專利名稱：用于產生脂質的經遺傳改造的生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及經遺傳改造的非哺乳動物生物、尤其是微生物，其中某些酶活性被降低和/或增加，所述生物可用于脂質、尤其是中性脂質的工業(yè)化生物合成。本發(fā)明還涉及所述生物的用途，用于制備所述生物的穿梭載體和產生所述生物的方法。發(fā)明背景和現(xiàn)有技術脂質是疏水性或兩親性的小分子，其完全或部分通過硫酯如脂肪酸或聚酮化合物的碳負離子縮合和/或通過于異戊二烯單元如異戊烯醇或固醇的碳負離子縮合而產生。這 一類包括經濟上高度重要的若干物質。三酰甘油-脂質類包括例如油、脂或蠟類，其用于各種各樣的用途，例如作為食物配料或用于烹飪，制造肥皂、皮膚產品、香水和其它個人護理及化妝品，制造油漆和其它木器處理品，在電子工業(yè)中作為生物可降解的絕緣體，制造生物可降解的水力流體，作為潤滑劑，或者甚至作為可用于替代常規(guī)柴油的生物柴油的基料。類異戊二烯-脂質鯊烯例如可用作疫苗佐劑或其它藥物、營養(yǎng)物、化妝品以及非處方藥的輔料。鯊烯也可用作合成萜的結構單元。此外，鯊烯在工業(yè)上可用作生物可降解的潤滑劑。其它經濟上重要的脂質是諸如麥角固醇、酵母固醇、麥角留二烯醇(epiSter0l)、7-脫氫膽固醇或羊毛固醇等固醇，其可用作制備如皂苷、類固醇激素、維生素和藥物的化合物的關鍵原料。脂質、尤其是中性脂質，通常在細胞中是貯存于稱為脂質粒(lipid particle)的特定胞內細胞器中。這些顆粒的特征在于由高疏水性單層組成的簡單結構，其中僅包含少量包埋的蛋白質。脂質貯存于脂質粒中，直到水解使其組分重返代謝和/或分解代謝途徑中。這種脂質儲備形成過程在自然界中廣泛采用，所有種類的真核細胞都含有胞內脂質粒，其也可稱為脂質體(lipid body)、脂滴(lipid droplet)、油脂體(oil body)或油脂小體(oleosome)。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，脂質滴積聚了至多70%的細胞總脂含量。因為大部分所述脂質源自如植物、動物或微生物等天然來源，所以進行嘗試以增加活細胞中的脂質量，即在脂質粒中積聚更多脂質。為了這一目的，已知改造生物的代謝途徑。文獻EP-O 486 290A描述了麥角固醇代謝基因在酵母中的過量表達，導致細胞中麥角固醇含量增加。文獻W003/064652A公開了基于羊毛固醇-C14-脫甲基酶和HMG-輔酶A-還原酶活性的增加而制備酵母固醇的方法。在文獻W02004/083407A中描述了轉基因生物，其具有降低的Λ 22-去飽和酶活性和增加的HMG-輔酶A還原酶、羊毛固醇C14-脫甲基酶、鯊烯環(huán)氧酶和鯊烯合成酶活性。這些生物可用于產生固醇脂質麥角留_5，7-二烯醇。因此，通過生物改造脂質產生生物，可顯著提高所產生脂質的產率。然而，所得脂質化合物通常不純和混雜，需要進行分離和/或純化，尤其是當所述脂質要用作進一步化學合成或改性的原料時。另外，任何純化步驟，尤其是在工業(yè)化規(guī)模上進行時，都是昂貴而費力的并可能污染環(huán)境。發(fā)明的技術問題.因此，本發(fā)明的技術問題包括提供允許通過生物以更純形式制備脂質的方式和方法，以避免費力而昂貴的純化步驟。發(fā)明概述和優(yōu)選的實施方案為了解決這個技術問題，本發(fā)明教導權利要求I的生物。在權利要求中依照權利要求I詳細說明了優(yōu)選的實施方案。其中術語“遺傳改造”不僅包括其基因組經基因工程的現(xiàn)有技術方法改造的生物，而且還包括按照所需遺傳改造而從突變(常規(guī)誘變)中選擇出來的生物。本發(fā)明是基于這一發(fā)現(xiàn)能夠對生物進行基因工程或生化改造，使得特定(中性)脂質能以更純形式在脂質粒中積聚。本發(fā)明的生物經改造，改造方式使其消除或降低非必需的固醇基?；?steryl acyl ester)和/或三酰甘油和/或臘酯(wax ester)的合成，這取決于希望由生物所產生的更高純度的脂質。除了以更純形式積聚中性脂質之外，對潛在污染的固醇基?；ズ?或三酰甘油和/或蠟酯的降低或消除也令人驚奇地導致所需脂質的水平和產率的增加。不受該理論的束縛，這可能是因為脂質粒中的貯存空間增加和 /或因為所需脂質合成所用的物質的利用度增加。術語“中性脂質”是指缺乏帶電荷基團并因此而不能大量整合到雙層膜上的脂質。該術語包括三酰甘油(TAG)、固醇基?；?SAE)和蠟酯(WE)。鯊烯也屬于“中性脂質”類。通常，脂質粒的內容物是不同中性脂質的混合物，其妨礙重組生物中所需特定中性脂質的有效產生。本發(fā)明通過改造產生生物，使得在所述生物所述脂肪粒中天然存在的至少一種類型的中性脂質不再由此合成，從而解決了這個問題。結果，所述脂質粒含有的其余中性脂質的組成就變得更純，并因此對用于商業(yè)目的的制備而言更具吸引力。通常，可使用權利要求I中的任一活性或不同(2、3或4種)活性的組合，取決于欲以更高純度合成的中性脂質，或繼而取決于在生物合成中作為不想要的污染物而欲除去的中性脂質。因此，本發(fā)明存在著各種實施方案，而在以下僅會更詳細地描述某些具體的實施方案。因此，在第一實施方案中，本發(fā)明的生物經改造，使其不再合成固醇基?；?SAE)。固醇基?；ナ蔷哂虚L鏈脂肪酸的固醇酯。通常，SAE的合成是在細胞中通過涉及?；o酶A:固醇酰基轉移酶/固醇O-?；D移酶(EC2.3. 1.26)的酶促機制來完成。所催化的反應是具有長鏈脂肪酸的固醇的酯化反應。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，本發(fā)明的生物經改造，使得?；o酶A:固醇?；D移酶/固醇O-酰基轉移酶(EC2. 3. I. 26)的活性被降低。在酵母、尤其是釀酒酵母中，固醇酯化而得到固醇基酰基酯是由固醇?；D移酶的兩種同工酶(即Arelp和Are2p)來完成，所述酶對不同的固醇中間體具有不同的特異性親和力。Arelp尤其是導致麥角固醇前體(例如羊毛固醇、酵母固醇、麥角甾_5，7-二烯醇)和酵母外源物質(例如7-脫氫膽固醇)的酯化。Are2p優(yōu)先導致麥角固醇(在酵母中是麥角固醇生物合成途徑的終產物)的酯化。如果所述生物是酵母生物、尤其是酵母屬(Saccharomyces)和優(yōu)選釀酒酵母的話,與相應的未經改造的酵母生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，可降低或消除Arelp或Are2p的活性或Arelp和Are2p這兩者的活性。如果同時消除這兩種酶活性，在細胞中就不會發(fā)生固醇的酯化。如果在生物中相應地保持或調整產生某種固醇的酶活性，則僅消除一種活性并保持另一種的活性，在細胞中就可能根據需要得到某一類型固醇基?；ァ?br> 與其中所述生物的特征是不再合成固醇基?；サ谋景l(fā)明第一方面相關，本發(fā)明的生物原則上可以是任何可能的生物，植物生物、真菌生物或細菌生物。然而，優(yōu)選的生物是源自在其脂質粒中天然就不貯存蠟酯、而僅貯存其它脂質(例如三酰甘油和固醇基?；?的生物。因此，通過消除固醇基酰基酯合成的生物合成途徑，使得所述生物在其脂質粒中基本上僅積聚三酰甘油，因而允許在所述生物中由脂質粒以相當純形式產生三酰甘油。在其脂質粒中天然就不積聚蠟酯的生物的實例尤其是大多數(shù)動物、真菌細胞和大多數(shù)植物細胞，藻類和浮游生物細胞除外。在本發(fā)明第一方面相關的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述生物是真菌生物，優(yōu)選選自以下各屬的真菌生物耶氏酵母屬(Yarrowia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、油脂酵母屬(Lipomyces)、假絲酵母屬(Candida)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、被抱霉屬(Mortierella)、毛霉屬(Mucor)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)和網柄菌屬(Dictyostelium)。特別優(yōu)選的是以下真菌生物種解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytics)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、斯達油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、彎假絲酵母(Candida curvata)、圓紅冬抱酵母(Rhodosporidiumtortuloides)、深黃被抱霉(Mortierella isabellina)、爪睡毛霉(Mucor javonicus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、克魯維酵母 (Kluyveromyces spec)、曲霉(Aspergillus spec)、青霉(Penicillium spec)或網柄菌(Dictyostelium spec)。在本發(fā)明第一方面的一個特別優(yōu)選的實施方案中,所述生物是釀酒酵母。在第二實施方案中，本發(fā)明的生物經改造，使其不再合成固醇基?；?SAE)和蠟酯(WE)。通常，WE的合成在細胞中通過涉及?；o酶A-蠟醇?；D移酶(EC2. 3. I. 75)的酶促機制來完成。因此，在本發(fā)明第二方面的一個優(yōu)選的實施方案中，與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，本發(fā)明的生物經改造，使得?；o酶A:固醇酰基轉移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)和酰基輔酶A-蠟醇?；D移酶(EC2. 3. I. 75)的活性被降低。本發(fā)明第二方面相關的本發(fā)明的生物在脂質粒中主要積聚三酰甘油，因為固醇基?；ズ拖烏サ暮铣杀唤档?，優(yōu)選被完全消除。因此所述生物適合制備、尤其是在工業(yè)化規(guī)模上制備更純形式的三酰甘油。本發(fā)明第二方面的生物優(yōu)選源自天然產生蠟酯并在胞內脂質粒中貯存它們的生物。產生并貯存蠟酯的生物例如植物和昆蟲(其中它們可用于提供疏水性的組織外被，以盡量降低表面脫水)、藻類、浮游生物和細菌。