專利名稱：改進(jìn)的基因表達(dá)檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的表達(dá)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及檢測(cè)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的甲基化或非甲基化形式的方法以及相關(guān)寡核苷酸、引物、探針、引物對(duì)和試劑盒。本發(fā)明方法涉及擴(kuò)增技術(shù)，尤其是基于熒光的實(shí)時(shí) PCR和終點(diǎn)PCR方法，具有診斷、預(yù)防和治療用途。
背景技術(shù)：
癌癥睪丸(CT)抗原癌癥睪丸(cancer testis，CT)抗原是一類腫瘤相關(guān)抗原，其表達(dá)通常局限于睪丸、卵巢或滋養(yǎng)層中的生殖細(xì)胞。這些抗原通常不在成體的體細(xì)胞組織中表達(dá) (Simpson 等，Nat. Rev. Cancer, 5 (8) :615-625(2005) ；Scanlan 等，Immunol. Reviews, 188 22-32(2002) ；ScanIan 等，Cane. Immun.，4 1-15 (2004)) 癌癥患者體內(nèi)的CT抗原基因調(diào)控被破壞，導(dǎo)致這些抗原在許多種腫瘤中異常表達(dá)。第一個(gè)被鑒定的CT抗原MAGE-I于二十世紀(jì)90年代早期通過(guò)T-細(xì)胞表位克隆得到 (van der Bruggen 等，1991 Science 13 ；254 (5038) :1643-7 ；van der Bruggen 等，1999 Science 254 1643-1647 ;Traversah 等，1992 Immunogenetics, 35 (3) 145-152 ；以及美國(guó)專利No. 5，342，774，通過(guò)引用并入本文)。從那以后，血清學(xué)表達(dá)克隆技術(shù)(serological expression cloning technique, SEREX) (Sahin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (25) 11810-11813(1995)和美國(guó)專利No. 5，698，396)、酵母表面重組抗原表達(dá)(recombinant antigen expression on yeast surface, RAYS) (Mischo 等，Cane. Immun.，3 :5-16(2003)) 以及差異性mRNA表達(dá)分析(Gure等，Int. J. Cane，85 (5) :726-732(2000))已使得更多的CT 抗原被鑒定出來(lái)。癌癥患者體內(nèi)一些CT抗原的免疫原性使其成為腫瘤疫苗開發(fā)的理想靶標(biāo)。被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞或體液效應(yīng)子所識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原的鑒定已打開了癌癥免疫治療的新前景。免疫治療的理念是基于這一推測(cè)，即腫瘤中表達(dá)的抗原蛋白能夠在利用自體免疫系統(tǒng)的治療方法中用作靶標(biāo)?？乖禺愋园┌Y免疫療法(Antigen-Specific Cancer Immunotherapeutics, ASCI)允許進(jìn)行靶向治療。ASCI具有兩個(gè)主要組分將免疫應(yīng)答特異性靶向于癌細(xì)胞的“腫瘤抗原”，和包含選擇用于提高抗腫瘤免疫應(yīng)答的免疫刺激化合物的“佐劑系統(tǒng)”。CTAGlB。當(dāng)前感興趣的用于癌癥免疫治療的一種癌癥睪丸抗原為由CTAGlB基因(別名為NY-ES0-1基因)編碼的癌癥/睪丸抗原1B。該抗原最初于上世紀(jì)九十年代末在Ludwig癌癥研究院紐約分院通過(guò)SEREX技術(shù)從食管鱗狀細(xì)胞癌中鑒定得到(Chen 等，PNAS USA, 94 (5) :1914-1918(1997)；和美國(guó)專利 No. 5，804，381，incorporated by reference)。CTAGlB蛋白的長(zhǎng)度為180個(gè)氨基酸，已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，這些腫瘤包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、膀胱癌以及黑色素瘤(Konishi J 等.Oncol Rep. 2004 May ； 11 (5) :1063-7 ；Nicholaou T等，Immunol Cell Biol. 2006 Jun ；84(3) :303-17 ；Sugita Y 等.Cancer Res.2004Mar 15 ；64(6) :2199-204 ；Velazquez EF 等.Cancer Immun. 2007 Jul 12 ；7 11 以及 Jungbluth 等.2001，Int.J. Cane,92(6) 856-860)。針對(duì)該抗原的自發(fā)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答已在CTAGlB陽(yáng)性腫瘤患者體內(nèi)有所描述，并已鑒定出許多HLA (人類白細(xì)胞抗原)I類和II類限制肽(Jager等，1998 J. Exp. Med.，187 (2) :265-270 ；Yamaguchi 等，2004 Clin. Cane. Res.，10 (3) :890-961 ；以及 Davis 等，2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (29) 10697-10702)。專利文獻(xiàn)的示例為美國(guó)專利 No. 6，140，050,6, 251，603,6, 242，052,6, 274，145,6, 338，947,6, 417，165,6, 525，177、 6，605，711,6, 689，742,6, 723，832,6, 756，044 和 6，800，730，所有文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。在臨床試驗(yàn)中，已將具有HLA-A2結(jié)合基序的三種部分重疊的CTAGlB衍生肽 (157-167、157-165和155-163)用于疫苗中，以治療12個(gè)具有表達(dá)NY-ES0-1的轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者。該研究表明，合成的NY-ES0-1肽可安全給藥并能夠產(chǎn)生可能有益的T細(xì)胞應(yīng)答 (Jager 等，2000 PNAS USA, 97 (22) 12198-12203)。該蛋白中的許多I類和II類MHC(主要組織相容性復(fù)合體)表位已被不同的研究小組鑒定得到。N端的膠原蛋白樣區(qū)域中包含至少一個(gè)I類MHC表位，在本文中稱為A31。 中間區(qū)域包含幾個(gè)II類MHC表位，在本文中稱為DRl、DR2、DR4、DR7和DP4。該區(qū)域還包含幾個(gè)I類MHC表位，在本文中稱為B35、B5UCw3和Cw6。C端被認(rèn)為含有至少兩個(gè)II類表位(DR4和DP4)和一個(gè)I類表位(A2)。GTAG2.由于其序列與CTAGl的高度相似性，可望用于免疫療法的另一癌癥睪丸抗原為CTAG2(別名為L(zhǎng)AGE-I基因)。已經(jīng)描述了兩種CTAG2轉(zhuǎn)錄本LAGE-I a和LAGE-1 b。 LAGE-I b為不完全剪接，編碼約210個(gè)氨基酸殘基的假定蛋白，而LAGE-I a基因產(chǎn)物含有 180 個(gè)氨基酸殘基(Sun 等.Cancer Immunol Immunother 2006 :55 :644-652)。LAGE-I和NY-ES0-1蛋白的N端區(qū)域高度保守，被認(rèn)為具有超過(guò)97%的同一性。不過(guò)，LAGE-I在中心區(qū)域與NY-ES0-1有所不同，僅有62%的同一性。NY-ES0-1和LAGE-I a 的C端高度保守(超過(guò)97%的同一性)。不過(guò)，LAGE-I b的C端更長(zhǎng)，被認(rèn)為與LAGE-I a/ NY-ES0-1相同區(qū)域的同一性小于50%。關(guān)于這兩個(gè)蛋白的一般信息可從LICR網(wǎng)站中找到(參見www. cancerimmunity. org/CTdatabase)。PRAME-偏好性表達(dá)的黑色素瘤抗原PRAME最初作為編碼被黑色素瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)識(shí)別的人黑色素瘤抗原的基因而分離。PRAME因其在一些正常成體組織 (包括子宮內(nèi)膜和腎上腺)中的痕量表達(dá)水平而未被指定為CT基因。不過(guò)，PRAME確實(shí)表現(xiàn)出CT基因的其他主要特征，即在睪丸中的強(qiáng)表達(dá)和多種腫瘤中的上調(diào)，包括黑色素瘤 (97%)、肉瘤(80%)、小細(xì)胞肺癌(70%)、腎細(xì)胞癌(40%)和頭頸癌(四％)。已觀察到該基因編碼相同蛋白的五種替代性剪接轉(zhuǎn)錄本變體。509個(gè)氨基酸的假定蛋白具有存在于 HLA A24和HLA-A2分子上的已充分表征的表位。MaReA3. MAGE基因?qū)儆诎┌Y/睪丸抗原家族。MAGE基因家族包括超過(guò)20個(gè)成員， 由 MAGE A、B、C 禾Π D 基因組成(Scanlan 等，Q002) Immunol Rev. 188 :22-32 ；Chomez 等， (2001) Cancer Res. 61(14) :5544-51)。它們?cè)?X 染色體上聚簇(Lucas 等.，1998 Cancer Res. 58. 743-752 ；Lucas 等.，1999 Cancer Res 59 :4100-4103 ；Lucas 等.，2000 Int JCancer 87 :55-60 ；Lurquin 等.，1997 Genomics 46 :397-408 ；Muscatelli 等.，1995Proc Natl Acad Sci USA 92 :4987-4991 ；PoId等.，1999 Genomics 59 :161-167 ；Rogner等1995 Genomics 29 :725-731)，功能尚未確定(Ohman 等 2001 Exp Ceu Res. 265(2) :185-94) MAGE基因高度同源，尤其是MAGE-A家族的成員具有60-98%的同源性。人MAGE-A3基因表達(dá)于多種類型的腫瘤中，包括黑色素瘤(Furuta等.2004 Cancer Sci. 95，962-968)、膀胱癌、肝細(xì)胞癌(Qiu 等.2006. Clinical Biochemistry 39，259-266)、胃癌(Honda 等.2004 British Journal of Cancer 90，838-843)、結(jié)腸直腸癌(Kim 等.2006 World Journal of Gastroenterology 12,5651-5657)和肺癌(NSCLC) (Scanlan 等 2002 Immunol Rev. 188 22-32 Jang等2001 Cancer Res. 61，21 :7959-7963)。未在任何正常成體組織中觀察到其表達(dá)，僅有的例外是睪丸生殖細(xì)胞或胎盤(Haas等.1988 Am J Reprod Immunol Microbiol
18:47-51 ；Takahashi 等· 1995 Cancer Res55 :3478-382)。重要的是獲得這樣的定量高通量分析測(cè)定，其能夠特異性鑒定可受益于免疫療法的表達(dá)CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的患者，為劑量目的而監(jiān)測(cè)CTAG1B、CTAG2和/或PRAME 的表達(dá)，在臨床試驗(yàn)中鑒定表達(dá)CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的樣品，或僅僅是對(duì)癌癥早期階段的患者進(jìn)行鑒定。許多可用的診斷方法已被描述，其利用RNA提取和RT-PCR(例如 Odunsi 等·，Cancer Research 63,6076-6083, 2003 ;Sharma 等·，Cancer Immunity, Vol. 3,
19頁(yè)，2003)?，F(xiàn)有測(cè)定的最大缺點(diǎn)是它們需要分離RNA以評(píng)估CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的表達(dá)。福爾馬林固定石蠟包埋的(Formalin-Fixed，I^araffin-EmbeddecbFFPE)腫瘤組織是臨床中心腫瘤組織保存的常用方法。福爾馬林固定改變了組織中RNA分子的結(jié)構(gòu)，引起交聯(lián)和部分降解。部分降解導(dǎo)致產(chǎn)生100-300堿基對(duì)的更小RNA碎片。這些RNA結(jié)構(gòu)的改變限制了從FFPE組織提取出的RNA在檢測(cè)CTAG1B、CTAG2和/或PRAME表達(dá)水平上的應(yīng)用?；蚣谆蚣谆腔虮磉_(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。尤其地，在特定基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 二核苷對(duì)中發(fā)現(xiàn)的胞嘧啶殘基的甲基化可通過(guò)基因表達(dá)的下調(diào)而導(dǎo)致多種病癥。例如，腫瘤抑制因子基因的異常甲基化可導(dǎo)致這些基因的上調(diào)或下調(diào)，因而與許多癌癥的存在和發(fā)生相關(guān)(Hoffmann等.2005Biochem Cell Biol 83:296-321)。異?；蚣谆Ｊ匠３Ｊ莵?lái)源組織特有的。據(jù)此，特定基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)可具有預(yù)測(cè)和診斷用途，并能夠用于疾病相對(duì)階段的檢測(cè)，還可用于預(yù)測(cè)對(duì)特定治療類型的應(yīng)答(Laird. 2003 Nat Rev Cancer 3 253-266)。CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的甲基化狀態(tài)已在癌癥組織中進(jìn)行了一定程度的研究。認(rèn)為DNA甲基化是慢性髓細(xì)胞樣白血病(chronic myeloid leukemia, CLM)中直接導(dǎo)致PRAME基因高表達(dá)的分子機(jī)制。對(duì)PRAME啟動(dòng)子、外顯子1和外顯子2的分析表明， PRAME具有三個(gè)CpG島位于啟動(dòng)子內(nèi)部的20Ibp島，位于外顯子1中的204bp島，以及位于外顯子2中的310bp島，其中僅有外顯子2中的CpG島顯示出表觀遺傳調(diào)節(jié)(Gomez-Roman 等.Leukemia Research 31 (2007) 1521-1528)。與涉及 DNA 甲基化的 DNA 截短 / 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，還顯示出PRAME調(diào)節(jié)區(qū)中確定部分的甲基化模式的改變足以使其在通常不表達(dá)該基因的細(xì)胞中上調(diào)。LAGE-I 甲基化狀態(tài)的改變也有研究(De Smet等.(1999)Molecular and CellularBiology :7327-7335)。由于LAGE-I與LAGE-2/NY-ES0-1的高度序列相似性，很難區(qū)分這兩個(gè)基因啟動(dòng)子序列的甲基化狀態(tài)。結(jié)果在凝膠上顯現(xiàn)的甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)(基于凝膠的MSP測(cè)定)廣泛用于檢測(cè)基因的表觀遺傳學(xué)沉默(Esteller M等.Cancer Res 2001 ；61 :3225-9)，但已開發(fā)了使用其他技術(shù)的定量檢測(cè)方法(Laird Pff.，Nat Rev Cancer 2003 ；3 :253-66 ；Eads 等· Nucleic Acids Res 2000 ；28 :E32 ；Mikeska T 等 J Mol Diagn 2007)。許多基于熒光的技術(shù)可用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)。在US6，090，552和 EP 0912597中描述了一種這樣的技術(shù)，其商品名為Amplifluor 。該方法還適用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)監(jiān)測(cè)。Vlassenbroeck 等(Vlassenbroeck 等.，2008. Journal of Molec. Diagn.，V10, No. 4)描述了一種使用Amplifluor 技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化定的實(shí)時(shí)MSP測(cè)定。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供消除已有測(cè)定的缺點(diǎn)的改進(jìn)測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及測(cè)定表達(dá)的改進(jìn)方法和/或測(cè)定。本發(fā)明還涉及對(duì)通過(guò)使用本文所述寡核苷酸、引物、探針、引物對(duì)、試劑盒和/或方法鑒定為表達(dá)07^讓、07^2、？1^1^和/或 MageA3的患者進(jìn)行某些類型的治療，特別是基于抗原特異性癌癥免疫療法(ASCI)的治療。 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的(蛋白)表達(dá)是通過(guò)測(cè)定 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 /或MageA3基因的甲基化狀態(tài)來(lái)確定的，而不是測(cè)定基因本身的表達(dá)水平。本發(fā)明表明，就 NSCLC、黑色素瘤和乳腺癌樣品中的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME表達(dá)而言，其甲基化測(cè)試的甲基化狀態(tài)結(jié)果與用PT-PCR試驗(yàn)所得結(jié)果非常一致。對(duì)于難以進(jìn)行qRT-PCR的樣品(例如對(duì)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)針穿刺活檢)而言，通過(guò)測(cè)定MageA3基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)到的蛋白表達(dá)提供了有價(jià)值的替代方法。該測(cè)定因此對(duì)選擇(適合于)治療的患者、預(yù)測(cè)患者治療成功的可能性很有用，并可用于輔助患者療法選擇。一方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQ ID N0. 