專利名稱：用于生產(chǎn)乙醇的重組細菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組細菌及其應用，特別是用于乙醇生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及這種細菌的生產(chǎn)方法以及適用于這種生產(chǎn)的核酸構(gòu)建物。具體來說，本發(fā)明涉及缺少功能性LHD基因和/或含有編碼PDC和ADH的重組核酸的細菌。本發(fā)明的細菌可以從任何抗脅迫細菌生產(chǎn)， 特別是從奇異球菌屬(Deinococcus)的任何菌株，包括嗜極菌株例如但不限于耐放射奇異球菌(D. radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌(D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌(D. deserti)生產(chǎn)。發(fā)明簡介在文獻中已經(jīng)報道了具有在被脅迫破壞時重新裝配其基因組的能力的細菌，例如奇異球菌屬(Deinococcus)細菌。奇異球菌是在1956年由Anderson及其合作者分離到的革蘭氏陽性細菌。這種嗜極生物對由UV和電離輻射或由交聯(lián)劑(絲裂霉素C)所引起的 DNA損傷具有抗性，并對干旱具有耐受性。W001/0235^5顯示了奇異球菌對輻射的罕見抗性，并進一步提出了對它們進行工程改造并用于生物修復。在本申請的優(yōu)先權(quán)日前未公開的專利申請n° W02009/063079，顯示了奇異球菌屬細菌能夠抵抗溶劑并轉(zhuǎn)化生物質(zhì)以產(chǎn)生乙醇。在目前尚未公開的專利申請n° EP09 305041. 7中披露了其他抗脅迫細菌，以及它們的分離和/或篩選方法及其生產(chǎn)代謝物例如抗生素的能力。在W095/27064和W02006/131734中提到了遺傳改變的革蘭氏陽性或地芽孢桿菌屬(Geobacillus)菌株。從工業(yè)前景來看，對于這些菌株還沒有公開令人滿意的代謝物生產(chǎn)。此外，地芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生芽孢，這對于工業(yè)應用來說是明顯的缺點?，F(xiàn)在，本發(fā)明顯示了可以對抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌的基因組進行修飾，以提高它們生產(chǎn)乙醇的能力。更具體來說，本發(fā)明顯示了可以修飾抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌內(nèi)的代謝途徑，以便改進它們在乙醇生產(chǎn)中的性能。發(fā)明概述本發(fā)明的目的涉及重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌具有含有失活的L-乳酸脫氫酶(LDH)基因的修飾的基因組。在具體實施方案中，LDH基因被全部或部分缺失，并且不編碼有功能的乳酸脫氫酶。本發(fā)明的重組細菌優(yōu)選還包含編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)和/或醇脫氫酶(ADH)的重組核酸分子。就此而言，本發(fā)明的另一個目的是重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌含有重組核酸、優(yōu)選為質(zhì)粒，其含有編碼丙酮酸脫羧酶和/或醇脫氫酶的核酸。本發(fā)明的細菌可以選自各種抗脅迫細菌物種，例如奇異球菌屬細菌、硫單胞菌屬 (Tepidimonas)細菌、特呂珀菌屬(Tru印era)細菌、產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrabacter)細菌、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)細菌或微小桿菌屬(Exiguobacterium)細菌。 本發(fā)明的優(yōu)選細菌是奇異球菌屬細菌，例如但不限于耐放射奇異球菌(D. radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌 (D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌(D. deserti)，優(yōu)選為嗜熱奇異球菌屬細菌。