在本發(fā)明第二方面的一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物是細菌生物，優(yōu)選以下各屬的生物分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)或乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。最優(yōu)選的生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。此外，不僅可在本發(fā)明的生物中產生三酰甘油(其在所述生物中天然產生，或以其在所述生物中天然產生的數(shù)量來產生)，而且還可對所述生物進行遺傳改造，以增加一種或多種在所述生物中天然產生的特定三酰甘油的數(shù)量，或者可對所述生物進行遺傳改造，以導致合成一種或多種在所述生物中并非天然產生的三酰甘油。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物所積聚的三酰甘油是甘油和至少一種不飽和脂肪酸的酯，并且更優(yōu)選所述不飽和脂肪酸是ω-3脂肪酸。原則上，所述ω-3脂肪酸可以是任何可能的ω-3脂肪酸，但優(yōu)選是α-亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)或二十二碳六烯酸(DHA)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，三酰甘油中的不飽和脂肪酸是ω-6脂肪酸。原則上，所述ω-6脂肪酸可以是任何可能的ω-6脂肪酸，但優(yōu)選是亞油酸、Υ-亞麻酸、二十碳二烯酸、二同型-Y-亞麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸或十八碳三烯酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，三酰甘油中的不飽和脂肪酸是ω-9脂肪酸。原則上，所述ω-9脂肪酸可以是任何可能的ω-9脂肪酸，但優(yōu)選是油酸、二十二碳一烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳烯酸或神經酸。 可以進一步改進第一和第二實施方案，如下所述。三酰甘油通常是通過二酰基甘油與長鏈脂肪酸或磷脂的酯化而形成。與長鏈脂肪酸的酯化反應是由二酰基甘油?；D移酶/ 二酰基甘油O-酰基轉移酶(EC2.3. 1.20)催化的。與磷脂的酯化反應是由卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)催化的。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第一或第二方面的生物的特征是與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，二?；视王；D移酶/ 二?；视蚈-?；D移酶(EC2.3. 1.20)的活性和/或卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性增加。上述兩種酶中的一種或兩種的活性增加導致所述生物的細胞中TAG合成的增加。除此之外，也可對所述生物進行遺傳改造，使得所述生物能夠產生某些脂肪酸以摻入到TGA中或增加所述脂肪酸的產量，如果它們在所述生物中是天然產生的話，則以增加它們在所述生物中所產生的TGA中的含量。例如，如果要在所述生物所產生的TGA中增加ω-3脂肪酸(例如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十碳六烯酸(DHA))的含量，則最好是增加以下酶的活性Λ 12脂肪酸去飽和酶(EC1. 14. 19)、Δ 15-去飽和酶(EC I. 14. 19), Δ 6脂肪酸去飽和酶(EC I. 14. 19. 3)、脂肪酸延長酶、Δ 5-去飽和酶/ Λ 5-脂肪酸去飽和酶(EC1. 14. 19)和Λ 4脂肪酸去飽和酶(EC1. 14. 19)。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物的特征是與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和/或卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性和選自以下至少一種酶的活性被增加Δ 12脂肪酸去飽和酶(ECI. 14. 19)、Δ 15-去飽和酶(ECI. 14. 19)、△ 6脂肪酸去飽和酶(ECI. 14. 19. 3)、脂肪酸延長酶、Δ 5-去飽和酶/ Δ 5-脂肪酸去飽和酶(ECI. 14. 19)和Λ4脂肪酸去飽和酶(EC1. 14. 19)。例如，植物和某些真菌能夠產生ω-3和ω-6脂肪酸，而例如釀酒酵母僅可合成ω-9脂肪酸。因此，如果本發(fā)明的生物是釀酒酵母，則需要向所述細胞中引入產生ω-3和/或ω-6脂肪酸所需的酶活性。將相應基因引入酵母細胞的方法以及相應的基因在文獻中已有描述(參見例如W02004/101575)。特定脂肪酸的異源生物(例如在酵母細胞中)的合成描述于例如Beaudoin等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA97(2000)，6421-6426)和 Veen 等(AppI. Microbiol. Biotechnol. 63(2004)，635-646)。本發(fā)明也涉及產生三酰甘油的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明第一或第二方面的生物。如上所述，這些生物在其脂質粒中能以基本純的形式積聚大量三酰甘油。可按照本領域眾所周知的方法從生物中分離出TAG。本領域已知如何從細胞中分離脂質粒和如何從其中所含中性脂質中分離它們。對于生物體釀酒酵母，所述方法的實例描述于所附實施例中。本發(fā)明也涉及產生作為甘油和至少一種不飽和脂肪酸的酯的三酰甘油的方法，所述方法包括與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，在生物中(i)通過抑制劑降低或消除?；o酶A:固醇?；?轉移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)和/或?；o酶A-蠟醇酰基轉移酶(EC2. 3. I. 75)活性；和(ii)增加二?；视王；D移酶/ 二?；视蚈-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和/或卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性。培養(yǎng) 所述生物并分離TAG。對于待產生的三酰甘油中所含有的不飽和脂肪酸而言，以上關于多不飽和脂肪酸的特性和待增加的酶活性所述的優(yōu)選實施方案同樣適用。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，多不飽和脂肪酸是ω-3脂肪酸，并且所增加的酶活性是與ω-3脂肪酸相關的上文進一步提及的至少一種酶活性。在第三個實施方案中，本發(fā)明的生物經改造，使其不再合成三酰甘油(TAG)和固醇基?；?SAE)。如上所述，通常TAG的合成通過二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的酶活性實現(xiàn)。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物經改造，使得與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，酰基輔酶A:固醇?；D移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. 1.26)或二?；视王；D移酶/ 二?；视蚈-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和或卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二酰基甘油?；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第三方面的生物是源自天然產生并貯存蠟酯的生物。所述生物已在上文描述。優(yōu)選生物是如上已述的細菌生物，最優(yōu)選是大腸桿菌。因為TAG和SAE的合成的消除，所述生物適合于在其脂質粒中主要積聚蠟酯。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述生物還具有的特征是與相應的未經改造的菌株、優(yōu)選相應的野生型菌株相比，它表現(xiàn)出?；o酶A蠟醇?；D移酶(EC2. 3. I. 75)活性增加。這將允許增加在生物中合成的蠟酯的含量。在生物細胞中增加所需酶活性的方式和方法是本領域技術人員已知的并進一步描述于下文。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第三方面的生物是源自天然就不產生并貯存蠟酯的生物。所述生物在本發(fā)明第一方面已有描述。優(yōu)選所述生物是如上所述的真菌生物，更優(yōu)選酵母屬且最優(yōu)選釀酒酵母。因為TAG和SAE的合成的消除，所述生物的脂質粒可用于積聚目標脂質，例如鯊烯，正如以下進一步所述。在第四實施方案中，本發(fā)明的生物經改造，使其不再合成蠟酯(WE)、三酰甘油(TAG)和固醇基酰基酯(SAE)。在這一方面，所述生物在其脂質粒中基本上不貯存任何WE、TAG和SE。所述生物尤其可用于設計可涉及特別想要的脂質的脂質粒的生物。也就是說，例如，可將核酸分子引入所述生物，以允許合成另一類型的脂質，其則積聚在脂質粒中。由此，可提供在脂質粒中允許合成基本純的所需脂質的生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第四方面的生物經改造，使得與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，?；o酶A:固醇?；D移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)、二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)、卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)和?；o酶A-蠟醇?；D移酶(EC2. 3. I. 75)的活性降低。在第五實施方案中，本發(fā)明的生物是這樣的生物所述生物在細胞中產生積聚在脂質粒中的中性脂質，并且經遺傳改造，使其不再合成三酰甘油(TAG)并因此在所述脂質粒中不再含有在其脂質粒中天然存在的所述三酰甘油。