1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一項(xiàng)的核苷酸序列，或基本由其組成， 或由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸、引物或探針以5'至3'的順序包含以下相鄰的序列，或基本由其組成，或由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用第一部分進(jìn)行標(biāo)記，所述第一部分選自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)中的供體部分和受體部分，其中所述供體部分在被激發(fā)時(shí)在一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，所述受體部分吸收和/或猝滅所述供體部分所發(fā)射的熒光；(b)單鏈的第二核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成， 其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用第二部分進(jìn)行標(biāo)記，所述第二部分選自所述供體部分和所述受體部分，且所述第二部分為所述組中未標(biāo)記所述第一核苷酸序列的所述基團(tuán)成員，其中所述第三核苷酸序列與所述第一核苷酸序列為反向互補(bǔ)，使得所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可形成雙聯(lián)體而使所述第一部分與第二部分接近，從而當(dāng)供體部分處于激發(fā)狀態(tài)且發(fā)射熒光時(shí)，受體部分吸收并猝滅所述供體部分發(fā)射的所述熒光； 和(d)在引物的3'末端的單鏈的第四核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成，所述核苷酸在其3'末端包含SEQ ID N0.2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任何一個(gè)核苷酸序列。其中在不形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分和所述第二部分分隔開一定距離，阻止了所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。 3 ‘末端的特定核苷酸序列允許檢測(cè)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)。用適當(dāng)試劑(如下所述)處理后，這些引物偏好性地與CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的未甲基化形式相結(jié)合。本文討論了這些寡核苷酸的特性，該討論適于進(jìn)行必要的修改。該特定核苷酸序列能夠引發(fā)由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3家族基因的甲基化或未甲基化DNA部分的核酸鏈互補(bǔ)。最優(yōu)選地，該寡核苷酸、引物或探針由SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或61的核苷酸序列組成，并用于擴(kuò)增目的基因的一部分。還提供了引物對(duì)，其包括這樣的引物，所述引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63的核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于根據(jù)指導(dǎo)擴(kuò)增相關(guān)基因適當(dāng)部分的有義和反義引物來(lái)確定適用的引物對(duì)(如下所述)。本發(fā)明引物對(duì)的實(shí)例闡述于表1。權(quán)利要求6中也列舉了適用的引物對(duì)。另一方面，提供了試劑盒，其包含至少一種引物、引物對(duì)或引物組，所述單引物、引物對(duì)或引物組包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或
63中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。所述試劑盒用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)，特別是如CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的基因。另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)含DNA的樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3基因甲基化狀態(tài)的方法，其包括(a)用選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基但不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑接觸/處理含DNA的樣品；(b)用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物被設(shè)計(jì)成僅分別與該試劑處理后的甲基化或未甲基化DNA序列結(jié)合，其中所述引物對(duì)中至少一個(gè)引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列(適當(dāng)時(shí))，或基本由其組成，或由其組成。
另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷癌癥或癌癥患病素因(predisposition)的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中樣品中未甲基化CTAGIB、CTAG2、PRAME 和/或MageA3的存在指示了癌癥或癌癥素因。另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3陽(yáng)性腫瘤的存在情況的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中樣品中未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的存在表示存在 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 陽(yáng)性腫瘤?！癈TAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 陽(yáng)性腫瘤”意為表達(dá) CTAGIB、CTAG2、PRAME 和/或MageA3抗原的任何腫瘤或腫瘤細(xì)胞(從患者體內(nèi)分離的)。本發(fā)明還提供了一種鑒定和/或選擇適于用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3 免疫療法進(jìn)行治療的患者的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因是未甲基化的，則該患者(優(yōu)選地)鑒定和/ 或選擇為以CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法進(jìn)行治療。因此，具有未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的患者比體內(nèi)這些基因?yàn)榧谆癄顟B(tài)的那些患者更合適?；蛘?，如果所述基因不是未甲基化狀態(tài)，則該患者優(yōu)選地鑒定和/或選擇為不以 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法進(jìn)行治療。一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)成功治療癌癥的可能性的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是未甲基化的，則以CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3免疫療法成功治療的可能性高于基因甲基化的情況?；蛘?，樣品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表示對(duì)CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法治療有抗性的可能性高于基因未甲基化的情況。因此，檢測(cè)到甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因表示以免疫療法進(jìn)行成功治療的可能性低。另一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了選擇適用的癌癥治療方案的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是未甲基化的，則選擇免疫療法進(jìn)行治療?；蛘撸绻龌虿皇俏醇谆癄顟B(tài)，則禁用免疫療法。本發(fā)明還提供了治療受試者的癌癥的方法，包括施用免疫療法，其中所述受試者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)測(cè)定而進(jìn)行選擇。優(yōu)選地，對(duì)本文所述所有不同的方面而言，檢測(cè)到未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME 和/或MageA3基因相當(dāng)于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3蛋白水平的提高。本發(fā)明還提供一種治療患者的方法，其包括根據(jù)本發(fā)明任一方法和/或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法測(cè)定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，然后向該患者施用本文所述包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3的組合物。所述組合物優(yōu)選在發(fā)現(xiàn)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因未甲基化的情況下施用。另一方面，本發(fā)明提供了一種治療易于復(fù)發(fā)表達(dá)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3之腫瘤的患者的方法，所述患者已通過(guò)治療除去腫瘤組織，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明任一方法和/或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法測(cè)定腫瘤組織中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，然后向該患者施用本文所述包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的組合物。所述組合物優(yōu)選在發(fā)現(xiàn)CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3基因未甲基化的情況下施用。本發(fā)明還提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的組合物在制備用于治療腫瘤患者的藥物中的用途，其中所述患者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)的測(cè)定而被選擇用于治療。還提供了用于腫瘤患者治療的包含CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的組合物，其中所述患者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)的測(cè)定而被選擇用于治療。在另一實(shí)施方案中，提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療易于復(fù)發(fā)表達(dá)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3 之腫瘤的患者，其中所述患者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)的測(cè)定而被選擇用于治療。還提供了包含CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的組合物，其用于治療易于復(fù)發(fā)表達(dá)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3之腫瘤的患者，其中所述患者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)的測(cè)定而被選擇用于治療。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和 /或MageA3基因的存在情況和/或其量的測(cè)定。為開發(fā)該測(cè)定，必須鑒定CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因中易于甲基化的區(qū)域，并開發(fā)出可區(qū)分CTAG1B、CTAG2、PRAME和 /或MageA3基因的未甲基化和甲基化形式的特定寡核苷酸。據(jù)此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。這些寡核苷酸可用于檢測(cè)目的基因的甲基化狀態(tài)。所述寡核苷酸可用作引物和/或探針。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸檢測(cè)基因的未甲基化形式。在某些實(shí)施方案中，這些寡核苷酸包含如本文所述的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由SEQ ID NO. 43代表。此類優(yōu)選的寡核苷酸包含 SEQ ID NO ;1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，四，31，33，35，37， 39，41或61的核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成，用于檢測(cè)基因的未甲基化形式。本發(fā)明中“基因”或“目的基因”優(yōu)選地為CTAGlB和/或CTAG2和/或PRAME和/ 或 MageA3。
“CTAG1B”是經(jīng)HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的基因符號(hào)。該基因位于X染色體上；(位置Xq28)該基因序列在登記號(hào)U87459和匪001327下列出。系統(tǒng)基因ID為 ENSG00000184033。該基因編碼癌癥/睪丸抗原IB[人]。CTAGlB經(jīng)?？苫Q地稱為 “CTAGlB” 或“CTAG” 或 “CTAG1” 或 “NY-ES0-1” 或 “ES01” 或 “LAGE-2” 或 “LAGE2B”，均在本文中使用。該基因的低甲基化可與癌癥的發(fā)病相關(guān)聯(lián)，比如黑色素瘤、肺癌(包括NSCLC)、 前列腺癌或卵巢癌。“CTAG2”是經(jīng)HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的基因符號(hào)。該基因位于X染色體上； (位置Xq28)該基因序列在登記號(hào)A.T012833下列出。系統(tǒng)基因ID為ENSG00000126890。 該基因編碼癌癥/睪丸抗原2 [人]。CTAG2經(jīng)?？苫Q地稱為“CTAG2”或“CAMEL”或 “ES02” LAGE-I或“LAGE-沘”或“MGC3803”或“MGC1387M”，均在本文中使用。該基因的低甲基化可與癌癥的發(fā)病相關(guān)聯(lián)，比如黑色素瘤、肺癌(包括NSCLC)、膀胱癌、前列腺癌、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、食管癌或肝細(xì)胞癌?！癙RAME”是經(jīng)HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的基因符號(hào)。該基因位于第22號(hào)染色體上；(位置22qll.22)該基因序列在序列號(hào)U65011和匪206953下列出。系統(tǒng)基因ID為 ENSG00000185686。該基因編碼黑色素瘤中的抗原[人]。PRAME經(jīng)常可互換地稱為“MAPE” 或“0IP4”，均在本文中使用。該基因的低甲基化可與癌癥的發(fā)病相關(guān)聯(lián)，比如宮頸癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌或頭頸鱗狀細(xì)胞癌。MAGEA3和MAGEA6是經(jīng)HUGO基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)的基因符號(hào)。MAGE-A3基因位于X染色體上(位置:q28)，其基因序列在序列號(hào)NM 005362和ENSG00000197172下列出。MAGE-A3基因編碼黑色素瘤抗原家族A，3。MAGEA6基因位于X染色體上(位置q28)。 MAGE-A3經(jīng)常可互換地稱為MAGE-3或MAGEA3。同樣地，MAGE-A6經(jīng)?？苫Q地稱為MAGE-6 或MAGEA6 ；均在本文中使用。這兩個(gè)基因的低甲基化可與癌癥的發(fā)病相關(guān)聯(lián)，比如黑色素瘤或肺癌(包括NSCLC)。易于被甲基化的CpG 二核苷酸通常集中在人類基因的啟動(dòng)子和/或外顯子和/或內(nèi)含子區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定基因啟動(dòng)子、內(nèi)含子、外顯子1和/或外顯子2區(qū)域的甲基化水平來(lái)評(píng)估該基因的甲基化狀態(tài)。“啟動(dòng)子”是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS)上游的區(qū)域，距離 TSS 約 IOKb、4Kb、3Kb、1Kb、500bp 或 150_300bp。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)中CpG的分布相當(dāng)稀少時(shí)，可在內(nèi)含子和/或外顯子區(qū)域進(jìn)行甲基化水平評(píng)估。用于評(píng)估的區(qū)域可以是同時(shí)包含內(nèi)含子和外顯子序列的區(qū)域，并因此重疊覆蓋兩個(gè)區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“甲基化情形”或“甲基化狀態(tài)”意為DNA序列中一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸處 5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)的存在與否?！俺谆倍x為甲基化水平超出正常水平。因此，它涉及基因中特定CpG位點(diǎn)上胞嘧啶(5-mCyt)的異常甲基化，常發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)。甲基化的正常水平可通過(guò)例如測(cè)定非癌細(xì)胞中的甲基化水平來(lái)定義。“低甲基化”意為與(適當(dāng)對(duì)照樣品中的)“正?！盌NA序列中相應(yīng)CpG 二核苷酸處的5-mCyt量相比，(測(cè)試DNA樣品的)DNA序列中一個(gè)或多個(gè)CpG 二核苷酸處5_mCyt存在量降低。此外，“正?！奔谆娇赏ㄟ^(guò)測(cè)定例如非癌細(xì)胞中的甲基化水平來(lái)定義。本發(fā)明中，CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因(或某些方面中的MageA3)的低甲基化指示該腫瘤相關(guān)抗原基因的表達(dá)升高，提供了可靠的癌癥指標(biāo)。本發(fā)明在另一個(gè)方面提供了檢測(cè)含DNA的樣品中甲基化或未甲基化基因的存在情況和/或其量的方法，包括將至少一種寡核苷酸與所述含DNA的樣品相接觸的步驟，其中所述寡核苷酸包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或