本發(fā)明的另一個目的在于生產(chǎn)生物燃料、特別是乙醇的方法，所述方法包含將如上定義的細菌在適合底物存在下進行培養(yǎng)，并收集生物燃料。本發(fā)明還涉及使用如上定義的細菌生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)如上定義的重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌或其原種(ancestor)的方法，所述方法包含-提供(親代)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌；-對細菌進行處理以失活LDH基因，并且-選擇具有失活的LDH基因的細菌。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)如上定義的重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌或其原種的方法，所述方法包含-提供(親代)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌；-將編碼PDC和/或ADH的重組核酸分子導入到所述細菌中，并且-選擇表達所述核酸的細菌。本發(fā)明還涉及質(zhì)粒構(gòu)建物，其中所述質(zhì)粒在奇異球菌屬細菌中復制，并含有編碼 PDC和/或ADH的核酸。


fil 用于LDH部分缺失的整合構(gòu)建物pDR-LDHdel的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。合成具有同源區(qū)和氯霉素表達盒的插入片段并將其克隆到LITMUS28i中。CamK，氯霉素抗性；AmpK，氨芐青霉素抗性；⑶R_term85，推測的耐放射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)轉(zhuǎn)錄終止子； P D.rad.，推測的耐放射奇異球菌啟動子；5，HR, 5'同源區(qū)；3，HR, 3'同源區(qū)；E. coli ORI， 大腸埃希式桿菌(Escherichia coli)復制原點。Ml :5，同源區(qū)(SEQ ID NO 1)和 3，同源區(qū)(SEQ ID NO 2)的序列。M3 通過同源重組構(gòu)建耐放射奇異球菌L-乳酸脫氫酶(基因座DR_2364)突變體的過程。CamK，氯霉素抗性；AmpK，氨芐青霉素抗性；5，HR, 5'同源區(qū)；3，HR, 3'同源區(qū)； E. coli ORI，大腸埃希式桿菌復制原點。圖 4 ZmPDC(SEQ ID NO 3)禾口 ZmADH II (SEQ ID NO 4)基因的核酸序列。圖 5 質(zhì)粒 pI3-DR-P-PDC_ADH(a)、pI3-DR-P-PDCtag_ADHtag(b)、 ρ 13-DR-P-PDC-P-ADH (c)和 pI3-DR-P-PDCtag-P_ADHtag (d)的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)。RBS groESL 操縱子，位于耐放射奇異球菌groESL操縱子上游的核糖體結(jié)合位點區(qū)(Meima等，2001)； AmpE,氨芐青霉素抗性；CamK，氯霉素抗性；E. coli ORI，大腸埃希式桿菌復制原點；PtufA， 位于tufA基因的預測的翻譯起始密碼子上游的432bp ；PtufB，位于tufB基因的預測的翻譯起始密碼子上游的234bp ;ZmPDC，運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脫羧酶基因；ZmADH，運動發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶II基因Jerm85，位于基因座DR_1184與DR_1185 之間含有推測的轉(zhuǎn)錄終止子的基因間序列；Termll6，轉(zhuǎn)錄終止子I~ermll6 (Lecointe等， 2004) ；D.rad. ORI，耐放射奇異球菌復制原點；P D.rad.，耐放射奇異球菌啟動子。M_6 用 ρ 13-DR-P-PDC-P-ADH (a)或 pI3-DR-P-PDCtag-P_ADHtag (b)轉(zhuǎn)化的耐放射奇異球菌的醇脫氫酶活性。Ml 代謝途徑的重新工程化改造。M8 用于產(chǎn)生PDC+ADH+LDH-突變體的PCR產(chǎn)物的三方連接。