如上所述，例如在酵母中，通過二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性，完成TAG的廣泛合成。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第五方面的生物經遺傳改造，使得與相應的未經改造 的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，二?；视王；D移酶/ 二?；视蚈-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)的活性降低。在本發(fā)明第五方面的一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物源自在其脂質粒中天然就不能產生并貯存蠟酯的生物。所述生物在上文已有描述。優(yōu)選的生物是如上所述的真菌生物，更優(yōu)選酵母屬和最優(yōu)選釀酒酵母。在第六實施方案中，本發(fā)明的生物是這樣的生物所述生物在細胞中產生在脂質粒中積聚的中性脂質，并且經遺傳改造，使其不再合成蠟酯(WE)和三酰甘油(TAG)并因此在所述脂質粒中不再含有在其脂質粒中天然存在的三酰甘油和蠟酯。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第六方面的生物經遺傳改造，使得與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物相比，二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)和?；o酶A-蠟醇酰基轉移酶(EC2. 3. I. 75)的活性降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第五或第六方面的生物，即不再合成三酰甘油或者不再合成三酰甘油和蠟酯的生物，在其脂質粒中能夠積聚固醇脂質的?；?。固醇脂質的?；ピ谥|粒中的積聚可能是因為以下事實所致所述生物天然合成所述酯；或可因為以下事實所致已將導致生物合成固醇脂質?；サ南鄳傅木幋a基因導入細胞。固醇脂質，例如膽固醇及其衍生物，以及甘油磷脂和鞘磷脂，都是膜脂質的重要組分。也含同樣的稠合4環(huán)核心結構的類固醇作為激素和信號轉導分子而具有不同的生物學作用。C18類固醇包括雌激素家族，而C19類固醇則包括雄激素例如睪酮和雄酮。C21亞類包括孕激素以及糖皮質激素和鹽皮質激素。包含維生素D的不同形式的開環(huán)留類化合物(secosteroid)的特征在于核心結構的B環(huán)的裂解。固醇的其它實例是膽汁酸及其綴合物，其在哺乳動物中是膽固醇的氧化衍生物并在肝臟中合成。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述固醇脂質是固醇或類固醇。類固醇是特征在于具有通常以6-6-6-5方式排列的4個稠合環(huán)的碳骨架的類萜脂質。類固醇因與這些環(huán)連接的官能團和環(huán)的氧化狀態(tài)不同而異。上百種不同的類固醇存在于植物、動物和真菌中。所有類固醇在細胞中由以下固醇產生羊毛固醇(動物和真菌)或環(huán)阿屯醇(植物)。這兩類固醇源自三萜鯊烯的環(huán)化。類固醇包括雌激素、孕酮和睪酮。固醇(或甾族醇(steroid alcohol))是在A環(huán)3位具有輕基的甾族亞類。它們是自乙酰輔酶A合成的兩親性脂質。整個分子相當扁平。A環(huán)上的羥基是極性的。脂族鏈的其余部分是非極性的。植物的固醇被稱為植物固醇，而動物的固醇被稱為動物固醇。最重要的動物固醇是膽固醇和某些類固醇激素；最重要的植物固醇是菜油固醇、谷固醇和豆固醇。固醇在真核生物的生理學上起重要作用。例如膽固醇構成細胞膜的組成部分，其中它的存在影響細胞膜的流動性并在發(fā)育信號轉導中起到第二信使的作用。也已知植物固醇可封閉人類腸道中的膽固醇吸收部位，因而有助降低人體內的膽固醇。在人體內，固醇的作用是提供重要信號和代謝通信，例如晝夜節(jié)律、凝血。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述固醇是膽固醇、膽固醇衍生物、7-脫氫-膽固醇、羊毛固醇、羊毛固醇衍生物、酵母固醇、酵母固醇衍生物、7-烯膽留烷醇、7-烯膽留烷醇衍生物、葫蘆素、葫蘆素衍生物、麥角留二烯醇、麥角留二烯醇衍生物、茶留酮、茶留酮衍生物、油菜素留酮、油菜素留酮衍生物、香蒲固醇、香蒲固醇衍生物、長春花留酮、長春花留酮衍生物、環(huán)桉烯醇、環(huán)桉烯醇衍生物、谷固醇、谷固醇衍生物、異巖藻固醇、異巖藻固醇衍生物、巖 藻固醇、巖藻固醇衍生物、柳珊瑚固醇、柳珊瑚固醇衍生物、麥角固醇、麥角固醇衍生物、豆固醇或豆固醇衍生物。具體地講，在積聚7-脫氫-膽固醇的?；サ纳镏校c相應的野生型生物相比，HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. I. 34)、和/或Λ 24-還原酶、和/或羊毛固醇C14-脫甲基酶/細胞色素Ρ45051 (ECI. 14. 13. 70)、和/或鯊烯-環(huán)氧酶/鯊烯_單加氧酶(ECI. 14. 99. 7)的活性可被增加。另外，與相應的野生型生物相比，SAM C-24固醇甲基轉移酶、和/或C-22固醇去飽和酶和/或C-5固醇去飽和酶的活性可被降低或消除。在積聚麥角固醇的?；サ纳镏?，與相應的野生型生物相比，HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. I. 34)、和/或羊毛固醇C14-脫甲基酶/細胞色素P45051(EC1. 14. 13. 70)和/或鯊烯-環(huán)氧酶/鯊烯-單加氧酶(EC1. 14. 99. 7)的活性可被增加。在積聚麥角留二烯醇的酰基酯的生物中，與相應的野生型生物相比，HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. 1.34)、和/或羊毛固醇(14-脫甲基酶/細胞色素P450 51 (EC I. 14. 13. 70)、和/或鯊烯-環(huán)氧酶/鯊烯_單加氧酶(ECI. 14. 99. 7)的活性可被增加，和/或與相應的野生型生物相比，Λ 22-去飽和酶/細胞色素Ρ45061 (EC1. 14. 14. I)活性可被降低。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述類固醇是雄酮、雄酮衍生物、睪酮、睪酮衍生物、雄烯二醇、雄烯二醇衍生物、雄烯二酮、雄烯二酮衍生物、卡普睪酮、卡普睪酮衍生物、美雄醇、美雄醇衍生物、勃拉睪酮、勃拉睪酮衍生物、表雄酮、表雄酮衍生物、美雄諾龍(mestanolone)、美雄諾龍衍生物、二氫睪酮(stanolone)、二氫睪酮衍生物、司騰勃龍(stenbolone)、司騰勃龍衍生物、表睪酮、表睪酮衍生物、皮質醇、皮質醇衍生物、醒固酮、醒固酮衍生物、孕烯諾龍、孕烯諾龍衍生物、可的松、可的松衍生物、皮質酮、皮質酮衍生物、炔諾酮、炔諾酮衍生物、尿皮質醇或尿皮質醇衍生物。在本發(fā)明第五和第六方面的一個優(yōu)選的實施方案中，能積聚固醇脂質的?；サ纳锸且韵律锾烊痪哂袑е孪鄳檀贾|合成的生物合成途徑并且其中，更優(yōu)選的是，與相應的未經改造的生物相比相應途徑的酶活性被增加，以達到相應固醇脂質的更高積聚。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第一至第六方面的生物在其脂質粒中能積聚異戊烯醇脂質。異戊烯醇脂質是由主要通過甲羥戊酸(MVA)途徑而產生的5-碳前體異戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯合成而來。異戊烯醇脂質包括類異戊二烯、醌和氫醌、聚異戊烯醇、hopanoid和某些其它少量種類。簡單的類異戊二烯(線狀醇、二磷酸酯等)是通過依次加入C5單元而形成，并且按照這些萜單元數(shù)目而分類。含有大于40個碳的結構稱為多萜。類胡蘿卜素是重要的簡單類異戊二烯，其功能是作為抗氧化劑和維生素A的前體。另一類生物學上重要的分子是例如醌和氫醌，其含有與非類異戊二烯起源的醌型核心相連接的類異戊二烯尾。維生素E和維生素K，以及泛醌，就是這一類的實例。細菌合成聚異戊烯醇(稱為細菌異戊烯醇)，其中與氧連接的末端類異戊二烯單元仍然是不飽和的，而在動物聚異戊烯醇(多萜醇類)中末端類異戊二烯則被還原。在一個優(yōu)選的實施方案中，積聚在脂質粒中的異戊烯醇脂質是類異 戊二烯。所述類異戊二烯包括例如C5類異戊二烯、ClO類異戊二烯(單萜)、C15類異戊二烯(倍半萜)、C20類異戊二烯(二萜)、C25類異戊二烯(二倍半萜)、C30類異戊二烯(三萜)、C40類異戊二烯(四萜)、多萜和類視黃醇。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述類異戊二烯是三萜。三萜由六個異戊二烯單元組成并具有基本分子式C3(iH48_5(i。這一類包括例如3S-鯊烯-2，3-環(huán)氧化物、鯊烯、前鯊烯二磷酸酯、四膜蟲醇(tetrahymanol)、α-香樹素、β -香樹素、羽扇豆醇、羽扇豆醇乙酸酯、蒲公英固醇、印楝素Al、新苦木素、苦木素和3-乙?；?I-巴豆?；￠亍＞€狀三萜鯊烯，鯊魚魚肝油的主要成分，源自兩分子法尼基焦磷酸酯還原性偶聯(lián)。鯊烯再經生物合成加工而產生羊毛固醇或環(huán)阿屯醇，這是所有類固醇的結構前體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，脂質粒中積聚的異戊烯醇脂質是鯊烯或鯊烯衍生物。鯊烯衍生物包括與主鏈碳原子連接的一個或多個、特別是1-10個或1-4個額外甲基或乙基，而非如鯊烯中與主鏈碳原子連接的氫原子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物、優(yōu)選本發(fā)明第一、第三和第五方面的生物，是在其脂質粒中不產生和貯存蠟酯的生物，例如如上所述的真菌生物，和更優(yōu)選酵母屬的真菌生物，最優(yōu)選釀酒酵母。按照本發(fā)明第一、第三和第五方面而經改造、使其不合成三酰甘油和/或固醇基?；サ乃錾铮軌蛟谄渲|粒中合成并貯存異戊烯醇脂質、尤其是鯊烯，因此允許在脂質粒中以基本純或更純形式產生這樣的異戊烯醇脂質。因此，已經通過在酵母生物中消除TAG和/或SAE生物合成的合成途徑，可大大提高所述生物產生的鯊烯的產量和純度?？赏ㄟ^以下方式達到對所述生物的鯊烯產生的另一改進改造所述生物的代謝以使導致鯊烯合成的酶活性增加并使將鯊烯轉化為其它化合物的途徑的酶活性降低。