63中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。該方法優(yōu)選地還包含評(píng)估基因是甲基化還是未甲基化的步驟。這可取決于所述寡核苷酸是否與本文所述含DNA樣品中的DNA穩(wěn)定地結(jié)合。用于甲基化狀態(tài)評(píng)估的技術(shù)基于不同的方法?？刹捎眠m用于本發(fā)明寡核苷酸的任何合適的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)甲基化CpG 二核苷酸基序的方法利用了可選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基的試劑。該試劑不修飾甲基化的胞嘧啶殘基，因此允許在下游過(guò)程(優(yōu)選可包括核酸擴(kuò)增)中區(qū)分未甲基化和甲基化的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑可作用于選擇性地使未甲基化胞嘧殘基脫氨。因此，在暴露于該試劑后，未甲基化DNA含有與相應(yīng)甲基化DNA不同的核苷酸序列。胞嘧啶的脫氨導(dǎo)致尿嘧啶殘基的存在，其與胸腺嘧啶具有相同的堿基配對(duì)特性，因而與胞嘧啶堿基配對(duì)行為不同。這使得區(qū)分甲基化與非甲基化胞嘧啶成為可能。評(píng)估序列差異的有用常規(guī)技術(shù)使用寡核苷酸引物。兩種引物設(shè)計(jì)方法是可行的。 第一種，引物可以設(shè)計(jì)成不涵蓋任何DNA甲基化潛在位點(diǎn)。差異性甲基化位點(diǎn)的序列改變位于兩個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)之間，序列改變的識(shí)別需要其他測(cè)定步驟。第二種，引物可以設(shè)計(jì)成與原始處理序列的甲基化或未甲基化形式特異性雜交。雜交后可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并用本領(lǐng)域熟知的任意檢測(cè)系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明引物與DNA發(fā)生了雜交。引物的特異性指示了 DNA是否被修飾，這進(jìn)而指示了 DNA是否被甲基化。如果與靶標(biāo)序列有足夠的互補(bǔ)區(qū)域，如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)核苷酸，則引物也可以包含不干擾雜交但可用于其他操作的額外核苷酸殘基。此類其他殘基的例子可以是用于限制性內(nèi)切酶切割、用于配體結(jié)合或因子結(jié)合的位點(diǎn)或接頭或重復(fù)序列，或是用于觀察目的的殘基。寡核苷酸引物可以對(duì)修飾的甲基化殘基有或沒有特異性。用作引物的優(yōu)選寡核苷酸包含 SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 或61 中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。區(qū)分修飾和未修飾核酸的另一個(gè)常用互補(bǔ)方法是使用寡核苷酸探針。此類探針可直接與修飾的核酸雜交或與修飾核酸的進(jìn)一步產(chǎn)物(例如擴(kuò)增所得產(chǎn)物)雜交?；谔结樀臏y(cè)定利用了與特定序列的寡核苷酸雜交以及其后的雜交體檢測(cè)。在檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物之前還可有進(jìn)一步的純化步驟，例如沉淀步驟。寡核苷酸探針可以用本領(lǐng)域已知的任意檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)記。這些檢測(cè)系統(tǒng)包括但不限于熒光部分、放射性同位素標(biāo)記部分、生物發(fā)光部分、發(fā)光部分、化學(xué)發(fā)光部分、酶、底物、受體或配體。用作探針的寡核苷酸可包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。優(yōu)選的核苷酸探針優(yōu)選地主要包含選自于SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44 和 61 的核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成?！肮押塑账嵋铩痹诒疚闹锌苫Q地稱為“引物”。同樣地，“寡核苷酸探針”在本文中可互換地稱為“探針”。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)基因(或其一部分， 尤其是CpG島)的甲基化狀態(tài)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉MSP技術(shù)。MSP方法中，可用引物對(duì)擴(kuò)增DNA，所述引物對(duì)設(shè)計(jì)成利用由于亞硫酸氫鈉處理而產(chǎn)生的序列差異來(lái)區(qū)分未甲基化與甲基化的DNAOferman JG 等.Proc Natl Acad Sci U S A. 1996Sep 3 ；93 (18) :9821-6 和 WO 97/46705)。MSP 技術(shù)的一個(gè)具體實(shí)例稱為實(shí)時(shí)定量MSP (QMSP)，其允許進(jìn)行實(shí)時(shí)的甲基化DNA定量。實(shí)時(shí)方法通?；趯?duì)擴(kuò)增程序的持續(xù)光學(xué)監(jiān)測(cè)，并利用熒光標(biāo)記試劑，其在產(chǎn)品中的摻入可被定量，并且其量指示了模板中序列的拷貝數(shù)。此類標(biāo)記試劑可為與雙鏈DNA偏好性結(jié)合的熒光染料，通過(guò)與雙鏈DNA結(jié)合其熒光可大大增強(qiáng)?；蛘?，可使用標(biāo)記的引物和/或標(biāo)記的探針。它們代表了眾所周知并市售的實(shí)時(shí)擴(kuò)增技術(shù)的一種特
殊應(yīng)用，如 TAQMAN 、molecular BEACONS 、 AMPLIFLUOR 和
SCORPION DzyNA 等。這些實(shí)時(shí)方法經(jīng)常用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。TaqMan技術(shù)使用含有熒光染料和猝滅染料的線性水解寡核苷酸探針。被照射時(shí)， 受到激發(fā)的熒光染料將能量轉(zhuǎn)移至鄰近的猝滅染料分子上，而不是發(fā)熒光(FRET原理)。 TaqMan探針退火到PCR產(chǎn)物內(nèi)部區(qū)域上，并在其復(fù)制模板時(shí)被聚合酶的外切核酸酶活性切除。這使得猝滅劑活性喪失，報(bào)告染料開始發(fā)射熒光，其強(qiáng)度在每個(gè)循環(huán)中與探針切割速率成正比增長(zhǎng)。分子信標(biāo)也包括熒光和猝滅染料，但它們被設(shè)計(jì)為采取發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)在溶液中為游離狀態(tài)時(shí)使得兩種染料接近以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。當(dāng)信標(biāo)在退火步驟中與靶標(biāo)雜交時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被線性化，兩種染料(供體和受體/猝滅劑)分離。檢測(cè)到的來(lái)自于供體的熒光增強(qiáng)將與可用的PCR產(chǎn)物量相關(guān)聯(lián)。scorpion探針利用單個(gè)核苷酸完成序列特異性引發(fā)和PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。scorpion 探針在未雜交狀態(tài)下保持莖-環(huán)構(gòu)型，熒光團(tuán)與猝滅劑之間發(fā)生FRET。所述莖的3’部分還包含與引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。該序列與特異性引物的5’端通過(guò)不可擴(kuò)增單體相連。 korpion引物延伸后，特異性探針序列能夠在延伸的擴(kuò)增子內(nèi)與其互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，從而打開發(fā)夾環(huán)，使熒光團(tuán)與猝滅劑分離，提供熒光信號(hào)。在重甲基法(Heavymethyl)中，引發(fā)是甲基化特異性的，但這種特異性由不可延伸的寡核苷酸阻斷劑提供，而不是由引物自身提供。阻斷劑與亞硫酸氫鹽處理的DNA以甲基化特異性方式結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)覆蓋引物結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)阻斷劑結(jié)合時(shí)，引物就不能結(jié)合， 因此不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。重甲基法可與實(shí)時(shí)檢測(cè)組合使用。Plexor qPCR與qRT_PCR系統(tǒng)利用兩個(gè)修飾核苷酸之間的特異性相互作用來(lái)完成定量PCR分析。PCR引物之一在其5’端鄰近iso-dC殘基處含有熒光標(biāo)記。另一PCR引物未標(biāo)記。反應(yīng)混合物包括脫氧核苷酸和以猝滅劑dabcyl修飾的iso-dGTP。dabcyl-iso-dGTP 偏好性地?fù)饺肱ciso-dC殘基互補(bǔ)的位點(diǎn)上。dabcyl-iso-dGTP在該位點(diǎn)的摻入導(dǎo)致互補(bǔ)鏈上熒光染料的猝滅和熒光強(qiáng)度降低，這允許在擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行定量。對(duì)這些多重反應(yīng)而言， 對(duì)每個(gè)靶標(biāo)序列使用帶有不同熒光團(tuán)的引物對(duì)。因此，包含 SEQ ID N0. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的寡核苷酸可在上述用于目的基因甲基化檢測(cè)的方法中作為引物或探針。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA的樣品中甲基化或未甲基化目的基因的存在情況和/或其量的實(shí)時(shí)方法，包括(a)用選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基但不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑接觸/處理所述含DNA的樣品。(b)用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物對(duì)中至少一種引物被設(shè)計(jì)成僅分別與該試劑處理后的甲基化或未甲基化DNA序列結(jié)合，其中所述引物對(duì)中至少一種引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。本發(fā)明方法中的目的基因優(yōu)選地為CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因。優(yōu)選地，所述引物對(duì)中至少一種引物為含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分，其排列成使得在未擴(kuò)增時(shí)受體部分使供體部分(激發(fā)狀態(tài))發(fā)射的熒光猝滅，而擴(kuò)增過(guò)程中莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，使得供體與受體部分分開足夠距離以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)?？蓪?duì)此進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，以提供甲基化或未甲基化目的基因存在與否的指示。引物對(duì)中包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63中任一核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的引物優(yōu)選地?cái)y帶所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，測(cè)定了甲基化或未甲基化基因的拷貝數(shù)。這時(shí)，本文所述方法優(yōu)選地還包含以下步驟(c)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化或未甲基化目的基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果，以產(chǎn)生基因拷貝數(shù)輸出。優(yōu)選地，步驟(c)的特征還在于在循環(huán)數(shù)閾值小于或等于40認(rèn)為擴(kuò)增是有效的。對(duì)諸如CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的基因而言，對(duì)其基因未甲基化形式的檢測(cè)可能最為相關(guān)。本發(fā)明的方法允許在樣品中實(shí)時(shí)檢測(cè)甲基化或未甲基化的目的基因的存在情況。 由于本發(fā)明方法為定量方法，因此目的基因甲基化或未甲基化形式的(相對(duì))量也可以在反應(yīng)進(jìn)程中測(cè)定。但是，不一定需要使用實(shí)時(shí)方法。可以僅進(jìn)行分析以確定樣品中是否存在靶標(biāo) DNA。終點(diǎn)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)利用了廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)PCR的相同方法。因此，本發(fā)明的方法可包含檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或未甲基化目的基因存在情況和/或其量的終點(diǎn)法。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)含DNA的樣品中甲基化或未甲基化目的基因的存在情況和/或其量的(終點(diǎn))方法，包括(a)用選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基但不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑接觸/處理所述含DNA的樣品。(b)用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增所述甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物對(duì)中至少一種引物被設(shè)計(jì)成僅分別與該試劑處理后的甲基化或未甲基化DNA序列結(jié)合，其中所述引物對(duì)中至少一種引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。如上所述，本發(fā)明方法中的目的基因優(yōu)選地為CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME 基因。優(yōu)選地，所述引物對(duì)中至少一種引物為含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有具有本文所述特征的分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分。該引物對(duì)中包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62 或 63 中任一核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的引物優(yōu)選地?cái)y帶所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對(duì)諸如CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的基因而言，對(duì)其基因未甲基化形式的檢測(cè)可能最為相關(guān)。設(shè)計(jì)了包含 SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 四、31、33、35、37、39、41或61中任一核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的引物，用于檢測(cè)該試劑處理后未甲基化的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME DNA。不存在未甲基化基因指示了甲基化基因的存在。在想要得到甲基化或未甲基化基因拷貝數(shù)的情況下，該方法還包含以下步驟(c)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化或未甲基化目的基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果，以產(chǎn)生基因拷貝數(shù)輸出。本發(fā)明的所有實(shí)施方案均在加以必要修改后適用于本發(fā)明的終點(diǎn)法方面。終點(diǎn)法分析可能需要使用熒光平板讀數(shù)器或其他適用儀器在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)確定熒光強(qiáng)度。本發(fā)明方法最優(yōu)選地為對(duì)任何合適(含DNA的)測(cè)試樣品進(jìn)行的體內(nèi)或體外方法。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還可包括獲得樣品的步驟。