CamK，氯霉素抗性；位于TufA基因的預測的翻譯起始密碼子上游的432bp ；PtufB，位于TufB基因的預測的翻譯起始密碼子上游的234bp ;ZmPDC，運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脫羧酶基因；ZmADH，運動發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶II基因Jerm85，位于基因座DR_1184與DR_1185之間含有推測的轉(zhuǎn)錄終止子的基因間序列；Termll6，轉(zhuǎn)錄終止子1Terml 16 (Lecointe等，2004)； P D.rad.，耐放射奇異球菌推測的啟動子；5，HR, 5'同源區(qū)；3，HR, 3'同源區(qū)。用于代謝分析的重組體的名稱。表2-5 奇異球菌重組體在復合或限定成分培養(yǎng)基中的代謝物生產(chǎn)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及重組抗脅迫細菌及其用于生產(chǎn)生物燃料或其他代謝物的應用。在本發(fā)明的文本中，術(shù)語“抗脅迫細菌”更具體來說是指當受到脅迫破壞時具有完全或部分重新裝配其基因組的能力的細菌。脅迫可以是任何細胞破壞性DNA損傷性處理， 即，足以在大腸埃希式桿菌細菌培養(yǎng)物中引起90%以上細胞死亡的處理。更優(yōu)選情況下，細胞破壞性DNA損傷性處理是足以使大腸埃希式桿菌培養(yǎng)物中細菌滴度的對數(shù)減少至少2的處理。這樣的處理的實例包括輻射，優(yōu)選為重復和連續(xù)的UV輻射，和/或使用基因毒物。優(yōu)選的脅迫處理是0. 5至400mJ/cm2之間、更優(yōu)選為1至200mJ/cm2之間、典型為1至IOOmJ/ cm2之間的UV輻射，其施加約5”至5’的時間長度。優(yōu)選的UV處理是4mJ/cm2處理30秒， 其可以以1至8小時之間、優(yōu)選3至5小時、更優(yōu)選約4小時的時間間隔重復。本發(fā)明的具體細胞脅迫處理已描述在未公開的專利申請n° EP09 305041.7中，其在此引為參考。更具體來說，本發(fā)明的抗細胞脅迫細菌包括奇異球菌屬(Deinococcus)細菌、硫單胞菌屬(I^pidimonas)細菌、特呂珀菌屬(Tru印era)細菌、產(chǎn)卟啉桿菌屬 (Porphyrabacter)細菌、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)細菌或微小桿菌屬 (Exiguobacterium)細菌。本發(fā)明的優(yōu)選細菌是奇異球菌屬細菌、特別是嗜極奇異球菌屬細菌，更優(yōu)選為選自耐放射奇異球菌(D. radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、 墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌(D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌 (D. deserti)的奇異球菌屬細菌，優(yōu)選為嗜熱奇異球菌屬細菌。已經(jīng)顯示，奇異球菌屬細菌具有當受到脅迫破壞時完全或部分重新裝配其基因組的能力。正如前面提到的，已經(jīng)提出將這些細菌、特別是耐放射奇異球菌用于生物修復。在本申請的優(yōu)先權(quán)日前未公開的W02009/063079中，披露了奇異球菌屬細菌從生物質(zhì)生產(chǎn)生物能產(chǎn)品的能力?，F(xiàn)在，本發(fā)明顯示了通過使用重組技術(shù)重新工程化代謝途徑，可以改進抗脅迫細菌例如奇異球菌屬細菌的性能。更具體來說，本發(fā)明提供了具有重新工程化改造的乙醇生物合成途徑的新的重組抗脅迫細菌。就此而言，本發(fā)明人在抗脅迫細菌菌株中設(shè)計并產(chǎn)生了新的生物合成途徑，所述途徑是基于丙酮酸轉(zhuǎn)化途徑的重新規(guī)劃。更具體來說，本發(fā)明人設(shè)計了新的重組菌株，其中丙酮酸被有效地用作生產(chǎn)乙醇的底物。就此而言，本發(fā)明人插入了引起或催化丙酮酸向乙醇轉(zhuǎn)變的一個或幾個酶(或相應的基因)。本發(fā)明人還缺失了使用丙酮酸生產(chǎn)乳酸的內(nèi)源途徑，從而增加了參與乙醇合成途徑的丙酮酸的量。