鯊烯生物合成途徑的基因是已知的并將其克隆到例如釀酒酵母中。主要的瓶頸酶是 HMG-輔酶 A-還原酶(HMGl) (Basson 等(Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 3793-3808) 因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明第一、第三或第五方面的生物在其脂質粒中能夠積聚鯊烯并且特征在于與相應的未經改造的生物、優(yōu)選與相應的野生型生物相比HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. 1.34)的活性增加?？赏ㄟ^本領域技術人員眾所周知的并且也詳述于下文的方式和方法，使HMG-輔酶A-還原酶活性增加。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過在所述生物中表達僅編碼酶的催化區(qū)、而不編碼膜結合結構域的HMG-輔酶A-還原酶基因，而達到使HMG-輔酶A-還原酶活性增加。這樣的改變已經描述于EP-A 486 290。通過這樣的改造，避免了麥角固醇生物合成途徑的中間體對HMG-輔酶A-還原酶的反饋調節(jié)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明生物的HMG-輔酶A-還原酶編碼基因處于異源啟動子控制之下，所述異源啟動子即對HMG-輔酶A-還原酶基因而言是外源的啟動子，尤其是該啟動子是其活性不受麥角固醇生物合成途徑的中間體調節(jié)的啟動子。合適的啟動子的實例是ADHl啟動子，尤其是表現(xiàn)出接近組成型表達的“平均”ADHl啟動子(Ruohonen等，Journal ofBiotechnology 39 (1995),193-203)。在某些生物、例如酵母中，可將鯊烯轉化為其它化合物、尤其是麥角固醇和麥角固醇生物合成途徑的中間體。導致麥角固醇((22E)-麥角留-5，7，22-三烯-3-0-醇)形成的化學反應和途徑發(fā)生在麥角、酵母和霉菌中。在這些生物中，由鯊烯單加氧酶/鯊烯環(huán)氧酶(EC1. 14. 99. 7 ;也稱為鯊烯環(huán)氧酶或ERG1)將鯊烯轉化為(S)-2，3-環(huán)氧鯊烯，接著再通過2，3-氧化鯊烯-羊毛固醇環(huán)化(EC5. 4. 99. 7 ；ERG7)將其轉化為羊毛固醇。再由細胞色素P450羊毛固醇14a-脫甲基酶(ECI. 14. 13. 70 ;ERG11)，使用NADPH和02，將羊毛固醇轉化為4，4_ 二甲基-膽甾-8，14，24-三烯醇，再由C14固醇還原酶(EC1. 3. I. 70 ;ERG24)，·使用NADPH，將其轉化為4，4_ 二甲基-8，24-膽留二烯醇。再通過C-4固醇甲基氧化酶(ECI. 14. 13. 72 ；ERG25)的作用，將該化合物進一步轉化為4-甲基_8，24-膽甾二烯醇。該物質由C-3固醇脫氫酶(EC1. I. I. 170 ；ERG26)轉化為3-酮-4-甲基酵母固醇。隨后通過3-酮固醇還原酶(EC1. I. I. 270 ；ERG27)將3-酮-4-甲基酵母固醇轉化為酵母固醇。酵母固醇本身再與S-腺苷-L-甲硫氨酸一起，通過SAM C-24固醇甲基轉移酶(EC2. I. I. 41 ；ERG6)的作用而轉化為糞固醇和S-腺苷-高半胱氨酸。糞固醇再通過C-8固醇異構酶(ERG2)的作用轉化為麥角甾二烯醇，其再通過C-5固醇去飽和酶(EC1. 14. 21. 6 ;ERG3)，通過使用NADPH和02，而轉化為5，7，24 (28)-麥角甾三烯醇。該化合物通過C-22固醇去飽和酶(EC1. 14. 14 ；ERG5)的作用進一步轉化為5，7，22，24 (28)-麥角甾四烯醇。5,7,22,24 (28)-麥角甾四烯醇再通過C-24固醇還原酶(EC1. 3. I. 71 ；ERG4)的作用轉化為麥角固醇。如果希望本發(fā)明的生物在脂質粒中積聚鯊烯和如果該生物來源于能天然合成麥角固醇或起始自鯊烯的麥角固醇途徑的中間體的生物，則需要它降低所述生物的從鯊烯到麥角固醇的途徑的一種或多種上述酶活性。原則上，上述麥角固醇途徑的上述酶的任何一種、不止一種或所有都可被降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，鯊烯單加氧酶(EC1. 14. 99. 7 ;也稱為鯊烯環(huán)氧酶或ERG1)的活性降低，然而，并非完全消除，因為某些固醇合成是酵母細胞生存所必需的。也可降低以下涉及麥角固醇生物合成的一種或多種酶的活性SAM:C-24固醇甲基轉移酶(EC2. I. 1.41)、C-22固醇去飽和酶(ECI. 14. 14)和C-5固醇去飽和酶(ECI. 14. 21. 6)。所有這些都適用于本發(fā)明的上述任何實施方案。作為本發(fā)明的組成部分，但作為獨立特性，使用關于經遺傳改造的生物的以下特征。在本發(fā)明內，也已經發(fā)現(xiàn)基因SAKl和/或HAP4在酵母釀酒中的組成型過量表達導致脂質、尤其是鯊烯和固醇的產量的大量增加?；騍AKl和HAP4涉及呼吸-發(fā)酵變化分布(respiro-fermentative flux distribution)?；騍AKl編碼上游絲氨酸/蘇氨酸激酶，其負責Snflp/Snf4p復合物的磷酸化。磷酸化產生位于核內的活性Snflp/Snf4p復合物。Snflp/Snf4p復合物屬于蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶并在“二次轉換(diauxic shift)”期間在免除葡萄糖阻遏中起到主要作用。二次轉換是指當培養(yǎng)基中的葡萄糖或其它發(fā)酵性碳源被消耗時，從發(fā)酵代謝向呼吸代謝的轉換。Snfl/Snf4復合物的范圍遠達分別負責葡萄糖阻遏和解除阻遏的級聯(lián)的層次(hierarchy)。在二次轉換過程中,在釀酒酵母的6000個基因中約有1/4的表達水平顯著改變。這些重大改變主要涉及從發(fā)酵模式向呼吸模式的轉換的主要代謝。在發(fā)酵模式中，酵母細胞代謝可發(fā)酵碳源例如葡萄糖，產生乙醇和二氧化碳。在呼吸模式中，所產生的乙醇被呼吸而得到三磷酸腺苷(ATP)，其在細胞中提供能量。在二次轉換過程中，Snflp/Snf4p復合物被Snfl-激酶Saklp、Toslp和Elmlp磷酸化并因此被激活?；罨膹秃衔镂挥诤藘?，其中它影響兩種轉錄因子Miglp和Cat8p。鋅指蛋白Mig Ip是轉錄阻遏蛋白，其募集蛋白Tuplp和Cyc8p，與作為復合物的大量葡萄糖阻遏基因的某種共有序列結合，因此該共有序列的基因下游的轉錄被阻遏。CatSp是轉錄激活蛋白并且當培養(yǎng)基中的葡萄糖被耗盡時誘導至少34個基因表達。這些基因是乙醛酸旁路的主要基因，所述旁路是C2化合物例如乙醇或乙酸代謝所必需的。除此之外，負責檸檬酸循環(huán)和乙醛酸旁路的中間體的胞內轉運的 基因也受到Cat8p的調節(jié)?；钚許nflp/Snf4p復合物使Mig Ip磷酸化,而該蛋白質失活并從核中移出并使CatSp和Sip Ip (—種功能性同源物)磷酸化，其導致這兩種蛋白質失活?；钚許nflp/Snf4p復合物位于核內，因此顯著促進了對葡萄糖阻遏的免除和從發(fā)酵向呼吸的轉換，因為它影響阻遏級聯(lián)的若干轉錄因子。因此，本發(fā)明的生物可經進一步開發(fā)，使其具有更多活性Snflp/Snf4p復合物,甚至在葡萄糖存在時。這樣的改造可通過蛋白Saklp的轉錄失調(transcriptional deregulation)而達到,所述蛋白是磷酸化的主要激酶并因此激活Snflp/Snf4p復合物。Hap2/3/4/5蛋白復合物調節(jié)大量的葡萄糖阻遏基因。這些基因是呼吸鏈和檸檬酸循環(huán)的主要基因。作為激活物，它在二次轉換期間誘導這些基因轉錄并強烈促進呼吸-發(fā)酵平衡轉向呼吸方向的轉移?；騂AP2、HAP3和HAP5是組成型表達的。天然HAP4僅在非發(fā)酵性碳源上生長時才表達。在培養(yǎng)HAP4-過量表達的突變型菌株期間，觀察到該突變導致生長率、生物量和乙酸產量提高并使甘油和乙醇的形成降低。Hap2/3/4/5蛋白復合物通過增加呼吸量、線粒體生物發(fā)生和通過檸檬酸循環(huán)的碳通量而增殖呼吸系統(tǒng)。 在本發(fā)明內的另一觀察結果就是，在生物例如酵母、尤其是釀酒酵母中，基因FLDl的缺失導致脂質產量、尤其是鯊烯產量的意想不到的顯著增加。基因FLDl編碼涉及脂質滴形態(tài)、數(shù)目和大小的seipin蛋白。據報道FLDl的過量表達導致脂質粒融合，其導致在酵母細胞中形成明顯增大、但數(shù)量更少的脂質粒。在野生型酵母菌株中，鯊烯是固醇生物合成途徑的中間體并且不在細胞內積聚。通過在酵母中表達如EP-A 486 290所述的僅編碼酶的催化部分、但不編碼膜結合結構域的HMG-輔酶A-還原酶基因，而達到的HMG-輔酶A-還原酶的活性增加，導致鯊烯在細胞中積聚。這樣的積聚是因為避免了麥角固醇生物合成途徑的中間體對HMG-輔酶A-還原酶的反饋調節(jié)。在本發(fā)明框架內觀察到在表現(xiàn)出HMG-輔酶A-還原酶活性增加的酵母菌株中，基因FLDl的缺失導致脂質產量、尤其是鯊烯產量的意想不到的顯著增加。對于SAK1、HAP4和FLDl的上述發(fā)現(xiàn)導致進一步改進和如上所述的本發(fā)明六方面中的任一方面的實施方案。然而，這些發(fā)現(xiàn)對于不包含上述改造、但具有合成相應未經改造生物通常能合成的所有脂質的能力的生物而言也具有獨立價值。在這種情況下，未經改造的生物包括除了野生型之外的所述生物，其具有與相應的野生型生物相比增加的HMG-輔酶A-還原酶(ECI. I. I. 34)活性。因此，本發(fā)明也包括分離的經遺傳改造的非哺乳動物生物，其中與相應的野生型生物相比，基因HAP4和/或SAKl是轉錄失調的和/或過量表達的和/或其中基因FLDl被阻遏或失活或缺失。具體地講，可將基因HAP4和SAKl中的一個或這兩者置于組成型活化啟動子例如(任選)ADH I啟動子控制之下。在該變體的另一個實施方案中，與相應的野生型生物相比，基因REGl被阻遏或失活或缺失。除此之外，本發(fā)明的所有前述解釋都以類似方式適用于該獨立方面并且先前所公開的任何特征也都可結合到該獨立方面。本發(fā)明也涉及產生第二脂質的方法，其中使用和培養(yǎng)本發(fā)明的生物，和其中從所述生物中分離出第二脂質。例如，本發(fā)明產生異戊烯醇脂質的方法包括培養(yǎng)如上所述的本