所述測(cè)試樣品為含DNA的樣品，尤其是包括目的基因的含DNA樣品。本發(fā)明方法可用于疾病的診斷，尤其是目的基因甲基化(已知)與疾病發(fā)生相關(guān)時(shí)。含DNA的樣品可包括任何合適的組織樣品或體液。優(yōu)選地，測(cè)試樣品采集自人受試者。就癌癥方面的應(yīng)用而言，樣品可包括從疑似為癌癥的組織或從代表性體液中獲得的組織樣品。CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化已與肺癌相關(guān)聯(lián)，因此本發(fā)明可應(yīng)用于肺癌。因此，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用涉及CTAGlB、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的測(cè)試樣品優(yōu)選地含有肺細(xì)胞或來(lái)自于肺細(xì)胞的核酸(分子)。最優(yōu)選地，樣品為福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織。有兩種類型的肺癌非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。名稱僅描述了腫瘤中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型。測(cè)試樣品優(yōu)選地含有來(lái)自于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的細(xì)胞或核酸。NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌，占肺癌的約80%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述癌癥為NSCLC，所述樣品為肺組織樣品或痰樣品或血清樣品。NSCLC難以治愈，可用的治療通常以盡可能地延長(zhǎng)生命并緩解疾病癥狀為目標(biāo)。NSCLC是最常見的肺癌類型，并與不良預(yù)后相關(guān)。CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化還與黑色素瘤相關(guān)，因此本發(fā)明可應(yīng)用于黑色素瘤。黑色素瘤是色素沉著的易于接觸的病變，已在組織病理學(xué)術(shù)語(yǔ)中得到很好的定義。徑向生長(zhǎng)期(radial growth phase,RGP)早期的黑色素瘤可侵入表皮和乳頭真皮層，但不具有轉(zhuǎn)移能力；此階段的切除幾乎完全是治愈性的。隨后的縱向生長(zhǎng)期(vertical growth phase,VGP)意味著轉(zhuǎn)變成能夠轉(zhuǎn)移的更具侵襲性的階段。因此發(fā)生在 RGP/VGP轉(zhuǎn)變期的基因表達(dá)變化有重要意義。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用的其他測(cè)試樣品包含黑色素瘤細(xì)胞或來(lái)自黑色素瘤細(xì)胞的核酸。優(yōu)選地，測(cè)試樣品來(lái)自皮膚病變。CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的低甲基化還與乳腺癌相關(guān)，因此本發(fā)明可應(yīng)用于乳腺癌。乳腺癌主要分為兩類非侵襲性癌癥和侵襲性癌癥。非侵襲性癌癥包括原位小葉癌和原位導(dǎo)管癌。遺憾的是，乳腺癌常生長(zhǎng)穿過(guò)基底膜，全部乳腺癌中約95%為浸潤(rùn)性或侵襲性癌癥。侵襲性乳腺癌的最常見類型(約75%)為侵襲性導(dǎo)管癌，出現(xiàn)于輸乳管中并通過(guò)管壁傳播。侵襲性小葉癌起源于乳腺，占侵襲性乳腺癌的10-15%。較不常見的侵襲性乳腺癌類型包括如下癌癥炎性乳腺癌、乳頭I^aget氏病、髓樣癌、粘液癌、葉狀腫瘤和小管癌。很少地(約)，乳腺中發(fā)生肉瘤(結(jié)締組織癌癥)。個(gè)體可發(fā)生侵襲性和非侵襲性乳腺癌中的一種、另一種或其組合。因此，另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所用的另一優(yōu)選的測(cè)試樣品包含乳腺細(xì)胞或來(lái)自于乳腺細(xì)胞的核酸分子。最優(yōu)選地，測(cè)試樣品來(lái)自于乳腺組織。其他用于本發(fā)明方法的含DNA樣品包括用于診斷、預(yù)后或個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的樣品。這些樣品可得自例如外科手術(shù)樣品(如活檢或細(xì)針穿刺)、石蠟包埋組織、冷凍腫瘤組織樣品、新鮮腫瘤組織樣品或是新鮮或冷凍的體液。非限定性實(shí)例包括全血、骨髓、腦脊液、 腹水、胸水、淋巴液、血清、血漿、尿液、乳糜、糞便、精液、痰、乳頭分泌物、唾液、棉簽取樣、結(jié)腸清洗樣品和刷取樣。組織和體液可用任何適用方法收集，許多此類方法為本領(lǐng)域眾所周知。石蠟包埋樣品可直接進(jìn)行評(píng)估或?qū)ζ浣M織切片進(jìn)行評(píng)估。術(shù)語(yǔ)“樣品”、“患者樣品”和“患者的樣品”可相互替換使用，意為來(lái)自于患者的含 DNA樣品，如上所述。本發(fā)明方法可在含純化或未純化DNA的樣品中進(jìn)行。不過(guò)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在(a)步驟(試劑處理步驟)操作之前，或作為預(yù)先步驟，從含DNA樣品中分離/提取/純化出DNA。可使用任何適用的DNA分離技術(shù)。純化技術(shù)的實(shí)例可在標(biāo)準(zhǔn)教材如《分子克隆——實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)(第三版)》(Sambrook和Russell，特別參考其附錄8及第5 章)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，純化涉及DNA的醇沉淀。優(yōu)選的醇包括乙醇和異丙醇。合適的純化技術(shù)還包括鹽沉淀法。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，DNA純化技術(shù)包括使用高濃度鹽來(lái)沉淀污染物。例如，所述鹽可包含乙酸鉀和/或乙酸銨，或基本由其組成，或由其組成。 該方法可進(jìn)一步包括除去已沉淀的污染物的步驟，然后通過(guò)醇沉淀回收DNA。在另一實(shí)施方案中，DNA純化技術(shù)是基于使用有機(jī)溶劑從細(xì)胞裂解物中提取出污染物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使用酚、氯仿和異戊醇提取提取DNA。采用合適的條件以確保污染物被分離至有機(jī)相而DNA保留在水相中。此外，試劑盒利用磁珠、硅膜等。此類試劑盒為本領(lǐng)域所熟知并作為商品提供。本發(fā)明方法可利用PUREGENE DNA純化試劑盒。在這些純化技術(shù)的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)醇沉淀來(lái)回收所提取的DNA，比如乙
醇或異丙醇沉淀。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織是臨床中心保存腫瘤組織的常用方法。此類FFPE包埋樣品在DNA提取之前需要脫蠟處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固定在玻片上的FFPE組織樣品或樣品材料首先通過(guò)二甲苯處理來(lái)脫蠟。與二甲苯的接觸時(shí)間必須足以使二甲苯與樣品接觸并相互作用。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將FFPE樣品在 100%二甲苯中脫蠟2小時(shí)。此步驟可再重復(fù)一次以確保完全脫蠟。二甲苯處理后，用70% 乙醇使樣品再水化。本發(fā)明方法適當(dāng)時(shí)還可包括(也是在(a)步驟之前或是作為預(yù)處理步驟)對(duì)從樣品中分離/提取/純化的DNA進(jìn)行定量。樣品中DNA的定量可能任何合適的手段完成。例如，核酸的定量可基于分光光度計(jì)、熒光計(jì)或UV透射儀的使用。適用技術(shù)的實(shí)例描述于標(biāo)準(zhǔn)教材，如《分子克隆——實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)(第三版)》(Sambr00k和Russell，特別參考其附錄8)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用試劑盒(如可購(gòu)自Molecular ProbesJnvitrogen 的Picogreen dsDNA定量試劑盒)定量DNA。本發(fā)明方法可依賴于選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基的試劑。所述試劑的作用原理已有闡述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基而不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑包含亞硫酸氫鹽試劑或基本由其組成或由其組成(Frommer等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199289 1827-1831)。若干含有亞硫酸氫鹽的試劑為本領(lǐng)域公知，適于進(jìn)行脫氨基反應(yīng)的試劑盒是市售的(如來(lái)自Zymo Research的EZ DNA甲基化試劑盒)。一種特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法的試劑包含亞硫酸氫鈉或基本由其組成或由其組成。樣品中的DNA經(jīng)試劑處理后，就必須檢測(cè)由該試劑引起的核苷酸序列差異。這一檢測(cè)利用核酸擴(kuò)增技術(shù)完成。如前所述，與功能相關(guān)的甲基化最常與啟動(dòng)子區(qū)有關(guān)。特別地，所謂“CpG島”包括相對(duì)高的CpG殘基比率，并且常常存在于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附加。 對(duì)一些基因例如MAGE-3而言，CpG在啟動(dòng)子區(qū)的分布非常罕見。這種情況下，可以適當(dāng)?shù)卦u(píng)估基因內(nèi)含子和外顯子區(qū)域的甲基化情況。存在多種軟件程序可允許鑒定目的基因中 CpG島。據(jù)此，本發(fā)明方法可涉及用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增甲基化或未甲基化目的基因的至少一部分。如上所述，由于需要研究其甲基化狀態(tài)的目的殘基通常發(fā)現(xiàn)于目的基因中確定的 CpG島和/或啟動(dòng)子區(qū)域和/或內(nèi)含子區(qū)域和/或外顯子區(qū)域，所以引物對(duì)通常僅擴(kuò)增基因(在此區(qū)域中)的一部分，而非整體。只要擴(kuò)增產(chǎn)物為可檢測(cè)的目的基因存在性的可靠指示物，則基因的任何合適部分都可根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行擴(kuò)增。特別易于檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物為約50至250bp之間。更優(yōu)選地，使用至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行的甲基化或未甲基化目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)生約100-200bp或50-100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。這對(duì)組織樣品特別重要，尤其是通常只能獲得有限D(zhuǎn)NA質(zhì)量且只能期望較小擴(kuò)增子的石蠟包埋樣品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施分案中， 可檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物至少包含 SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任一核苷酸序列。優(yōu)選地產(chǎn)生(約)50bp、51bp、52bp、53bp、 54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、 69bp>70bp>71bp>72bp>73bp>74bp>75bp>76bp>77bp>78bp>79bp>80bp>81bp>82bp>83bp> 84bp>85bp>86bp>87bp>88bp>89bp>90bp>91bp>92bp>93bp>94bp>95bp>96bp>97bp>98bp> 99bp、lOObp、lOlbp、102bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、108bp、109bp、llObp、lllbp、 112bp、113bp、114bp、115bp、116bp、117bp、118bp、119bp、120bp、121bp、122bp、123bp、 124bp、125bp、126bp、127bp、128bp、129bp、130bp、131bp、132bp、133bp、134bp、135bp、 136bp、137bp、138bp、139bp、140bp、141bp、142bp、143bp、144bp、145bp、146bp、147bp、148bpU49bp或150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。引物對(duì)中至少一種引物(優(yōu)選地為兩種)引物被設(shè)計(jì)成僅與試劑處理后的甲基化或未甲基化DNA序列結(jié)合。因此，引物可通過(guò)僅與甲基化形式基因(試劑處理后保持未修飾狀態(tài))或僅與非甲基化形式基因(被試劑修飾)堿基配對(duì)來(lái)區(qū)分甲基化和未甲基化基因， 這取決于該方法的應(yīng)用。因此，引物必須覆蓋目的基因中至少一個(gè)甲基化位點(diǎn)。優(yōu)選地，引物與基因中包含至少1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)甲基化位點(diǎn)的區(qū)域結(jié)合。最優(yōu)選地，該引物被設(shè)計(jì)成與這樣的序列結(jié)合，所述序列的引物結(jié)合位點(diǎn)中CpG對(duì)的所有胞嘧啶殘基為甲基化或未甲基化，即“全甲基化”或“全未甲基化”序列。不過(guò)，如果僅有單個(gè)或少量甲基化位點(diǎn)具有功能相關(guān)性，則引物可設(shè)計(jì)為與這樣的靶標(biāo)序列相結(jié)合，其中僅這些殘基必須為甲基化(仍為胞嘧啶)或未甲基化(轉(zhuǎn)變成尿嘧啶)以便發(fā)生有效結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)完全避開其他(非功能相關(guān)性)潛在甲基化位點(diǎn)，或者可將引物設(shè)計(jì)成使其結(jié)合不依賴于這些較低相關(guān)性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)(例如通過(guò)在引物序列中適當(dāng)位點(diǎn)上包括G和A殘基的混合)。據(jù)此，預(yù)計(jì)只有在含DNA的原始樣品中存在目的基因的甲基化或未甲基化形式時(shí)才能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。作為補(bǔ)充或替代，可能合適的是，引物對(duì)中至少有一個(gè)引物僅與試劑處理后的未甲基化DNA序列結(jié)合，而另一引物僅與處理后的甲基化DNA序列結(jié)合——例如，基因包括甲基化的功能性重要位點(diǎn)和獨(dú)立的未甲基化功能性重要位點(diǎn)。優(yōu)選地，引物對(duì)中至少一種引物為含有莖環(huán)或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的引物，其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分。該引物可以是或不是區(qū)分甲基化和未甲基化 DNA的期望引物。引物的排列方式使得在未發(fā)生擴(kuò)增時(shí)受體部分使受到激發(fā)的供體部分所發(fā)射的熒光猝滅。因此，在引物指導(dǎo)的擴(kuò)增開始前或未發(fā)生時(shí)，莖環(huán)或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)保持完整。供體部分發(fā)射的熒光被受體部分有效地接收，導(dǎo)致熒光猝滅。在擴(kuò)增過(guò)程中，引物的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的構(gòu)型發(fā)生改變。特別地，一旦引物被摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中，尤其是雙鏈DNA中時(shí)(特別是在第二輪擴(kuò)增過(guò)程中)，莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞。這一結(jié)構(gòu)改變使得供體和受體部分充分分離以致受體部分不能再有效猝滅供體部分所發(fā)射的熒光。因此，供體部分產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。實(shí)時(shí)檢測(cè)這種信號(hào)以提供甲基化或未甲基化目的基因拷貝數(shù)的指標(biāo)。因此，本發(fā)明方法可利用寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增以分子能量轉(zhuǎn)移(MET)標(biāo)記可檢測(cè)地進(jìn)行標(biāo)記的核酸。所述引物含有MET對(duì)的供體和/或受體部分，在擴(kuò)增反應(yīng)中被摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中，使得擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)含有MET對(duì)的供體和受體部分。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物為雙鏈時(shí)，摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中的MET對(duì)可以在同一鏈上，或者當(dāng)擴(kuò)增為三重?cái)U(kuò)增(triamplification)時(shí)，可以在兩條相對(duì)的鏈上。在擴(kuò)增所用聚合酶具有5’_3’ 外切核酸酶活性的一些情況下，MET對(duì)中的一個(gè)部分可被這種外切核酸酶活性從至少一些擴(kuò)增產(chǎn)物群體上切除。此類外切核酸酶活性對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增方法沒有不利影響。