因此，本發(fā)明的一個目的涉及(重組或遺傳修飾的)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌含有編碼PDC的重組核酸。術(shù)語“重組細菌”是指作為缺失和/或異源(例如非所述細菌中天然存在的)核酸序列或分子的插入的結(jié)果而含有修飾的基因組的細菌。因此，“重組核酸”是指已經(jīng)被工程化改造并且不能在野生型細菌中以原樣被發(fā)現(xiàn)的核酸。本發(fā)明的另一個目的涉及(重組或遺傳修飾的)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌含有編碼ADH的重組核酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及(重組或遺傳修飾的)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌含有編碼PDC和ADH的重組核酸。本發(fā)明的另一個目的涉及(重組或遺傳修飾的)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌具有包含失活的乳酸脫氫酶(LDH)基因的修飾的基因組。本發(fā)明的最優(yōu)選的目的是(重組或遺傳修飾的)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌具有包含失活的乳酸脫氫酶(LDH)基因的修飾的基因組，此外，所述細菌還含有編碼PDC和/或ADH的重組核酸。丙酮酸脫羧酶(PDC，EC 4. 1. 1. 1)催化丙酮酸單氧化脫羧成乙醛和二氧化碳。醇脫氫酶(ADH，EC 1. 1. 1. 1)催化乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)變。為了產(chǎn)生或改進該代謝途徑，克隆了編碼PDC和/或ADH的核酸分子，并將其成功導入到抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬菌株中。術(shù)語核酸優(yōu)選是指DNA，盡管重組核酸可以是RNA。根據(jù)具體情況，核酸分子可以是雙鏈或單鏈的。更具體來說，制備了編碼功能性PDC的核酸分子。這樣的核酸分子可以包含天然或合成或突變的PDC基因的所有或一部分序列，只要核酸分子編碼的蛋白催化丙酮酸單氧化脫羧成乙醛和二氧化碳即可。PDC存在于植物、真菌和酵母中，但是在細菌中少見。在已完全測序的耐放射奇異球菌基因組中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的PDC。已經(jīng)在多種菌株中鑒定到PDC基因，例如在運動發(fā)酵單胞菌(Brau和Sahm, 1986 ；Conway等，1987a ；Neale等，1987)、巴氏醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus) (Genbank :AF368435) (Chandra 等，2001)、胃乂V 疊球菌(Sarcina ventriculi) (Genbank :AF354297) (Lowe 和 Zeikus，1992)和棕櫚發(fā)酵細菌 (Zymobacterpalmae) (Genbank :AF474145) (Raj 等，2002)中。在優(yōu)選實施方案中，PDC核酸包含細菌PDC基因的全部或部分序列。在具體實施方案中，核酸包含來自運動發(fā)酵單胞菌的PDC基因的序列(ZmPDC，ZM01360)。ZmPDC基因序列包含1707個堿基對，并顯示在圖4中。此外，為了在抗脅迫細菌例如奇異球菌中產(chǎn)生ADH活性，制備了編碼功能性ADH的核酸分子。這樣的分子可以包含天然或合成或突變的ADH基因的所有或一部分序列，只要核酸分子編碼的蛋白催化乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)變即可。已經(jīng)從不同生物體克隆到ADH基因，所述生物體包括但不限于運動發(fā)酵單胞菌 angram等，1987)、短乳桿菌(LactcAacillus brevis) (Liu等，2007)或嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus) (Genbank :Z25544) (Talarico 等，2005)。在耐放射奇異球菌基因組中也發(fā)現(xiàn)了推斷的ADH基因(DR_2279)。然而，僅靠它的表達似乎不足以有
效生產(chǎn)乙醇。