發(fā)明第三或第四方面的生物，所述生物在其脂質粒中能積聚異戊烯醇脂質。對于所積聚的異戊烯醇脂質，同樣適用于以上對于本發(fā)明第三和第四方面的生物所述的優(yōu)選實施方案。同樣適用于相應生物中降低或增加的酶活性。作為另一實例，產生固醇基酰基酯的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明第五或第六方面的生物。與相應的未經改造的生物相比，如上所述的蛋白質或酶活性的降低優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少75 %，甚至更優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少90 %和最優(yōu)選100 %0 100%的降低是指無蛋白質或所述酶的酶活性在所述生物中存在。與相應的未經改造的生物相比，如上所述的酶或蛋白質活性增加優(yōu)選至少10%,更優(yōu)選至少50%,甚至更優(yōu)選至少200%,特別優(yōu)選至少1000%。術語“增加”也包括在未經改造的生物不含任何可檢測的所述活性的情況下，存在(任何可檢測的)酶活性或蛋白質。術語“活性增加”還包括在所有這些情況下的蛋白質量的增加，其中所述蛋白質并非酶(例如HAP4)。然后以上增加參數(shù)以類似方式用于數(shù)量。酶活性可通過以下方式測定向預定量的浸提物中加入預定量的能催化所述浸提物反應而得到產物的酶，并任選額外加入所需反應組分，然后通過在預定的時間周期內測定所合成的產物量。測定上述酶活性的具體方法公開于例如文獻WO 03/064650A1。所述文獻中未描述的上述酶活性的測定以類似方式進行。在細胞中降低給定酶活性的方法是例如降低或消除所述酶的編碼基因的基因表達，例如，通過使用相應基因上游的弱啟動子或者通過所述基因和/或相關啟動子的完全或部分缺失，和/或在生物的細胞內加入酶的抑制劑以抑制所翻譯的酶和/或將SiRNA摻入所述細胞以降低活性轉錄物的量和/或使基因突變以產生活性更低的變體?；虮磉_的降低是指與相應的未經改造的生物、優(yōu)選相應的野生型生物中的所述核苷酸序列的基因表達水平相比，編碼相應酶的核苷酸序列的基因表達水平被降低。同樣適用于上文所述關于活性的水平降低。檢測基因表達水平的方式和方法包括例如測定所合成的相應的mRNA或蛋白質的量或者測定相應蛋白質的酶活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過例如在RNA印跡中檢測mRNA的量來測定基因表達水平。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過例如在蛋白質印跡中檢測所合成的相應蛋白質的量，或者通過測定相應的酶活性量來測定基因表達水平。也可通過使目標基因無功能而達到基因表達的降低。使基因無功能一個可能的方式就是基因中斷。增加酶活性的方法包括細胞轉化，使轉錄失調，使酶的編碼基因(異源或同源)處于組成型活性(同源或異源)啟動子的控制之下，和/或使酶的編碼(異源或同源)基因的拷貝數(shù)增加；和/或通過突變使活性增加。在實施例中提供了使酶活性增加或降低的具體實例。然而，技術人員也可不用本發(fā)明的具體公開內容，而是利用本領域眾所周知的其它方法。本發(fā)明所用的酶的合適基因序列公開如下，但也可使用具有同樣酶活性的其它基因序列。因此，具體的基因序列或所編碼的蛋白質序列并非本發(fā)明的相關結構特征，而是相同EC(酶學委員會(Enzyme Commision))編號之下的分類。?；o酶A:固醇酰基轉移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)的基因序列包括NC_001135. 4，NC_001147. 6，NM_005891, NM_144784, NM_153728。二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)的基因序列包括NC_001147. 5，XM_002478787, NM_123089, XM_002378082, NM_032564, NM_001012345,NM_010046, XM_002146497。 卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二酰基甘油?；D移酶(EC2. 3. I. 158)的基因序列包括NC_001147. 6,NM_008490, NM_001162568, NM_000229, NM_001005715, NM_017024,NM_001082190。?；o酶A-蠟醇?；D移酶(EC2. 3. I. 75)的基因序列包括NM_123089，NM_177448.HMG-CoOA-還原酶的基因序列包括NC_001145，NM_106299, NC_003421. 2，NC_009784. 1，NC_003028. 3，NC_007308. 3，和圖 5 的序列(截短的，tHMGl)。C-24 固醇甲基轉移酶的基因序列包括NC_001145，NC_000911. 1，NC_003423. 3，XM_505173, XM_716615。C-22 固醇去飽和酶的基因序列包括NC_003424. 3，NC_009046. 1，NC_001145. 2，XM_500188, XM_711840。C-5 固醇去飽和酶的基因序列包括NC_001144，S46162, NG_009446, NM_053642, NM_001035356, XM_503090, XM_708519。HAP4v 的基因序列包括NC_001143. 7，XM_448596, XM_001645329。SAKl 的基因序列包括NC_001137.2， XM_502591, XM_448319, XM_453478,NM_208704。REGl 的基因序列包括NC_001136. 8，XM_500990, XM_448729, XM_455276。FLDl 的基因序列包括NC_001144. 4，NM_210286, XM_001647166, XM_449778。7-脫氫膽固醇還原酶的基因序列包括NM_103926，NM_001360, NM_007856,NM_203904, NM_001014927, NM_201330,匪_022389， NM_001131727, NM_001087087,XM_001497598, XM_001174160, XM_001099101, BM490402, CA753545。24-脫氫膽固醇還原酶的基因序列包括ΝΜ_014762，NM_001016800,NM_001094456, NM_001008645, NM_001103276, NM_001080148, NM_053272, NM_00103128,XM_001488247, AB125202, XM_001153751。羊毛固醇固醇14-脫甲基酶的基因序列包括NC_001140. 5，XM_500518,EF059165, XM_445876, XM_454109。鯊烯單加氧酶的基因序列包括NC_001139.8，M64994, XM_503994, XM_706801,XM_455763。
合適的啟動子(異源表達的相應的不同酶的啟動子可以相同或不同)的基因序列包括NC_001142，NC_001139, NC_001147, NC_001139, NC_001148, NC_001135, NC 001136。通常本發(fā)明的生物(無論是上述哪一方面)可以是任何可能的非人類生物，優(yōu)選非哺乳動物生物。合適生物的實例在權利要求中提供。圖I顯示來自所構建的釀酒酵母突變株的總脂質提取物的薄層色譜。圖2圖示了在釀酒酵母中鯊烯的生物合成。圖3圖示了在釀酒酵母中三酰甘油的生物合成。圖4圖示了在釀酒酵母中固醇基?；サ纳锖铣?。圖5圖示了截短的HMG輔酶A-還原酶，tHMGl的序列。 以下實施例僅用于說明本發(fā)明。以下材料與方法用于實施例。I.限制性裂解質粒(1-10 μ g)的限制性裂解在30 μ I的批次(batch)中進行。為此，將DNA溶于24 μ I H2O,并與3μ I相應的緩沖液、I μ I RSA(牛血清白蛋白)和2μ I酶混合。根據DNA的量，酶濃度為I單位/ μ I或5單位/ μ I。在某些情況下，再將I μ I RNase加入到該批次中，以降解tRNA。將該限制性批次在37°C孵育2小時。用微型凝膠控制限制酶解。2.凝膠電泳在微型凝膠或寬-微型凝膠儀器中進行凝膠電泳。微型凝膠(約20ml，8包)和寬-微型凝膠(50ml，15或30包)是由含I %瓊脂糖的TAE組成。1*TAE用作流動緩沖液。將樣品(10 μ I)與3 μ I終止液(stopper solution)混合并上樣。用HindIII切割的I-DNA用作標準(條帶在23. Ikb ；9. 4kb ；6. 6kb ；4. 4kb ；2. 3kb ；2. Okb ；0. 6kb)。為了分離，在 80V電壓下進行45-60分鐘。然后，將凝膠在溴化乙錠溶液中染色并在紫外燈下用視頻文件系統(tǒng)INTAS或用橙色濾色片攝影來記錄。3.凝膠洗脫經凝膠洗脫分離所需片段。將限制性制備物用于幾包微型凝膠并分離。僅[入]-HindIII和“犧牲痕跡(sacrifice trace) ”在溴化乙錠溶液中著色,在紫外燈下觀察，并標記所需片段。結果，DNA受到保護避免了溴化乙錠和紫外燈對剩余包的破壞。通過將染色和未染色膠塊進行比對，根據標記，可切下未染色膠塊的所需片段。將帶有待分離片段的瓊脂糖塊加入到透析管中，用少量TAE緩沖液封閉，避免氣泡，并放入BioRad-微型凝膠儀器中。流動緩沖液是由1*TAE組成，電壓為100V，進行40分鐘。然后，改變流動極性達2分鐘，以松開粘附在透析管上的DNA。將含有DNA片段的透析管緩沖液移入反應容器中，進行乙醇沉淀。為此，將部分(1/10)體積的3M乙酸鈉、tRNA (I μ 1/50 μ I溶液)和2. 5倍體積的冰冷的96%乙醇加入到DNA溶液中。將該批次在_20°C孵育30分鐘，然后在12，OOOrpm于4°C離心30分鐘。DNA沉淀經干燥后溶于10-50 μ I H2O (根據DNA的量)。4. Klenow 處理通過Klenow處理補平DNA片段的突出端，使得形成“平端”。每Iyg DNA中，將以下批次移液在一起在這種情況下，DNA應當來源于乙醇沉淀，以防來自抑制Klenow-聚合酶的污染物。在37°C孵育30分鐘，然后在70°C再孵育5分鐘，終止反應。通過乙醇沉淀，從該批次得到DNA并將其溶于10 μ I H2O0