如本文所述，本發(fā)明方法可適用于許多種核酸序列擴(kuò)增方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、三重?cái)U(kuò)增和其他擴(kuò)增系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MET為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中寡核苷酸以供體和受體部分進(jìn)行標(biāo)記，其中供體部分為熒光團(tuán)，受體部分可以是熒光團(tuán)，以使供體部分發(fā)射出的熒光能被受體部分吸收。受體部分可以是猝滅劑。這樣，擴(kuò)增引物為同時(shí)包含供體和受體部分的發(fā)夾引物，其構(gòu)型使得受體部分使供體的熒光猝滅。當(dāng)引物被摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中時(shí)，其構(gòu)型發(fā)生變化，猝滅現(xiàn)象被消除，可檢測(cè)到供體部分的熒光。本發(fā)明方法允許檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)需預(yù)先分離出未摻入的寡核苷酸。此外，通過(guò)將標(biāo)記寡核苷酸摻入產(chǎn)物中，它們還允許直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還涉及檢測(cè)參照基因的表達(dá)。參照基因?qū)τ诓煌瑯悠分g的比較而言非常重要。通過(guò)選擇認(rèn)為在被比較樣品中以穩(wěn)定且可靠方式表達(dá)的適合基因，對(duì)參照基因和目的基因一起進(jìn)行的檢測(cè)將樣品間的變異性考慮在內(nèi)，例如輸入原料量、酶活效力、樣品降解等。存在可靠的輸入DNA量時(shí)，參照基因應(yīng)當(dāng)理想地為在測(cè)試條件下在各樣品中恒定地表達(dá)。因此，目的基因所得結(jié)果可針對(duì)相應(yīng)參照基因的拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化。本發(fā)明的合適參照基因包括β -肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、 核糖體RNA基因如18S核糖體RNA和RNA聚合酶II基因(Radonic Α.等.，Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23 ；313 (4) :856-62)。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施分案中，參照基因?yàn)?β-肌動(dòng)蛋白。因此，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步以利用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增參照基因的至少一部分為特征，其中所述引物對(duì)中至少一種引物為含有上述特征的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物。只要可以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物作為參照基因存在情況的可靠指示，參照基因中任何合適的部分都可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行擴(kuò)增。特別易于檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物為約50-250bp之間。更優(yōu)選地，使用至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行甲基化或未甲基化參照基因進(jìn)行的擴(kuò)增產(chǎn)生約50-150bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。這對(duì)組織樣品特別重要，尤其是通常只能獲得有限D(zhuǎn)NA質(zhì)量的石蠟包埋樣品。在包括參照基因的本發(fā)明方法實(shí)施方案中，所述方法還可以該方法的步驟為特征，所述步驟包括利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化或未甲基化目的基因的(實(shí)時(shí))檢測(cè)結(jié)果，還包括利用參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化或未甲基化參照基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果，以產(chǎn)生每一情況下基因的拷貝數(shù)，并任選地還包括通過(guò)用甲基化或未甲基化目的基因拷貝數(shù)除以參照基因拷貝數(shù)而對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化。同樣，該方法的特征可以是當(dāng)循環(huán)數(shù)閾值小于或等于40時(shí)認(rèn)為擴(kuò)增是有效的。對(duì)參照基因至少一部分的擴(kuò)增通常利用至少一個(gè)引物對(duì)。優(yōu)選地，像目的基因一樣，所述引物對(duì)中至少一種引物為含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)帶有分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分。本文已就此類結(jié)構(gòu)在擴(kuò)增中的作用機(jī)制進(jìn)行了闡釋。本發(fā)明方法中所用“發(fā)夾”引物最優(yōu)選地如US 6，090, 552和EP0912597中所述，
這些公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。這些引物的商品名稱為Amplifluor 引物。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增一部分目的基因和/或參照基因的含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物以5'至3'順序包括以下鄰接序列(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用選自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)中供體部分和受體部分的第一部分進(jìn)行標(biāo)記，其中所述供體部分在激發(fā)后在一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，所述受體部分吸收和/或猝滅所述供體部分所發(fā)射的熒光；(b)單鏈的第二核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成；(C)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成，其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分進(jìn)行標(biāo)記，且所述第二部分是該組中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核苷酸序列與所述第一核苷酸序列為反向互補(bǔ)，以使所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可形成雙鏈體而使所述第一部分與第二部分接近，從而在該供體部分被激發(fā)且發(fā)射熒光時(shí)，該受體部分吸收并猝滅所述供體部分所發(fā)射的熒光；和(d)在所述引物的3'末端的單鏈的第四核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸， 或基本由其組成，或由其組成，所述第四核苷酸序列在其3'末端包含SEQ ID N0.2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、62 和 63 中任一核苷酸序列 (并因此能夠引發(fā)由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含該基因甲基化或未甲基化DNA的一部分的核酸鏈互補(bǔ))；其中在未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分與所述第二部分分開一定距離，阻止了所述第一和第二部分之間的分子能量轉(zhuǎn)移。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述供體部分和受體部分形成一個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對(duì)。分子能量轉(zhuǎn)移(MET)是能量在供體分子和受體分子之間以非輻射形式傳遞的過(guò)程。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是MET的一種形式。FRET因某些化合物的特性而產(chǎn)生；當(dāng)被特定波長(zhǎng)的光照射而激發(fā)時(shí)，它們會(huì)發(fā)射不同波長(zhǎng)的光(即，發(fā)熒光)。此類化合物被稱為熒光團(tuán)。FRET中，能量在供體分子(為熒光團(tuán))和受體分子之間以非輻射形式長(zhǎng)距離(10-100人)傳遞。供體吸收光子并將其能量非輻射地轉(zhuǎn)移給受體(Fiirster, 1949， Z. Naturforsch. A4 :321-327 ；Clegg, 1992，Methods Enzymo 1. 211 :353-388)。當(dāng)激發(fā)譜和發(fā)射譜有重疊的兩個(gè)熒光團(tuán)靠近時(shí)，一個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)將導(dǎo)致其發(fā)射特定波長(zhǎng)的光，而這一波長(zhǎng)的光被第二個(gè)熒光團(tuán)吸收并使其激發(fā)，繼而導(dǎo)致其發(fā)熒光。也就是說(shuō)，第一個(gè)(供體)熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)能量通過(guò)共振引發(fā)的偶極-偶極相互作用轉(zhuǎn)移到鄰近的第二個(gè)(受體)熒光團(tuán)。結(jié)果，供體分子的壽命縮短，其熒光被猝滅，而受體分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)并去極化。當(dāng)供體的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移至非熒光團(tuán)受體上時(shí)，供體的熒光被猝滅而沒有隨后的受體熒光發(fā)射。這種情況下，受體起著猝滅劑的作用。猝滅劑和受體均可用于本發(fā)明。能夠參與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的分子對(duì)被稱為FRET對(duì)。為使能量轉(zhuǎn)移發(fā)生，供體和受體分子通常必須非常接近(最多 70 至 100 A ) (Clegg, 1992，Methods Enzymo 1. 211 :353-388 ； Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246 :300-334)。能量轉(zhuǎn)移效率因供體與受體分子之間的距離而迅速降低。據(jù)F5rster (1949，Ζ. Naturforsch. A4 =321-327)所述，能量轉(zhuǎn)移效率與DX 10-6成正比，其中D為供體與受體之間的距離。實(shí)際上，這意味著FRET可在最大約 70 λ的距離時(shí)以最高效率發(fā)生。FRET中常用的分子在獨(dú)立章節(jié)中討論。熒光團(tuán)是供體還是受體取決于其激發(fā)和發(fā)射譜，以及與其配對(duì)的熒光團(tuán)。例如，F(xiàn)AM可被488nm波長(zhǎng)的光最高效地激發(fā)，發(fā)射出500-650nm波譜的光，525nm處有最強(qiáng)發(fā)射。FAM是與JOE、TAMRA和 ROX (均在514nm處達(dá)到其最大激發(fā))配對(duì)使用的合適的供體熒光團(tuán)。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述供體部分為熒光素或其衍生物，所述受體為 DABCYL0優(yōu)選地，所述熒光素衍生物包含6-羧基熒光素，或基本由其組成，或由其組成。MET標(biāo)記可附著至引物的任意適當(dāng)位點(diǎn)。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體和受體部分位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)中互補(bǔ)的核苷酸上，以使莖環(huán)結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩個(gè)部分在物理空間上彼此極為接近。然而，本發(fā)明引物可在任何這樣的位置以所述部分進(jìn)行標(biāo)記所述位置可有效地允許在未發(fā)生擴(kuò)增時(shí)在供體與受體之間發(fā)生MET/FRET，而在引物被摻入擴(kuò)增產(chǎn)物后使供體與受體分開。
所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列不依賴于靶標(biāo)基因(目的基因或參照基因)的核苷酸序列，因?yàn)椴慌c其結(jié)合。據(jù)此，可設(shè)計(jì)“通用”的莖環(huán)或發(fā)夾序列，隨后可與序列特異性引物組合以便于進(jìn)行目的序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)。主要的序列要求是，序列在擴(kuò)增未發(fā)生時(shí)形成穩(wěn)定的莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)(并因此保證有效猝滅)。這樣，引物中的序列特異性部分與模板鏈結(jié)合并指導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。引物因此成為第一輪擴(kuò)增中擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分。當(dāng)互補(bǔ)鏈合成后，擴(kuò)增通過(guò)莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生。這就使熒光團(tuán)與猝滅劑分子分開，從而隨著擴(kuò)增的進(jìn)行而導(dǎo)致熒光的產(chǎn)生。所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選地位于擴(kuò)增所用引物中序列特異性部分的5’末端。如上所述，這一檢測(cè)序列通常以FRET對(duì)進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選地，發(fā)現(xiàn)FRET對(duì)中一個(gè)部分為朝向、接近或位于序列的5’端，另一個(gè)部分朝向、接近或位于序列的3’端，以使莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)保持完整時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)之間發(fā)生有效的FRET。如實(shí)驗(yàn)部分中的詳述，必須仔細(xì)選擇引物以確保本發(fā)明方法的靈敏度和特異性。 據(jù)此，檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的特別優(yōu)選的引物包括包含以下核苷酸序列或基本由其組成或
由其組成的引物
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5'-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCUTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3'(SEQ ID NO. 61)
和/或，
5，-CCCTCCACCAACATCAAA-3，(SEQ ID NO. 62)
5，-TGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3' (SEQ ID NO. 63)
SEQ ID NO 4和8代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的CTAGlB未甲基化序列互補(bǔ)的正向引
物(有義引物)序列。SEQ ID NO 12、16和20代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的CTAG2未甲基化序列互補(bǔ)的正向引物(有義引物)序列。SEQ ID NO 24、沘、32、36和40代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的PRAME未甲基化序列互補(bǔ)的正向引物(有義引物)序列。SEQ ID NO 43代表發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列。SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25、29、33 和 37 分別包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及 SEQ ID NO. 4、8、12、16、20、24、28、32、36 和 40 的序列。SEQ ID NO. 2和6代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的CTAGlB啟動(dòng)子未甲基化序列互補(bǔ)的反向引物(反義引物)序列。SEQ ID NO. 10、14和18代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的CTAG2啟動(dòng)子未甲基化序列互補(bǔ)的反向引物(反義引物)序列。SEQ ID NO. 22、沈、30、；34和38代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的PRAME啟動(dòng)子未甲基化序列互補(bǔ)的反向引物(反義引物)序列。
