至1 2的的摩爾比提供氨基受體和氨基供體。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，酶促活性為1至20. OOOymol/min。本發(fā)明還涉及用于分析轉(zhuǎn)氨酶，特別是用于表征轉(zhuǎn)氨酶性質(zhì)的方法，其包括以下步驟
i.提供帶電的氨基受體、帶電的氨基供體和轉(zhuǎn)氨酶，優(yōu)選ω-轉(zhuǎn)氨酶，最優(yōu)選可根據(jù)本發(fā)明獲得的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，ii.在反應(yīng)介質(zhì)中將氨基受體和氨基供體與轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)，和由此iii.在第一反應(yīng)條件設(shè)定下測定反應(yīng)介質(zhì)的電導(dǎo)率，和iv.在步驟iii)后，在第二反應(yīng)條件設(shè)定下測定反應(yīng)介質(zhì)的電導(dǎo)率，以獲得反映轉(zhuǎn)氨酶性質(zhì)的至少兩個(gè)電導(dǎo)率值。在轉(zhuǎn)氨酶(優(yōu)選ω-ΤΑ)催化的，帶電的底物氨基供體(優(yōu)選胺)與氨基受體(優(yōu)選酮酸，如丙酮酸鹽)的反應(yīng)期間，電導(dǎo)率降低，這是因?yàn)樾纬刹粠щ姷耐蛢尚噪x子的氨基組分，優(yōu)選氨基酸，如丙氨酸。
權(quán)利要求
1.用于制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，其包括以下步驟a)提供至少一種轉(zhuǎn)氨酶或裂解酶的至少一個(gè)查詢生物分子序列，和至少一個(gè)生物分子庫；b)用所述查詢生物分子序列檢索所述生物分子庫，以鑒別出第一靶生物分子序列組， 其中以氨基酸水平計(jì)算，所述第一靶生物分子序列與所述查詢生物分子序列具有至少20% 的序列相同性；c)在所述第一靶生物分子序列組中選擇第二生物分子靶序列組，所述第二生物分子靶序列組在氨基酸水平上不包含以下氨基酸序列基序Cl)至c3)中的至少一種，其中cl)在95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal為氨基酸Ile、Val、Leu、Met、 Phe,且Xa2為氨基酸Arg或Lys，或者c2)在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa為氨基酸，和在105位至111 位的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3為氨基酸，優(yōu)選為His，或者c3)在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4 Xa5，其中Xa4為氨基酸，優(yōu)選為Gly，且Xa5為氨基酸，優(yōu)選為Tyr ； 而包含c4)在95位除Tyr、Arg、Lys外的另一種氨基酸，或在95位的Tyr，但在97位無Arg或 Lys,且c5)在40位無Lys或Arg,且c6)在161位至165位區(qū)域中的Lys，以鑒別出第二靶生物分子序列組，和d)提供生物分子，其具有在步驟c)中鑒別的第二生物分子靶序列，且為具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白或至少部分編碼具有(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。
2.用于篩選(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，其包括權(quán)利要求1的步驟a)至c)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述生物分子為蛋白，且所述生物分子序列為氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述生物分子為DNA分子，且所述生物分子序列為DNA序列。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物分子庫為生物分子數(shù)據(jù)庫，且在步驟b)中使用生物分子序列比對(duì)工具，特別是BLAST檢索所述生物分子數(shù)據(jù)庫。
6.如權(quán)利要求1、3、4和5所述的方法，其中通過從頭合成提供步驟d)中所提供的蛋白質(zhì)或DNA分子。
7.如權(quán)利要求1、2和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物分子庫為基因庫，且在步驟 b)中使用查詢DNA序列分子檢索所述基因庫。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟c)中使用DNA序列引物選擇所述第二生物分子序列組。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述查詢生物分子序列是代表全部或部分的功能性(R)“選擇性ω -轉(zhuǎn)氨酶的序列。
10.可通過權(quán)利要求1和3 9中任一項(xiàng)所述方法獲得的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，其優(yōu)選選自SEQ ID no. 1、2、3和4組成的生物分子序列組。
11.用于分析轉(zhuǎn)氨酶，特別是表征轉(zhuǎn)氨酶性質(zhì)的方法，其包括以下步驟 i)提供帶電的氨基受體、帶電的氨基供體和轉(zhuǎn)氨酶， )在反應(yīng)介質(zhì)中將氨基受體和氨基供體與轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)，和由此iii)在第一反應(yīng)條件設(shè)定下測定所述反應(yīng)介質(zhì)的電導(dǎo)率，和iv)在步驟iii)后，在第二反應(yīng)條件設(shè)定下測定所述反應(yīng)介質(zhì)的電導(dǎo)率，以獲得反映轉(zhuǎn)氨酶性質(zhì)的至少兩個(gè)電導(dǎo)率值。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中至少在第三反應(yīng)條件設(shè)定下測定所述反應(yīng)介質(zhì)的電導(dǎo)率至少三次。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述反應(yīng)條件的設(shè)定相同。
14.如權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)介質(zhì)是低電導(dǎo)率緩沖劑。
15.如權(quán)利要求11或14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述帶電的氨基受體是丙酮酸鹽。
16.如權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的用于篩選或制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，其中在篩選或制備(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶后，實(shí)施權(quán)利要求11 15中任一項(xiàng)所述的分析轉(zhuǎn)氨酶的方法。
17.制備光學(xué)活性手性胺的方法，其包括使至少一種氨基受體和至少一種氨基供體與權(quán)利要求10所述的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)，并獲得所述光學(xué)活性手性胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于篩選、制備和表征(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，由此獲得的ω-轉(zhuǎn)氨酶及其在各種氨基轉(zhuǎn)移過程中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P13/00GK102482650SQ201080039297
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者烏韋·博恩朔伊爾, 卡倫·羅賓斯, 塞巴斯蒂安·舍茨勒, 馬蒂亞斯·赫內(nèi) 申請(qǐng)人:羅扎股份公司