5.連接將待連接的DNA片段合并。13. I μ I的終體積含有約O. 5 μ g DNA,載體-插入片段比例為I : 5。將樣品在70°C孵育45秒，冷卻至室溫(約3分鐘)，再在冰上孵育10分鐘。然后加入連接緩沖液2. 6μ I 500mmolTrisHCl, pH 7. 5 I. 3μ I IOOmmol MgCl2，并將其在冰上再孵育10分鐘。加入1μ I 500mmol DTT和1μ I IOmmol ATP之后，在冰上加入I μ I連接酶α單位/ μ I)再過 ο分鐘。整個處理都應在盡可能少的搖動下進行，以防止鄰接的DNA末端再分離。連接在14°C進行過夜。6.大腸桿菌轉化用連接制備物DNA轉化感受態(tài)(Component)大腸桿菌匪522細胞。作為陽性對照，供應含50ng pScL3質粒的批次，而作為空白對照，供應不含DNA的批次。對于每次轉化制備，將100 μ I 8% PEG溶液、10 μ I DNA和200 μ I感受態(tài)細胞(大腸桿菌匪522)移液至桌面離心管。將各批放在冰上過30分鐘并間歇性振搖。然后，進行熱沖擊42°C I分鐘。對 于再生，將Iml LB培養(yǎng)基加入到細胞中并在振蕩器上在37°C孵育90分鐘。將100 μ I的各未稀釋批次、I 10稀釋液和I : 100稀釋液涂布于LB+氨芐青霉素平板上并在37°C孵育過夜。7.從大腸桿菌分離質粒(微量制備)在37°C和120rpm，將大腸桿菌菌落在桌面離心管中的I. 5mlLB+氨芐青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將細胞在5000rpm于4°C離心5分鐘，將沉淀溶于50 μ I TE-緩沖液。將每批與100 μ I O. 2NNa0H、I % SDS溶液混合，混合并放在冰上過5分鐘(細胞裂解)。然后，加入 400 μ I 乙酸鈉 /NaCl 溶液(230 μ I Η20、130 μ I 3Μ 乙酸鈉和 40 μ I 5Μ NaCl)，將該批混合并在冰上再放置15分鐘(蛋白沉淀)。在11，OOOrpm離心15分鐘后，將含有質粒-DNA的上清液移入Eppendorf管。如果上清液并未完全澄清，就再離心一次。將上清液與360 μ I冰冷的異丙醇混合并在_20°C孵育30分鐘(DNA沉淀)。將DNA離心(15分鐘，12，OOOrpm, 40C )，棄去上清液，沉淀在100 μ I冰冷的96%乙醇中洗滌，在_20°C孵育15分鐘，再次離心(15分鐘，12，OOOrpm, 40C )。沉淀經快速真空干燥并溶于100 μ I H2O0通過限制性分析表征質粒-DNA。為此，對10 μ I各批次進行限制酶切并通過在寬-微型凝膠中進行凝膠電泳而分離(參見上文)。8.在大腸桿菌上分離質粒(大量制備)為了分離更大量質粒-DNA,進行大量制備方法。兩管(plunger) 100ml LB+氨節(jié)青霉素培養(yǎng)基中接種菌落或100 μ I冷凍培養(yǎng)物，其攜帶欲分離的質粒，將其在37°C和120rpm孵育過夜。第二天將培養(yǎng)物(200ml)移入GSA燒杯并在4000rpm(2600*g)離心10分鐘。將細胞沉淀重懸于6ml TE-緩沖液中。為了消化細胞壁，加入I. 2ml溶菌酶溶液(20mg/mlTE-緩沖液)，并將其在室溫下孵育10分鐘。然后，用12ml O. 2NNa0H、I % SDS溶液進行細胞裂解,并在室溫下再孵育5分鐘。通過加入9ml冷的3M乙酸鈉溶液(pH 4. 8)沉淀蛋白質并在冰上孵育15分鐘。離心(GSA 13, OOOrpm(27, 500*g)，20分鐘，4°C )之后，將含有DNA的上清液移入新的GSA燒杯，再用15ml冰冷的異丙醇沉淀DNA并在_20°C孵育30分鐘。將DNA沉淀在5ml冰冷的乙醇中洗滌并風干(約30-60分鐘)。然后，將其重懸于Iml H2O0通過限制性分析檢查質粒。通過將稀釋液上樣到微型凝膠上而測定濃度。為了降低鹽含量，進行30-60分鐘微透析(孔徑O. 025 μ m)。
9.酵母轉化對于酵母轉化，制備釀酒酵母AH22菌株的預培養(yǎng)物。一管20mlYE培養(yǎng)基中接種100 μ I冷凍培養(yǎng)物并在28°C和120rpm孵育過夜。在一管100ml YE培養(yǎng)基中接種10 μ I、20 μ I或50 μ I預培養(yǎng)物的相同條件下進行主要培養(yǎng)。9. I產生感受態(tài)細胞第二天,用Thoma chamber對各管計數(shù),用容納3_5*107細胞/ml的管繼續(xù)該程序。通過離心(GSA 5000rpm(4000*g)，10分鐘)收獲細胞。將細胞沉淀物重懸于IOml TE-緩沖液中并分裝兩個桌面離心管(各5ml)。在6000rpm將細胞離心3分鐘并洗滌2次，每次各用5mlTE-緩沖液。然后，將細胞沉淀物按IO9細胞溶于330 μ I乙酸鋰緩沖液，移至無菌50ml錐形瓶并在28°C振搖I小時。結果，細胞處于轉化的感受態(tài)。9. 2 轉化
對于每次轉化制備，將15μ I鯡魚精DNA(10mg/ml)、10y I待轉化的DNA(約O. 5 μ g)和330 μ I感受態(tài)細胞移液到桌面離心管中并在28°C孵育30分鐘(勿振搖！)。然后，加入700μ1 50% PEG 6000，在28°C將其再孵育I小時，勿振搖。然后在42°C熱擊5分鐘。將100 μ I上清液接種到選擇培養(yǎng)基(YNB，Difco)，以選擇亮氨酸原養(yǎng)型。在G418抗性選擇的情況下，在熱攻擊之后進行細胞再生(參見9. 3再生階段)。9. 3再生階段因為選擇標記是G418抗性，所以細胞需要時間來表達抗性基因。將轉化制備物與4ml YE培養(yǎng)基混合并在28°C在振蕩器(120rpm)上孵育過夜。第二天，將細胞離心(6，OOOrpm, 3分鐘)，溶于Iml YE培養(yǎng)基，并將100 μ I或200 μ I涂布于YE+G418平板上。將各板在28 °C孵育數(shù)天。10. PCR的反應條件聚合酶鏈式反應的反應條件必須針對單個情況來優(yōu)化并且對任何批次不一定有效。因此，所用DNA的量、鹽濃度和解鏈溫度都可以改變。對于我們的問題表述，已經證明將以下物質合并在Eppendorf管中是有利的，其適用于熱循環(huán)器將5 μ I超級緩沖液、8 μ IdNTP (各O. 625 μ M)、5 '-引物、3 '-引物和O. 2 μ g基質DNA (溶于足量水，得到總體積50μ I，用于PCR制備)加入到2μ 1(-0. 1U) Super Taq聚合酶中。將該批簡單離心并用一滴油覆蓋。對于擴增，選擇介于37至40循環(huán)之間。11.從釀酒酵母中分離脂質粒酵母細胞在50ml WMVIII基本培養(yǎng)基上在28 V培養(yǎng)72小時，同時以250rpm往復振搖。按照Leber等(Leber R,Zinser E,Zellnig G,Paltauf F,Daum G. Characterizationof lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast.1994 年 11 月；10(11) :1421-1428),通過離心收獲細胞并分離和純化脂質粒。對于固醇分析，將脂質粒在30%甲醇KOH中在室溫下皂化16小時，用于通過GC對總固醇進行定量測定，或者將固醇直接用氯仿/甲醇(4 I)萃取并通過TLC分析以區(qū)分游離的和酯化的固醇或通過GC對游離固醇進行定量測定。12.鯊烯和固醇分析為了定量測定細胞總脂質和脂質粒的總脂質，將樣品皂化，然后進行GC分析。將1250Deoo的細胞在100°C在0. 5N HCl中處理20分鐘并讓其冷卻至室溫。然后加入3g KOH和12. 5ml甲醇和連苯三酚(2g/l)。為了皂化，將混合物在70°C水浴中孵育2小時。將水解酯提取在正己烷中。將非皂化部分重懸于2ml正己烷。通過GC定量測定鯊烯和固醇，用鯊烯和膽固醇作為內標。在Hewlett-Packard 5890氣相色譜的毛細管柱上分離鯊烯和固醇(25mX O. 25mmX O. 25 μ m[膜厚度]；Chrompack CPSil5)，程序調至 150_250°C。溫度開始是150°C持續(xù)2min ;然后以15°C /分鐘的速度增加到終溫度250°C，在此溫度持續(xù)20min。線速度為30cm/s，氦氣用作載氣，并以分裂方式進行注射。注射體積為Iy I。計算各峰面積并關聯(lián)至I克細胞干重。一式兩份地測定每個樣品。使用麥角固醇和鯊烯的標準品用于鑒定。提取中性脂質并通過Sorger 和 Daum(J. Bacteriol. 184 (2002), 519-524)的方法而定量測定。具體地講，為了定量測定中性脂質，將提取物上樣到硅膠60板并通過使用石油醚-乙醚-乙酸(25 25 1，體積比)的溶劑系統(tǒng)到距離的前三分之一進行色譜展層。然后簡單干燥各板并用石油醚-乙醚(49 1，體積比)的溶劑系統(tǒng)進一步展層到板頂部。通過在TLC小室中用碘蒸氣對薄層板染色，觀察中性脂質。通過光密度掃描進行定量測定。對于鯊烯和固醇分析，釀酒酵母菌株的標準培養(yǎng)方法是 預培養(yǎng)在IOOml搖瓶中的20ml WMVIII培養(yǎng)基中接種20 μ I相應的甘油貯液并在30°C和150rpm培養(yǎng)48小時。主要培養(yǎng)在250ml具有擋板的搖瓶中的50ml WMVIII培養(yǎng)基中接種1%預培養(yǎng)物并在30°C和150rpm培養(yǎng)72小時。實施例I釀酒酵母AH22ura3中的基因AREl和ARE2的缺失載體pUG6 ( GOldener U, Heck S, Fiedler T, Beinhauer JD 和 HegemannJH(1996)。重復用于芽殖酵母的一種新的有效的基因破壞盒(Nucleic Acids Res 242519-24)用于基因AREl和ARE2的缺失。通過同樣方法相繼完成了這兩個基因的缺失。首先缺失ARE1，然后再缺失ARE2。質粒制備之后，通過PCR擴增pUG6片段，得到由loxP-kanMX-loxP組成的工具。構建了引物，以使AREl respec. ARE2編碼序列的5'和3'序列融合到pUG6載體的IoxP區(qū)。所得PCR產物由KanR基因、IoxP位點和AREl respec. ARE2同源區(qū)組成，用于釀酒酵母AH22ura3的整合轉化。酵母中的同源重組導致靶序列的缺失。針對G418的抗性已用于選擇陽性克隆。在該酵母菌株中，ARElrespec. ARE2編碼區(qū)已經缺失。為了制備更多基因缺失的菌株，已從菌株中除去G418抗性。為了該目的，所述菌株已經轉化了 pSH47 (Guldner等，1996)。載體攜帶ere-重組酶以擺脫IoxP位點側接的KanR基因。為了處理PSH47，在5-F0A(5_氟乳清酸)(lg/L)瓊脂板上對菌株進行反向選擇。所得菌株同時攜帶基因AREl和ARE2的缺失。實施例2釀酒酵母AH22ura3中基因DGAl和LROl的缺失載體pUG6 (Guldner等，1996)用于基因DGAl和LROl的缺失。通過同樣方法相繼完成了這兩個基因的缺失。首先缺失DGAl，然后再缺失LROl。質粒制備之后，通過PCR擴增pUG6片段，得到由loxP-kanMX-loxP組成的工具。構建了引物，以使DGAlrespec. LROl編碼序列的5'和3'序列融合到pUG6載體的IoxP區(qū)。