SEQ ID NO. 3、7、11、15、19、23、27、31、35 和 39 包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及 SEQ ID NO. 2、6、10、14、18、22、26、30、34 和 38 的序列。SEQ ID NO 42和44代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的甲基化β -肌動(dòng)蛋白基因序列互補(bǔ)的正向和反向引物序列；SEQ ID NO. 41包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和SEQ ID 44的序列。SEQ ID NO 63代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的MageA3未甲基化序列互補(bǔ)的正向引物 (有義引物)序列。SEQ ID NO 61包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和SEQ ID 63的序列。SEQ ID NO. 62代表與經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的MageA3未甲基化序列互補(bǔ)的反向引物序列。如實(shí)驗(yàn)部分中所詳述，CTAG2的表達(dá)和甲基化水平在使用SEQ ID NO. 9至12和SEQ ID NO 21至20中任一引物的測(cè)定中顯示出最佳一致性。如實(shí)驗(yàn)部分中所詳述，PRAME的表達(dá)和甲基化水平在使用SEQ ID NO 21至40中任一引物的實(shí)驗(yàn)中顯示出最佳一致性。因此，另一實(shí)施方案中，與CTAG2的區(qū)域結(jié)合的優(yōu)選引物包含SEQ ID NO 9至12和 SEQ ID NO 21至20中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。與PRAME的區(qū)域結(jié)合的優(yōu)選引物包含SEQ ID NO 21至40中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。以不同低甲基化測(cè)定產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物具有如下序列CTAG1B_1 (129bp)GGAAGGTGGGGGAGAGTGGTTTGGATTTTAGTATTTTTTTTTTTTTTTAGGGTTAGGTTTTGTTTGGTT ATTTTTTGTTGTTATAGGTGTGTTTGGTATAGATATTTAGTTTTTGGGGTTGTGTTGTTTT(SEQ ID NO. 45)CTAGlB_2(130bp)GGGTTGGAGAGTTGTTTGTTTGAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTGATAGTTTTGGTGGTG AGGTGGGGGTTGGGAGATGGGGAGGGTAGGGTTAGGTGGGGGAGGAGGTGGGGGAGATG(SEQ ID NO. 46)CTAG2(150bp)TGGTGGTGTTGTTTTTGTGTAGGATGGAAGGTGTTTTTGTGGGGTTAGGAGGTTGGATAGTTGTTTGT TTTAGTTGTATTTTGTTTTGTTTTGTTTTAGGAGGTTTTGGTGGTGAGGTGGGGGTTGTGAGATGGAGATAATAGG GTTAAG(SEQ ID NO. 47)CTAG2_2 (80bp)GGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTAATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGA AGGTGTTGGGT(SEQ ID NO. 48)CTAG2_3(125bp)TTTTGTTTTGGGATGTTGTATTTTTTTTTTGATTAGGGGTGGTTTTGAAGGATTTTATTGTGTTTGGTA ATTTATTGTTTATGTTAGTTTGGGATTAGGATAGGGAAGGTGTTGGGTGGATGAGG(SEQ ID NO. 49)PRAME_1:129bpTGGGTTTGTAGTGTTTTAGTATTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGG TTTGTATTGGTGATMAAGGAGTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTTTG(SEQ ID NO. 50)PRAME_2 :106bpTTGTTTTGGGATATTTTATTTGTTTTTTAGGTGTGATTTGTTAATAGGTTTGTATTGGTGATAAAAGGA GTAGTTTTGAATGTAGGGAAAGTAGGGTGGAGTTTTT(SEQ ID NO. 51)PRAME_3 :120bp
GAGGGGAGGGGTGTGAATGTGTGGATTTTTGTGGAGAGTGGAAATATGGGGAGTTGAGGGGAGTATGTG TGGGTTTTAGAAAGTTTTGGGAAATTGATTTTTGGGAGTAGGGAGGAATG(SEQ ID NO. 52)PRAME_4 :59bpAGTGTTGGAGGTTTTGAGGTTAGTTTAAGTTGTTTTAAAATGGAATGAAGGTGTTTGTG(SEQ ID NO. 53)PRAME_6 :50bpTGGTGGATGTTTTGGGATTTGGTTTTTTTGAAGGTGTTGGGGGTTGGGGATGGTTTAGGTAGTGGTGTA GGTGTTTTAGGAAGGTGGGAGTAGAGGTAGAAATGTTG(SEQ ID NO. 54)PRAME_7 :98bpGTTTTGGAAGGATTGAGAAATGGGGATTGGTTAGATTAGGTTGTTTAGTTTTTTGGTTTTTATTGTTGT TTTTTTTGTTTTATGTAGTGGTTAGGGTG(SEQ ID NO. 55)這些序列位于相應(yīng)基因的CpG富集島中。因此，本發(fā)明還涉及寡核苷酸、引物和/ 或探針，其由SEQ ID NO :45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55所述經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的核苷酸序列部分組成或與其互補(bǔ)。由CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因的經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換序列部分組成或與其互補(bǔ)的引物部分優(yōu)選地小于30bp ；其長(zhǎng)度優(yōu)選地為27、26、25、24、23、22、21、20、19、18或 17bp。因此，此類優(yōu)選引物的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME特異性部分優(yōu)選地為28至16bp， 或27至17bp之間長(zhǎng)度。引物可因此包含27、26、25、24、23、22、21、20、19、18或17bp個(gè)由
經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的序列組成或與其互補(bǔ)的連續(xù)堿基。(引物對(duì)中)一種或兩種引物可用合適的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)標(biāo)記，或合成成引入合適的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)帶有供體和受體部分，如上詳述，優(yōu)選地在5’ 端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物之一或之兩優(yōu)選地在5’端用莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，或合成成引入莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)包含以下核苷酸序列或基本由其組成或由其組成5，-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCU-3，(SEQ ID NO 43)該檢測(cè)序列通常以FRET對(duì)進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選地，所述FRET對(duì)中一個(gè)部分為朝向、接近或位于序列的5’端，另一個(gè)部分朝向、接近或位于序列的3’端，以使莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)保持完整時(shí)，兩個(gè)部分之間發(fā)生有效的FRET。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(尤其是包含SEQ ID NO 1所示序列或基本由其組成或由其組成的核酸)在其5’端以 FAM標(biāo)記，其3’端以DABCYL標(biāo)記。本文論述了其他優(yōu)選的組合，這些討論酌情應(yīng)用。這些引物形成了本發(fā)明的不同方面。這些引物的其他特征概述于以下的詳細(xì)說(shuō)明 (實(shí)驗(yàn)部分)。需要注意的是寡核苷酸、引物和探針(序列)的變體可用于本發(fā)明中。特別地，可依據(jù)需要添加額外的側(cè)翼序列，例如以提高結(jié)合特異性或有助莖環(huán)形成。變體序列優(yōu)選地與SEQ ID NO :1至42和SEQ ID NO :44、60、61和62的引物和/或探針核苷酸序列之間具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%或至少99%的核苷酸序列同一性。適當(dāng)時(shí)，引物與發(fā)夾結(jié)構(gòu)中可引入合成的核苷類似物，或是基于例如DNA、RNA或PNA，或是其混合。同樣地，可酌情使用其他熒光供體和受體部分/FRET對(duì)。除了用熒光供體和受體部分標(biāo)記外，引物還可包括修飾的寡核苷酸和其他懸突基團(tuán)和標(biāo)簽，只要本發(fā)明方法中的引物和/或莖環(huán)/發(fā)夾結(jié)構(gòu)的功能不受影響即可。
對(duì)于每一個(gè)引物對(duì)，至少一個(gè)引物用分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)的供體和受體部分進(jìn)行標(biāo)記，其排列方式使得在未擴(kuò)增時(shí)受體部分猝滅供體部分(激發(fā)狀態(tài))發(fā)射的熒光，而擴(kuò)增過(guò)程中莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，使得供體與受體部分分開足夠距離以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)檢測(cè)這種熒光信號(hào)以提供基因拷貝數(shù)的指標(biāo)。優(yōu)選地，所述供體部分和所述受體部分為 FRET對(duì)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述供體部分和所述受體部分選自于5-羧基熒光素或6-羧基熒光素(FAM)、2' 7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、羅丹明、6-羧基羅丹明(R6G)、N，N，N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)，6-羧基-X-羅丹明(ROX)、 5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰氨基苯甲酰胺、香豆素、鋱螯合衍生物、孔雀綠、活性紅4 (Reactive Red 4)、DABCYL、四甲基羅丹明、芘丁酸、伊紅硝基酪氨酸、溴化乙錠和德克薩斯紅。在另一實(shí)施方案中，所述供體部分選自于熒光素、5-羧基熒光素或6-羧基熒光素(FAM)、羅丹明、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、鄰氨基苯甲酰胺、香豆素、鋱螯合衍生物、孔雀綠和活性紅4，所述受體部分選自于DABCYL、羅丹明、四甲基羅丹明、芘丁酸、伊紅硝基酪氨酸、溴化乙錠和德克薩斯紅。優(yōu)選地，所述供體部分為熒光素或其衍生物，所述受體基基團(tuán)為DABCYL，最優(yōu)選地，供體部分為6-羧基熒光素。本文討論了其他優(yōu)選組合，尤其是在多重檢測(cè)情況下，這些組合也在本發(fā)明這些方面的考慮中。本發(fā)明還提供了可用于進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒。所述試劑盒可引入任何與本文所述本發(fā)明多種方法(和使用)相關(guān)的優(yōu)選特征。因此，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)含DNA樣品中甲基化或未甲基化目的基因存在情況和/或量的試劑盒，其包含至少一個(gè)本發(fā)明的引物對(duì)。優(yōu)選地，所述試劑盒包含用于檢測(cè)甲基化或未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3基因的存在情況和/或量的本發(fā)明引物對(duì)，以及用于檢測(cè)參照基因(尤其是β-肌動(dòng)蛋白)的存在情況和/或量的引物對(duì)。因此，所述試劑盒可含有包含引物的引物對(duì)，所述引物包含 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、60、61 或 62 所示核苷酸序列或基本由其組成或由其組成。優(yōu)選地，每個(gè)引物對(duì)中至少一種引物以適當(dāng)莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，以利于實(shí)時(shí)檢測(cè)，如上所述(其討論加以必要修改后也適用于此處)。最優(yōu)選地，每個(gè)引物對(duì)的至少一種引物中引入了包含SEQ ID NO :43的核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)以適當(dāng)供體和受體部分進(jìn)行標(biāo)記，如上所述(其討論加以必要修改后也適用于此處)。如上所述，本發(fā)明引物的其他特征鑒定概述于以下的詳細(xì)說(shuō)明(實(shí)驗(yàn)部分)。本文所述這些序列的變體可用于本發(fā)明。如本文所述，可酌情使用其他熒光供體和受體部分 /FRET 對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒還包含修飾未甲基化胞嘧啶的試劑，如本文所述(與被保護(hù)的甲基化胞嘧啶殘基相比的偏好性)。此類試劑可用于區(qū)分胞嘧啶殘基的甲基化和未甲基化形式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包含亞硫酸氫鹽，優(yōu)選亞硫酸氫鈉。該試劑能夠?qū)⑽醇谆陌奏埢D(zhuǎn)換為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不變。這一殘基差異可用于在下游過(guò)程中區(qū)分甲基化和未甲基化核酸，例如用區(qū)分胞嘧啶和尿嘧啶的引物進(jìn)行的PCR(胞嘧啶與鳥嘌呤配對(duì)，而尿嘧啶與腺嘌呤配對(duì))。根據(jù)本文對(duì)本發(fā)明方法的討論，適當(dāng)?shù)膶?duì)照可用于該方法的質(zhì)量控制。據(jù)此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒還包含一個(gè)或多個(gè)甲基化狀態(tài)已知的對(duì)照核酸分子，或基本由其組成，或由其組成。這些(一個(gè)或多個(gè))對(duì)照核酸分子可包括已知為(或經(jīng)處理而成為)甲基化的核酸和/或已知為(或經(jīng)處理而成為)未甲基化的核酸。一個(gè)適當(dāng)內(nèi)參基因的例子為β -肌動(dòng)蛋白，其通常為未甲基化，但可處理成為甲基化。本發(fā)明試劑盒可額外地包括其他用于進(jìn)行本發(fā)明要求保護(hù)的方法的適當(dāng)緩沖劑和試劑。因此，對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行的討論酌情適用于此處，為簡(jiǎn)潔起見不再重復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒還包含核酸擴(kuò)增緩沖劑，或基本由其組成，或由其組成。試劑盒還可額外包含催化核酸擴(kuò)增的酶，或基本由其組成，或由其組成。因此，試劑盒還可額外包含用于核酸擴(kuò)增的合適的聚合酶，或基本由其組成，或由其組成。實(shí)例包括那些來(lái)自于家族A和家族B類型的聚合酶，例如Taq、Pfu, Vent等。試劑盒的多種組分可分別包裝在獨(dú)立隔間中，或者可以例如在適當(dāng)時(shí)貯存在一起。試劑盒還可包含適當(dāng)?shù)氖褂谜f(shuō)明，可單獨(dú)打印在紙片上或例如并入試劑盒的包裝中。說(shuō)明書可有助于本發(fā)明試劑盒與適當(dāng)?shù)膶?shí)時(shí)擴(kuò)增或終點(diǎn)檢測(cè)儀器一起使用，許多是市售的。本發(fā)明實(shí)時(shí)方法的最后一步涉及利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量甲基化或未甲基化目的基因和任選的參照基因(如果有)的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線可用一組標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生。每一標(biāo)準(zhǔn)品含有已知拷貝數(shù)或濃度的目的基因和/或參照基因(視情況而定)。通常，熒光基線值將被設(shè)定為背景熒光。例如，一個(gè)實(shí)施方案中利用了序列檢測(cè)系統(tǒng)Gequence Detection System, SDS)軟件。該軟件在開始檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物前設(shè)定了一個(gè)3_15個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)的默認(rèn)基線范圍。然后將熒光閾值定義為高于此基線的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值。通常，閾值設(shè)定為高于基線熒光的10倍標(biāo)準(zhǔn)差。設(shè)備提供適當(dāng)軟件以進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)。軟件自動(dòng)計(jì)算反應(yīng)的基線和閾值。然后確定各標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)閾值(Ct)。這是達(dá)到閾值擴(kuò)增水平所需的循環(huán)數(shù)。因此，反應(yīng)混合物中基因標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度越大，達(dá)到特定擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)越少。將Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品DNA的已知起始拷貝數(shù)的Iogltl值作圖可得到直線。這就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，目的基因和參照基因(如果使用)擴(kuò)增的Ct值可各自從相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推，以確定其在含DNA樣品中的拷貝數(shù)。