所得PCR產物由KanR基因、IoxP位點和DGAlrespec. LROl同源區(qū)組成，用于釀酒酵母AH22ura3的整合轉化。酵母中的同源重組導致靶序列的缺失。針對G418的抗性已用于選擇陽性克隆。在該酵母菌株中,DGAlrespec. LROl編碼區(qū)已經缺失。為了制備更多基因缺失的菌株，已從菌株中除去G418抗性。為了該目的，所述菌株已經轉化了 pSH47 (Guldner等，1996)。載體攜帶ere-重組酶以擺脫IoxP位點側接的KanR基因。為了處理pSH47，在5-F0A(5_氟乳清酸)(lg/L)瓊脂板上對菌株進行反向選擇。所得菌株同時攜帶基因DGAl和LROl的缺失。實施例3釀酒酵母AH22ura3arelare2中基因DGAl和LROl的缺失
載體pUG6 (GuI dner等，1996)用于基因DGAl和LROl的缺失。通過同樣方法相繼完成了這兩個基因的缺失。首先缺失DGAl，然后再缺失LROl。質粒制備之后，通過PCR擴增pUG6片段，得到由loxP-kanMX-loxP組成的工具。構建了引物，以使DGAlrespec. LROl編碼序列的5'和3'序列融合到pUG6載體的IoxP區(qū)。所得PCR產物由KanR基因、IoxP位點和DGAlrespec. LROl同源區(qū)組成，用于釀酒酵母AH22ura3的整合轉化。酵母中的同源重組導致靶序列的缺失。針對G418的抗性已用于選擇陽性克隆。在該酵母菌株中,DGAlrespec. LROl編碼區(qū)已經缺失。為了制備更多基因缺失的菌株，已從菌株中除去G418抗性。為了該目的，所述菌株已經轉化了 pSH47 (Guldner等，1996)。載體攜帶ere-重組酶以擺脫IoxP位點側接的KanR基因。為了處理pSH47，在F0A(5_氟乳清酸)(lg/L)瓊脂板上對菌株進行反向選擇。所得菌株同時攜帶基因ARE1、ARE2、DGA1和LROl的四重缺失。實施例4t-HMGI在實施例1-3所得的酵母菌株和作為參考菌株的AH22ura3中的表達，使用附加型質粒使用標準方法，通過PCR，自釀酒酵母S288C基因組DNA (Mortimer和Johnston (Genetics 113 (1986), 35-43))擴增 tHMG 的 DNA 序歹丨J (Basson 等(Mol. Cell.Biol. 8 (1988) ,3793-3808))。在此情況下所用的引物是DNA寡聚體tHMG_5'和tHMG-3'。在Klenow處理之后，將所得DNA-片段引入克隆載體pUC19 (Yanisch-Perron等(1985)Improved M13 phage cloning vectors and host strains nucleotide sequences of theM13mpl8 and pUC19 vectors.載于Gene. Bd. 33，S. 103-119)，得到載體 pUC19_tHMG。在質粒分離和用內切核酸酶EcoRI和BamHI對pUC 19-tHMG進行限制酶切之后，將所得片段引入同樣經EcoRI和BamHI處理的酵母表達載體pPT2b (Lang和Looman (AppI. Microbiol.Biotechnol. 44(1995)，147-156))。所產生的質粒 pPT2b_tHMG 含有截短的 ADHl-啟動子(Bennetzen 和 Hall (Yeast 7 (1982), 475-477))和 TRP I-終止子(Tschumper G, CarbonJ. Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and theTRPlgene. Gene. 1980Jul ；10(2) :157-166)，發(fā)現(xiàn) tHMG-DNA 片段就在這兩者之間。通過內切核酸酶EcoRV和NruI，從載體pPT2b_tHMG中分離DNA部分，所述DNA部分含有所謂的中等長度的ADH I-啟動子、tHMG基因和TRPl-終止子。將該DNA部分引入到經內切核酸酶SphI 和 DNA 聚合酶處理過的酵母載體 YEpl3 (Fischhoff 等(Gene 27 (1984)，239-251))。用YEpH2 轉化釀酒酵母 AH22URA3arelare2、AH22URA3dgallrol、AH22URA3arelare2dgallrol 和 AH22URA3。使用 YEpl3 作為參考質粒。實施例5使用染色體整合質粒YDpUHK3，在實施例1_3所得的酵母菌株和作為參考菌株的AH22ura3中染色體整合和過量表達載體YEpH2用內切核酸酶EcoRV和NruI處理。由此產生具有以下區(qū)域的DNA-片段來自四環(huán)素抗性基因的轉錄活化區(qū)(Sidhu和BollondO (1990) 157-166))、中等長度ADH I-啟動子、tHMG和TRPl-終止子(表達盒)。將該DNA-片段引入經StuI處理的載 體 YDpU(Berben 等 1991 Berben G. , Dumont J. , Gilliquet V, BoIIe P-A. und HilgerF. (1991) " The YDp plasmids a uniform set of vectors bearing versatile genedisruption cassettes for" Saccharomyces cerevisiae" . " Yeast 7,475-477)。由此產生的載體YDpUH2/12用內切核酸酶SmaI處理并與編碼卡那霉素抗性的DNA序列連接(Webster, T.D., Dickson, R. C. (1983)Direct selection of Saccharomyces cerevisiaeresistant to the antiobiotic G418 following transformation with a DNA vectorcarrying the kanamycin-resistancegene of Tn903. Gene 26 :243-252)。所產生的構建體(YDpUHK3)用EcoRV處理。用該構建體轉化釀酒酵母AH22菌株。用線狀載體轉化酵母，正如在本實施例中一樣，導致整個質粒在URA3基因座的染色體整合。為了從所整合載體中消除并非表達盒部分的區(qū)域(大腸桿菌復制起點、大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因、TEF-啟動子和卡那霉素抗性基因)，通過FOA選擇，讓已轉化的酵母接受選擇壓力(Boeke等(Methodsin Enzymology 154(1987), 164-175)),以促進尿卩密唳營養(yǎng)缺陷型酵母生長。在選擇中所述尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株攜帶所述的AH22tH3ura8并具有tHMGl-表達盒作為在URA3-基因中的染色體整合。已經評價了表I所示的酵母菌株的鯊烯產率/含量。其中，已將所述菌株在WMVIII培養(yǎng)基中在30°C和150rpm振搖中培養(yǎng)72小時。在O. 5M煮沸的HCl中破壞細胞之后，脂質用20ml正己烷萃取2次并通過GC/MS分析/定量測定(細節(jié)請參見第12項)。得到以下數(shù)據(表I)。表I
權利要求
1.一種分離的經遺傳改造的非哺乳動物生物，其中與相應的野生型生物相比，?；o酶A:固醇?；D移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)和/或二酰基甘油?；D移酶/ 二?；视蚈-酰基轉移酶(EC2. 3. I. 20)和/或卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二酰基甘油?；D移酶(EC2. 3. I. 158)和/或?；o酶A:長鏈醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 75)活性降低或消除，并且其中與相應的野生型生物相比，HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. I. 34)的活性增加。
2.權利要求I的生物， 其中不再合成在相應的野生型生物的脂質粒中積聚的至少第一脂質、優(yōu)選三酰甘油和/或固醇基?；ズ?或蠟酯，和 其中在經遺傳改造的生物的脂質粒中積聚不同于第一脂質的第二脂質， 其中第二脂質優(yōu)選地是中性脂質，更優(yōu)選選自異戊烯醇脂質，尤其是類異戊二烯，甚至更優(yōu)選是三萜，和最優(yōu)選選自鯊烯、鯊烯衍生物、以及固醇脂質優(yōu)選固醇或類固醇的?；?，其中鯊烯衍生物包括與主鏈碳原子連接的一個或多個、特別是1-10個或1-4個額外甲基或乙基，而非如鯊烯中與主鏈碳原子連接的氫原子。
3.權利要求I或2的生物，其中與相應的野生型生物相比，選自以下的一種或兩種或所有酶的活性被降低或消除SAM C-24固醇甲基轉移酶(EC2. I. I. 41)、C_22固醇去飽和酶(ECI. 14. 14.-)和 C-5 固醇去飽和酶(ECI. 14. 21. 6)。
4.權利要求1-3中任一項的生物，其中與相應的野生型生物相比，選自以下的一種或兩種或所有酶的活性被增加鯊烯單加氧酶(EC1. 14.99. 7)、固醇14-脫甲基酶(ECI. 14. 13. 70)和 7-脫氫膽固醇還原酶(ECI. 3. I. 21)。
5.權利要求1-4中任一項的生物，其中除了權利要求I的改變的活性之外，HAP4p和/或SAKlp的活性和/或數(shù)量增加和/或其中REGlp和/或FLDlp的活性和/或數(shù)量降低或消除。
6.權利要求1-5中任一項的生物， 其中所述固醇是膽固醇、膽固醇衍生物、7-脫氫-膽固醇、羊毛固醇、羊毛固醇衍生物、酵母固醇、酵母固醇衍生物、7-烯膽留烷醇、7-烯膽留烷醇衍生物、葫蘆素、葫蘆素衍生物、麥角留二烯醇、麥角留二烯醇衍生物、茶留酮、茶留酮衍生物、油菜素留酮、油菜素留酮衍生物、香蒲固醇、香蒲固醇衍生物、長春花留酮、長春花留酮衍生物、環(huán)桉烯醇、環(huán)桉烯醇衍生物、谷固醇、谷固醇衍生物、異巖藻固醇、異巖藻固醇衍生物、巖藻固醇、巖藻固醇衍生物、柳珊瑚固醇、柳珊瑚固醇衍生物、麥角固醇、麥角固醇衍生物、豆固醇或豆固醇衍生物，或 其中所述類固醇是雄酮、雄酮衍生物、睪酮、睪酮衍生物、雄烯二醇、雄烯二醇衍生物、雄烯二酮、雄烯二酮衍生物、卡普睪酮、卡普睪酮衍生物、美雄醇、美雄醇衍生物、勃拉睪酮、勃拉睪酮衍生物、表雄酮、表雄酮衍生物、美雄諾龍、美雄諾龍衍生物、二氫睪酮、二氫睪酮衍生物、司騰勃龍、司騰勃龍衍生物、表睪酮、表睪酮衍生物、皮質醇、皮質醇衍生物、醛固酮、醛固酮衍生物、孕烯諾龍、孕烯諾龍衍生物、可的松、可的松衍生物、皮質酮、皮質酮衍生物、炔諾酮、炔諾酮衍生物、尿皮質醇或尿皮質醇衍生物。