因此，該方法的輸出為各目的基因和參照基因的拷貝數(shù)。 可通過(guò)用甲基化或未甲基化目的基因的拷貝數(shù)除以參照基因拷貝數(shù)以使結(jié)果歸一化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)用于實(shí)施本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，使用SDS軟件，優(yōu)選地包括適當(dāng)?shù)乃惴?，例如Auto CT算法，以自動(dòng)地生成各個(gè)檢測(cè)物的基線和閾值。本發(fā)明方法可以與任何適當(dāng)擴(kuò)增技術(shù)一起使用，但最優(yōu)選地，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。因此，盡管PCR是一個(gè)擴(kuò)增方法(包括基本技術(shù)的變體如巢式PCR)， 但等同的技術(shù)也可包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)例包括但不限于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如NASBA、3SR、 TMA和三重?cái)U(kuò)增，均為本領(lǐng)域所熟知，其適用試劑是市售的。其他適用的擴(kuò)增方法包括但不限于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR) (Barringer等，1990)、MLPA、靶標(biāo)多核苷酸序列選擇性擴(kuò)增 (美國(guó)專利No. 6，410，276)、共有序列引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(美國(guó)專利No 4，437，975)、入侵者技術(shù)(invader technology) (Third Wave Technologies， Madison, WI)、鏈置換技術(shù)、 隨機(jī)引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(W090/069%)和缺口置換擴(kuò)增(W02004/067726)。本發(fā)明的實(shí)時(shí)PCR方法通常包括以下步驟降溫以允許引物退火、升溫以使引物延伸、升溫以進(jìn)行變性和降溫以采集數(shù)據(jù)。一個(gè)具體實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)采集步驟在約56 V至 63°C之間的溫度下進(jìn)行，最優(yōu)選地在約57°C或62°C，因?yàn)檫@一溫度表現(xiàn)出可產(chǎn)生最高靈敏度和特異性的結(jié)果，如實(shí)施例部分所述。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熱曲線包括40-50個(gè)重復(fù)，優(yōu)選地為 45個(gè)如下循環(huán)(a)約 50°C，約 2 分鐘(b)約 95°C，約 10 分鐘(c)約 ％°C，約 I5 秒(d)約 57°C，約 1 分鐘本發(fā)明方法中顯示出產(chǎn)生特異性和靈敏性結(jié)果的優(yōu)選反應(yīng)設(shè)計(jì)為第1階段50°C 2 分鐘；第2階段95°C 10分鐘；第3階段95°C 15秒、57°C 30秒、57°C 30秒(=平臺(tái)-數(shù)據(jù)采集)共45個(gè)循環(huán)。本發(fā)明方法可用于在同一反應(yīng)中檢測(cè)多于一種目的基因。通過(guò)若干特異性引物組，數(shù)種核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增可在同一反應(yīng)混合物中進(jìn)行。這可被稱為“多重反應(yīng)”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于每種靶標(biāo)的引物之一或之二可以是用形成FRET對(duì)的熒光部分和猝滅部分標(biāo)記的發(fā)夾引物。數(shù)種核酸靶標(biāo)的擴(kuò)增需要將具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的不同熒光供體和 /或受體部分用于標(biāo)記每組引物。在擴(kuò)增后的檢測(cè)和分析過(guò)程中，反應(yīng)混合物受到光照，并在反應(yīng)所用每組引物的特征波長(zhǎng)下讀數(shù)。由此可確定混合物中何種特異的靶標(biāo)DNA被擴(kuò)增和標(biāo)記了。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用了分別擴(kuò)增不同靶標(biāo)序列兩個(gè)或多個(gè)引物對(duì)。因此可在單個(gè)含DNA樣品中檢測(cè)一系列甲基化/未甲基化目的基因的存在情況和/或數(shù)量。多重反應(yīng)還可用于在同一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)目的基因和參照基因。此外，用適當(dāng)?shù)目蓞^(qū)分供體和/或受體部分標(biāo)記的引物使得目的基因和參照基因分別擴(kuò)增產(chǎn)生的信號(hào)能夠區(qū)分開來(lái)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了通用的猝滅劑和各自具有可區(qū)分的最大發(fā)射波長(zhǎng)的適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)供體。一種特別優(yōu)選的猝滅劑為DABCYL。如下熒光團(tuán)可各自與猝滅劑DABCYL共同使用以允許多重反應(yīng)香豆素(最大發(fā)射波長(zhǎng)為475nm) ,EDANS (491nm)、熒光素(515nm)， 熒光黃(523nm), BODIPY(525nm)、伊紅(543nm)、四甲基羅達(dá)明(575nm)和德克薩斯紅 (615nm) (Tyagi 等.，Nature Biotechnology, Vol. 16, Jan 1998 ;49_53)。本文討論了其他優(yōu)選的組合。在另一實(shí)施方案中，含DNA樣品可拆分并對(duì)樣品的適當(dāng)部分實(shí)施本發(fā)明的方法， 以直接獲得可比較的結(jié)果。因此，檢測(cè)目的基因和參照基因兩者時(shí)，樣品可分為兩組以允許在一部分樣品中對(duì)目的基因擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，而在另一部分樣品中對(duì)參照基因的擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。樣品根據(jù)需要可進(jìn)一步拆分以允許進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶?duì)照反應(yīng)。這種設(shè)計(jì)的好處是可使用通用的FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記每個(gè)引物對(duì)，并免除了在一系列波長(zhǎng)下檢測(cè)發(fā)射光的必要。不過(guò)，此方法依賴于獲得最初允許拆分的樣品?？墒褂萌我膺m當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體積，但一個(gè)具體實(shí)施方案中，擴(kuò)增步驟所用總反應(yīng)體積約為10-40 μ 1，更優(yōu)選地為約10-30 μ 1，最優(yōu)選地為約 12μ 1。一方面，本發(fā)明的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法被用于診斷癌癥或癌癥素因，其中樣品中未甲基化(或低甲基化)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的存在指示癌癥或癌癥素因。因此，本發(fā)明提供了用于診斷癌癥或癌癥素因的試劑盒、方法和引物?！霸\斷”在本文中定義為包括篩查疾病或疾病前期(pre-stadia)、鑒定疾病或疾病前期、監(jiān)測(cè)疾病的分期和狀態(tài)以及進(jìn)展、檢查治療后疾病復(fù)發(fā)，以及監(jiān)測(cè)特定治療的成功。 該測(cè)試還可具有預(yù)后價(jià)值，這一點(diǎn)包括在“診斷”的定義。測(cè)試的預(yù)后價(jià)值可用作潛在癌癥易感性的標(biāo)志物或癌癥進(jìn)展的標(biāo)志物。因此，可在疾病有機(jī)會(huì)在患者中表現(xiàn)出可鑒定癥狀之前鑒別出有風(fēng)險(xiǎn)的患者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥選自肺癌、黑色素瘤或乳腺癌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于診斷的方法和測(cè)定利用至少一種包含SEQ ID NO. 1、2、 3、4、5、6、7或8中任意核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的寡核苷酸作為CTAGlB的標(biāo)記。用于診斷的方法和測(cè)定利用至少一種包含SEQ ID NO. SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19中任意核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的寡核苷酸作為CTAG2的標(biāo)記。用于診斷的方法和測(cè)定利用至少一種包含SEQ ID NO 20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40中任意核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的寡核苷酸作為PRAME的標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥或癌癥素因的診斷利用包含 SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 中任意核苷酸序列或基本由其組成或由其組成的寡核苷酸，并檢測(cè)基因的未甲基化形式。測(cè)試可以診斷方式進(jìn)行，或與治療方案共同進(jìn)行。確定CTAG1B、CTAG2和/或PRAME 表達(dá)在NSCLC、乳腺癌或黑色素瘤中的預(yù)測(cè)價(jià)值的RT-PCR測(cè)定可用于選擇適于用CTAG1B、 CTAG2,PRAME和/或MageA3免疫治療進(jìn)行治療的患者。本發(fā)明人已表明，為檢測(cè)未甲基化 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3設(shè)計(jì)的利用本發(fā)明寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)或試劑盒的測(cè)定能夠可靠地以CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表達(dá)將樣品分類。低甲基化測(cè)試所得甲基化狀態(tài)結(jié)果與用RNA樣品進(jìn)行的CTAG1B、CTAG2和/或PRAME的現(xiàn)有RT-PCR 測(cè)試所得結(jié)果具有良好一致性。當(dāng)樣品(例如從非小細(xì)胞肺癌取得的細(xì)針穿刺活檢樣品)難以用qRT-PCR進(jìn)行分析時(shí)，通過(guò)檢測(cè)MageA3的甲基化狀態(tài)確定的蛋白表達(dá)提供了有價(jià)值的替代方案。因此，甲基化測(cè)試具有臨床應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明中所有方法可應(yīng)用于細(xì)針活檢穿刺樣品。在一些具體實(shí)施方案中，測(cè)定了 MAGE-A3基因的甲基化狀態(tài)。如上所述，此類樣品不適用于以其他檢測(cè)(MAGE-AIB)表達(dá)的方法。這些樣品可能僅含有很少的細(xì)胞并因此含有極低的DNA水平。例如，此類樣品可能僅允許約70-150 μ g的DNA輸入用于每個(gè)測(cè)定。如實(shí)施例4所述， 本發(fā)明的方法對(duì)細(xì)針穿刺活檢樣品很有效。本發(fā)明的另一方面提供了預(yù)測(cè)成功治療受試者的癌癥的可能性的方法，包括(a)用選擇性修飾DNA中未甲基化胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基但不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑接觸/處理從受試者獲得的含DNA的測(cè)試樣品；(b)用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增未甲基化CTAG1B、CTAG2和/或PRAME基因的至少一部分，所述引物對(duì)中至少一種引物設(shè)計(jì)成僅與用試劑處理后的甲基化或未甲基化DNA序列結(jié)合，其中所述引物對(duì)中至少一種引物包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、44、60和61中任一核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。
(c)確定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)。其中樣品中未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的存在表明以CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法成功治療的可能性高于檢測(cè)到未甲基化CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3不存在或以低水平存在的情況。步驟(c)包括鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是否形成。鑒定到擴(kuò)增產(chǎn)物(利用本文所述任意適當(dāng)技術(shù))表明樣品中存在未甲基化或低甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3。當(dāng)然，相反的情況也適用，所以本發(fā)明的方法同樣可用于檢測(cè)是否可能對(duì)以 CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治療劑的治療有抗性或不成功——樣品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表明很可能對(duì)治療有抗性和/或治療很可能不成功。在一些實(shí)施方案中，甲基化DNA的特異性引物也可用于補(bǔ)充方法。本發(fā)明的方法還可用于為患者選擇適合的治療過(guò)程——未甲基化CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的存在表示可以有益地施用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治療劑，而未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3不存在或以低水平存在則表示免疫治療試劑為禁忌。對(duì)本發(fā)明寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法的討論加以必要修改后也適用于這一方面，因此所有實(shí)施方案適當(dāng)時(shí)均考慮用于本發(fā)明的這一方面。“成功治療的可能性”意為用任意一個(gè)或多個(gè)所列治療劑成功治療癌癥的可能性，所述治療劑優(yōu)選地為CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫治療劑或包含CTAG1B、 CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 的組合物。“抗性”定義為利用任一特定免疫治療劑成功治療癌癥的可能性降低和/或?yàn)檫_(dá)到
治療效果需要更高劑量。CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3的低甲基化可與特定癌癥類型相聯(lián)系。據(jù)此， 一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中乳腺癌、肺癌(包括NSCLC)或黑色素瘤的素因或發(fā)病的方法，所述方法包括利用本發(fā)明所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中樣品中檢測(cè)到未甲基化GTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3指示癌癥的素因或發(fā)病，尤其是黑色素瘤、包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的肺癌或乳腺癌。在另一實(shí)施方案中，腫瘤或癌癥選自前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、頭頸癌(包括食管癌)、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌，肝癌，多發(fā)性骨髓瘤和結(jié)腸直腸癌。另一方面，提供了一種確定CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3陽(yáng)性腫瘤存在的方法，包括利用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)樣品中 CTAGIB, CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中未甲基化CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3的存在表明存在CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3陽(yáng)性腫瘤。測(cè)試可以診斷方式進(jìn)行，或與治療方案共同進(jìn)行。測(cè)試還可用于確定對(duì)患者采用何種治療或預(yù)防方案以及用于監(jiān)測(cè)治療方案的有效性。因此，本發(fā)明還提供了用于鑒定和/或選擇適宜于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或 MageA3免疫療法的患者的方法，包括利用本文所述的寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因?yàn)槲醇谆?，則該受試者被鑒定和/或選擇為用CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法治療。
或者，如果基因不是未甲基化的，則該受試者優(yōu)選地不被鑒定和/或選擇為以 CTAG1B、CTAG2、PRAME 和 / 或 MageA3 免疫療法治療。在一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)成功治療癌癥的可能性的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果基因?yàn)槲醇谆瑒t以CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3免疫療法成功治療的可能性高于基因甲基化的情況。或者，樣品中不存在未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3表明對(duì)CTAG1B、 CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法治療有抗性的可能性高于基因未甲基化的情況。因此，檢測(cè)到甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因(或未檢測(cè)到低甲基化基因) 指示以免疫療法進(jìn)行成功治療的可能性很低。因此，患者群體可基于其CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)而被選擇用于治療。這就產(chǎn)生更有針對(duì)性和個(gè)性化形式的醫(yī)療，從而因?yàn)榛颊邔⒁宰钣锌赡苡行У乃幬镞M(jìn)行治療，而帶來(lái)更高的成功率。在另一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了選擇適用的癌癥治療方案的方法，包括利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、 PRAME和/或MageA3基因的甲基化狀態(tài)，其中如果基因?yàn)槲醇谆瑒t選擇免疫療法(尤其是CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3免疫療法)進(jìn)行治療?；蛘撸绻虿皇俏醇谆癄顟B(tài)，則禁用免疫療法。本發(fā)明還提供了治療受試者的癌癥的方法，包括施用免疫療法，其中所述受試者已根據(jù)本發(fā)明任一方法或利用本文所述寡核苷酸、引物或探針、引物對(duì)、試劑盒或方法，基于檢測(cè)CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因甲基化狀態(tài)而進(jìn)行了選擇。優(yōu)選地，對(duì)本文所述所有不同的方面，檢測(cè)到未甲基化CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3基因均對(duì)應(yīng)于CTAG1B、CTAG2、PRAME和/或MageA3蛋白水平的提高?？捎糜诒景l(fā)明的CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3和/或PRAME免疫療法包括基于CTAG1B、 CTAG2、MAGE-A3 禾口 / 或 PRAME 的組合物。包含 CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3 禾口 / 或 PRAME 的組合物的實(shí)例包括包含全長(zhǎng)CTAG1B、CTAG2、MAGE-A3和/或PRAME、基本全長(zhǎng)的CTAG1B、 CTAG2、MAGE-A3 和 / 或 PRAME 或是 CTAG1B、CTAG2、MAGE_A3 和 / 或 PRAME 片段的組合物，例如 CTAG1B、CTAG2、MAGE—A3 禾口 / 或 PRAME 的月太。可用于本發(fā)明的肽的實(shí)例包括如下MAGE-A3肽
SEQ ID NO肽序列SEQ ID NO64FLWGPRALVSEQ ID NO65EVDPIGHLYSEQ ID NO66MEVDPIGHLYSEQ ID NO 67VHFLLLKYRA
權(quán)利要求
1.寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQ ID NO. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、44、61、62或63中任何核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。
2.權(quán)利要求1的寡核苷酸、引物或探針，其包含SEQID NO. 9至12和SEQ ID NO. 21至 40中任何核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成，所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。
3.權(quán)利要求1的寡核苷酸、引物或探針，其按照5'至3'的順序包含以下鄰接序列，或基本由其組成，或由其組成(a)約6至30個(gè)核苷酸的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的核苷酸用第一部分進(jìn)行標(biāo)記，所述第一部分選自分子能量轉(zhuǎn)移對(duì)中的供體部分和受體部分，其中所述供體部分在受到激發(fā)時(shí)在一個(gè)或多個(gè)特定波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，所述受體部分吸收和/或猝滅由所述供體部分所發(fā)射的熒光；(b)單鏈的第二核苷酸序列，其包含約3至20個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成；(c)第三核苷酸序列，其包含約6至30個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成，其中所述第三核苷酸序列中的核苷酸用選自所述供體部分和所述受體部分的第二部分進(jìn)行標(biāo)記， 且所述第二部分是所述組中未用于標(biāo)記所述第一核苷酸序列的成員，其中所述第三核苷酸序列與所述第一核苷酸序列反向互補(bǔ)，以使得所述第一核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間可形成雙鏈體而使所述第一部分與第二部分接近，從而當(dāng)該供體部分受到激發(fā)并發(fā)射熒光時(shí)，該受體部分吸收并猝滅由所述供體部分發(fā)射的所述熒光；和(d)在該引物的3'末端的單鏈的第四核苷酸序列，其包含約8至40個(gè)核苷酸，或基本由其組成，或由其組成，其在3'末端包含SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、沘、30、32、34、36、38、40、42、44、61和63中任何核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成(并能夠引發(fā)由核酸聚合酶合成核苷酸序列，所述核苷酸序列與包含CTAG1B、CTAG2、 MageA3和/或PRAME基因的未甲基化DNA的一部分的核酸鏈互補(bǔ))；其中在未形成所述雙鏈體時(shí)，所述第一部分和所述第二部分分開至阻止了所述第一和第二部分之間發(fā)生分子能量轉(zhuǎn)移的距離。
4.引物對(duì)，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的引物。
5.權(quán)利要求4的引物對(duì)，其包含權(quán)利要求3的引物。
6.引物對(duì)，其包含以下核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成SEQID N0.9和SEQ ID NO. 10 ； SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 12 ； SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22 ； SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 ； SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 ；SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 ； SEQ ID N0. 29 和 SEQ ID N0. 30 ； SEQ ID N0. 31 和 SEQ ID N0. 32 ； SEQ ID N0. 33 和 SEQ ID N0. 34 ； SEQ ID N0. 35 和 SEQ ID N0. 36 ； SEQ ID N0. 37 和 SEQ ID N0. 38 ； SEQ ID N0. 39 和 SEQ ID N0. 40，或 SEQ ID N0. 61 和 62。
7.用于檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的寡核苷酸、引物或探針或者權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)。
8.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的寡核苷酸、引物或探針或者權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)或者權(quán)利要求7所定義的試劑盒，其中所述基因?yàn)镃TAG1B、CTAG2、 MageA3 禾口 / 或 PRAME 基因。
9.檢測(cè)含有DNA的樣品中未甲基化CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的存在情況和/或量的方法，包括(a)用試劑接觸/處理所述含有DNA的樣品，所述試劑選擇性修飾DNA中未甲基化的胞嘧啶殘基以產(chǎn)生可檢測(cè)的修飾殘基，但不修飾甲基化的胞嘧啶殘基；(b)用至少一個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增未甲基化目的基因的至少一部分，所述引物對(duì)中至少一種引物被設(shè)計(jì)成僅與經(jīng)該試劑處理后的未甲基化DNA的序列結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述引物對(duì)中至少一種引物包含SEQID NO. 1至40 或SEQ ID NO. 61至63中任何核苷酸序列，或基本由其組成，或由其組成。
11.診斷癌癥或癌癥素因的方法，包括通過(guò)利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)樣品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME 基因中至少一種的甲基化狀態(tài)，其中所述樣品存在未甲基化CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或 PRAME是癌癥或癌癥素因的指示。
12.用于鑒定和/或選擇適于用CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME免疫療法治療的患者的方法，包括利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的甲基化狀態(tài)，其中如果CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因是未甲基化的，則該受試者鑒定和/或選擇為用CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME免疫療法進(jìn)行治療。
13.用于預(yù)測(cè)成功治療癌癥的可能性的方法，包括利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8 的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)患者樣品中CTAGlB、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是未甲基化的，則以CTAGIB、CTAG2、MageA3 和/或PRAME免疫療法成功治療的可能性高于所述基因發(fā)生甲基化的情況。
14.選擇適用的癌癥治療方案的方法，包括利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)患者樣品中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME基因的甲基化狀態(tài)，其中如果所述基因是未甲基化的，則選擇免疫療法進(jìn)行治療。
15.治療受試者的癌癥的方法，包括施用包含或編碼CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME的組合物，其中所述受試者已基于利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法對(duì)CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定而被選擇進(jìn)行治療。
16.治療患者的方法，包括利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因的甲基化狀態(tài)， 然后向該患者施用包含或編碼CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的組合物。
17.治療容易復(fù)發(fā)表達(dá)CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的腫瘤的患者，所述患者已經(jīng)治療而除去腫瘤組織，所述方法包括利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法測(cè)定所述腫瘤組織中CTAG1B、CTAG2、MageA3和/ 或PRAME基因的甲基化狀態(tài)，然后向該患者施用包含或編碼CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或 PRAME的組合物。
18.包含或編碼CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME的組合物在制備用于治療腫瘤患者的藥物中的用途，其中所述患者已基于利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法對(duì)CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定而被選擇進(jìn)行治療。
19.包含或編碼CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的組合物在制備藥物中的用途， 所述藥物用于治療容易復(fù)發(fā)表達(dá)CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME的腫瘤的患者，其中所述患者已基于利用權(quán)利要求1至3或8中任一項(xiàng)所定義寡核苷酸、引物或探針、權(quán)利要求 4至6或8中任一項(xiàng)所定義的引物對(duì)、權(quán)利要求7或8的試劑盒或者權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的方法對(duì)CTAGlB、CTAG2、MageA3和/或PRAME基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定而被選擇進(jìn)行治療。
20.權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述組合物包含CTAG1B、CTAG2、 MageA3和/或PRAME，包含全長(zhǎng)CTAG1B、CTAG2、MageA3和/或PRAME，基本上為全長(zhǎng)的 CTAGlB、CTAG2、MageA3 和 / 或 PRAME，或者 CTAG1B、CTAG2、MageA3 和 / 或 PRAME 片段，例如 CTAG1B、CTAG2、MageA3 禾口 / 或 PRAME 的肽。
21.權(quán)利要求20的方法或用途，其中所述CTAGlB為全長(zhǎng)CTAGlB中包括HLA-A2結(jié)合基序的片段，其選自肽157-167、157-165和155-163。
22.權(quán)利要求20的方法或用途，其中所述CTAGlB為全長(zhǎng)CTAGlB中包括一個(gè)或多個(gè)1 類或2類MHC表位的片段，所述表位選自W02008/089074中所述A31、DRl、DR2、DR4、DR7、 DP4、B35、B51、Cw3、Cw6 禾口 A2。
23.權(quán)利要求15至22的方法或用途，其中所述CTAG1B、CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽與融合伴侶蛋白相連接。
24.權(quán)利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白為蛋白D，其為一種革蘭氏陰性菌乙型流感嗜血桿菌的表面蛋白或其衍生物。
25.權(quán)利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白為L(zhǎng)ytA或其衍生物，所述衍生物包含可見于LytA分子C端始于178位殘基的重復(fù)部分或基本由其組成或由其組成，或包含188-305位殘基。
26.權(quán)利要求23的方法或用途，其中所述融合伴侶蛋白為NSl(血細(xì)胞凝集素)，或其包含NSl的N端81個(gè)氨基酸的衍生物。
27.權(quán)利要求15至沈中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述組合物包含編碼CTAG1B、 CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽或其融合蛋白的核酸分子。
28.權(quán)利要求27的方法或用途，其中所述核酸分子在表達(dá)載體中提供。
29.權(quán)利要求15至28中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述含有CTAG1B、CTAG2和/或PRAME蛋白、片段或肽的組合物或者含有核酸的組合物還包含佐劑、免疫刺激性細(xì)胞因子和趨化因子中的一種或多種。
30.權(quán)利要求四的方法或用途，其中所述佐劑包含單磷酰脂質(zhì)A或其衍生物、皂苷或其衍生物和TLR9拮抗劑中的一種或多種。
31.權(quán)利要求30的方法或用途，其中所述TLR9拮抗劑是含有CpG的寡核苷酸。
32.權(quán)利要求四至31中任一項(xiàng)的方法，其中所述佐劑制備在水包油乳劑或油包水乳劑中，任選地包含膽固醇和/或生育酚，或者制備在脂質(zhì)體組合物中。
33.權(quán)利要求9至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述基因?yàn)镸ageA3基因，所述樣品或腫瘤組織通過(guò)細(xì)針穿刺活檢獲得。
全文摘要
包含SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、61、62或63中任一核苷酸序列的寡核苷酸、引物或探針。所述寡核苷酸、引物或探針可用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)。所述寡核苷酸可用于癌癥的診斷和治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102575284SQ201080021497
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者凱瑟琳·博維耶, 加埃唐·歐托 申請(qǐng)人:MDx健康公司, 葛蘭素史克生物公司