7.權利要求1-6中任一項的生物， 其中所述生物是原核生物，優(yōu)選細菌，更優(yōu)選選自分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸桿菌(Lactobacillus spec)或鏈霉菌(Streptomyces spec)， 或者其中所述生物是真核生物，優(yōu)選真菌、植物、藻類或昆蟲細胞，更優(yōu)選選自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytics)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、斯達油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、彎假絲酵母(Candida curvata)、圓紅冬抱酵母(Rhodosporidiumtortuloides)、深黃被抱霉(Mortierella isabellina)、爪卩圭毛霉(Mucor javonicus)、酵母屬(Saccharomyces)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、克魯維酵母(Kluyveromycesspec)、根霉屬(Rhizopus)、鐮孢霉屬(Fusarium)、梭孢霉屬(Fusidium)、赤霉屬(Gibberella)、被抱霉屬(Mortierella)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉(Aspergillusspec)、青霉(Penicillium spec)或網柄菌(Dictyostelium spec)，尤其是酵母屬(Saccharomyces)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、德爾布酵母(Saccharomycesdelbruckii)、意大利酵母(Saccharomyces italicus)、捕圓酵母(Saccharomycesellipsoideus)、發(fā)酵性酵母(Saccharomyces fermentati)、克魯維酵母(Saccharomyceskluyveri)、克魯斯酵母(Saccharomyces krusei)、乳酸酵母(Saccharomyces Iactis)、馬克斯酵母(Saccharomyces marxianus)、小捕圓酵母(Saccharomyces microellipsoides)、孟他努酵母(Saccharomyces montanus)Λ Saccharomyces norbensis、產油酵母(Saccharomyces oleaceus)、奇異酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、有抱酵母(Saccharomyces pretoriensis)、羅斯酵母(Saccharomyces rosei)、魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、路德類酵母(Saccharomycodes Iudwigii)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的酵母例如乳酸克魯維酵母(K. Iactis)、馬克斯克魯維酵母馬克斯變種(K. marxianus var.marxianus)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)，假絲酵母屬(Candida)例如產朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、白色假絲酵母(Candidaalbicans)、解脂假絲酵母(Candida lipolytica)和皺狀假絲酵母(Candida versatilis)，畢赤酵母屬(Pichia)例如樹干畢赤酵母(Pichia stipidis)、巴斯德畢赤酵母(Piachiapastoris)和嗜山梨醇畢赤酵母(Pichia sorbitophila)、隱球菌屬(Cryptococcus)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、Saccharomycecopsis、類酵母屬(Saccharomycodes)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、威克酵母屬(Wickerhamia)、德巴利酵母屬(Debayomyces)、有孢漢生酵母屬(Hanseniaspora)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、Ogataea、Kuraish ia、Komagataella、海洋酵母屬(Metschn ikowia)、Williopsis、Nakazawaea、隱球菌屬 Cryptococcus、有抱圓酵母屬(Torulaspora)、布勒擲抱酵母屬(Bullera)、紅酵母屬(Rhodotorula)、Willopsis和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，或選自花生、油菜、云苔、向日葵、afflor、S粟、芥菜、大麻、Rizinus、橄欖、覓菜、墨西哥鼠尾草籽、芝麻、金蓋草、punica、月見草、毛蕊花、薊、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲堅果、鱷梨、楊梅屬植物、南瓜、亞麻、大豆、開心果、紫草、椰子、核桃、玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、水稻、大麥、棉花、樹薯、胡椒、萬壽菊、煎科、土豆、掠櫚、煙草、煎子、蠶豆、豌豆、苜猜、咖啡、可可、荼、柳、牧草、physcomitrella oder ceratodon，或者選自 Cryptista、綠胞藻綱(Chloromonadophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、隱甲藻(Crypthecodinium)、金藻門(Chrysophyta)、娃藻門(Bacillariophyta)、褐藻門(Phaeophyta)、紅藻門(Rhodophyta)、綠藻門(Chlorophyta)、定鞭藻門(Haptophvta)、Cryptista>Euqlenozoa>Dinozoa>Chlorarachniophvta,或者選白草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、果妮屬(Drosophila)。
8.權利要求1-7中任一項的生物用于產生脂質、優(yōu)選第二脂質的應用，其包括培養(yǎng)所述生物并從所述生物中分離脂質。
9.按照權利要求8而獲得的第二脂質在制備輔料制劑中的用途，所述輔料制劑用于疫苗、作為生物可降解潤滑劑、作為包含不同于第二脂質的化妝用或藥用活性物質的化妝品和/或藥物中的輔料，其中將第二脂質與化妝用或藥用活性物質混合并制備制劑用于給藥，優(yōu)選局部或口服給藥。
10.核酸構建體，尤其是質?；蛘媳磉_盒，其包含編碼具有以下一種或多種活性的蛋白質的一種核酸或多種相同或不同的核酸?；o酶A:固醇?；D移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. 1.26)和/或二?；视王；D移酶/ 二酰基甘油O-?；D移酶(EC2. 3.1.20)和/或卵磷脂膽固醇?；D移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)和/或鯊烯單加氧酶(EC1. 14. 99. 7)和/或固醇14-脫甲基酶(ECI. 14. 13. 70)和/或7-脫氫膽固醇還原酶(ECI. 3. I. 21)和/或HAP4p和/或SAKlp, 其中所述核酸處于至少一個優(yōu)選組成型活性啟動子的控制之下。
11.權利要求10的核酸構建體，其中還包含編碼具有HMG-輔酶A-還原酶(EC1. I. I. 34)活性的蛋白質的核酸，其中所述蛋白質處于優(yōu)選組成型活性啟動子的控制之下。
12.權利要求10或11的核酸構建體在制備權利要求1-7中任一項的生物中的用途，其中轉化起源生物，其中所述起源生物是野生型生物或這樣的起源生物其中與相應的野生型生物相比，選自以下的一種或兩種或所有酶的活性降低或消除SAM C-24固醇甲基轉移酶(EC2. I. I. 41)、C-22固醇去飽和酶和/或C-5固醇去飽和酶(ECI. 14. 21. 6)和/或?；o酶A:固醇酰基轉移酶/固醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 26)和/或二酰基甘油?；D移酶/ 二?；视蚈-?；D移酶(EC2. 3. I. 20)和/或卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂二?；视王；D移酶(EC2. 3. I. 158)和/或?；o酶A:長鏈醇O-?；D移酶(EC2. 3. I. 75)和 / 或 REGlp 和 / 或 FLDlp。
全文摘要
本發(fā)明提供分離的經遺傳改造的非哺乳動物生物，其中與相應的野生型生物相比，酰基輔酶A:固醇?；D移酶/固醇O-?；D移酶(EC2.3.1.26)和/或二酰基甘油?；D移酶/二?；视蚈-?；D移酶(EC2.3.1.20)和/或卵磷脂膽固醇酰基轉移酶/磷脂:二?；视王；D移酶(EC2.3.1.158)和/或?；o酶A-蠟醇?；D移酶(EC2.3.1.75)的活性被降低或消除；還提供所述生物的使用方法，用于制備所述生物的穿梭載體和產生所述生物的方法。
文檔編號C12N9/02GK102812124SQ201080038563
公開日2012年12月5日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權日2009年8月26日
發(fā)明者C·朗, A·拉布 申請人:器官平衡有限責任公司