在優(yōu)選實施方案中，ADH核酸包含細菌ADH基因的全部或部分序列。在具體實施方案中，核酸包含來自于運動發(fā)酵單胞菌的ADH基因的序列(ZmADH，ZM01596)。ZmADH II 包含1152個堿基對，其序列顯示在圖4中。這些核酸還可以含有調(diào)控序列或調(diào)控區(qū)，例如啟動子(例如tufB啟動子)和終止子等。啟動子對于宿主來說可以是內(nèi)源的(例如來自奇異球菌基因的啟動子，用于將本發(fā)明的重組核酸克隆在奇異球菌屬菌株中)或異源的(例如來自不同來源例如不同的細菌、噬菌體、合成或雜合啟動子等)。優(yōu)選的啟動子是內(nèi)源的。就此而言，已經(jīng)研究了奇異球菌的啟動子并將其用于基因表達。這樣的啟動子的實例包括來自翻譯延伸因子Tu基因 tufA(DR0309)和tufB(DR2050)的PtufA和PtufB、編碼位于pI3中的假設(shè)解離酶的resU 基因的啟動子和groESL操縱子的啟動子區(qū)PgroESL(Lecointe等，2004 ；Meima等，2001)。核酸可以作為獨立的實體克隆(例如不同的核酸構(gòu)建物)，或克隆在同一構(gòu)建物中不同的啟動子區(qū)下或在操縱子中。本申請中提供的實例公開了新的構(gòu)建物的產(chǎn)生，其中來自運動發(fā)酵單胞菌的 ZmPDC基因和醇脫氫酶II基因(ZmADH)被克隆到同一構(gòu)建物中，在獨立的啟動子之下或在操縱子中。這些構(gòu)建物被成功導入奇異球菌屬菌株中，其引起從所述重組菌株產(chǎn)生乙醇，而未修飾的(親代)菌株在測試條件下不產(chǎn)生任何乙醇?？梢詫⒑怂岵迦氲郊毦幕蚪M中，或作為(自主)復制分子插入，例如在質(zhì)粒、 游離體、人工染色體等上。在典型的實施方案中，將重組核酸克隆到可以在奇異球菌中復制的適合載體中。 除了被克隆的插入片段之外，典型的質(zhì)粒還包含選擇基因(例如抗生素抗性、染料等)和在奇異球菌中有效的復制原點或允許整合到奇異球菌的基因組中。質(zhì)粒(或重組核酸)還可以包含調(diào)控序列，例如啟動子、終止子和/或增強子。這樣的載體的實例包括pMD66、pI3、pRADl和pUE30。pMD66是用于耐放射奇異球菌和大腸埃希式桿菌的含有121Λ的pI3片段的大載體(271Λ) (Daly等，1994)。pI3由Masters 和Minton描述(199 。pRADl是耐放射奇異球菌-大腸埃希式桿菌穿梭質(zhì)粒，其含有用于耐放射奇異球菌的最小復制子(Meima和Lidstrom，2000)。pUE30是源自于抗放射奇異球菌(D. radiopugnans)菌株的內(nèi)源質(zhì)粒，其能夠在奇異球菌中復制(參見US2003/0175977)。本發(fā)明的具體目的在于質(zhì)粒構(gòu)建物，其中所述質(zhì)粒在抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌中復制，并含有編碼PDC和/或ADH的核酸。PDC和ADH編碼核酸可以位于操縱子中，或者可以作為同一質(zhì)?；虿煌|(zhì)粒中的不同表達單位。本發(fā)明的優(yōu)選質(zhì)粒編碼來自發(fā)酵單胞菌的PDC和/或ADH。本發(fā)明的質(zhì)粒的具體實例是pI3-DR-P-PDC-ADH、 ρ13-DR-P-PDCtag-ADHtag,pI3-P-PDC-P_ADH 和 ρ13-DR-P-PDCtag-P-ADHtag 也可以將重組核酸克隆到適用于整合到奇異球菌屬細菌基因組中的整合表達盒中。這樣的整合表達盒典型地包含連接有(或兩側(cè)帶有)一個或幾個允許整合、特別是位點特異性整合的序列的重組核酸。這樣的序列可以是例如與基因組靶區(qū)域同源、允許通過交換進行整合的核酸序列。就此而言，本發(fā)明的具體細菌包含編碼PDC和/或ADH的重組核酸，其整合到其基因組中以代替編碼LDH的內(nèi)源基因的全部或一部分。在本文中，術(shù)語“LDH 基因的一部分”是指基因的任何部分，其缺失足以引起該基因在該細胞中的失活?？梢允褂酶鞣N技術(shù)將重組核酸分子插入到抗脅迫細菌、特別是奇異球菌中。具體來說，它們可以通過自然轉(zhuǎn)化(其在氯化鈣存在下能夠被進一步增強)或電穿孔來插入。就此而言，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)如上定義的重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌或其原種的方法，所述方法包含-提供(親代)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌；-將編碼PDC和/或ADH的重組核酸分子導入到所述細菌中，并且-選擇表達所述核酸的細菌?？梢园凑毡旧硪阎募夹g(shù)例如抗生素抗性，來選擇插入有核酸的重組體。適合的PDC或ADH的表達可以使用定量PCR來驗證，這些酶的產(chǎn)生可以通過 Western印跡或通過本技術(shù)領(lǐng)域中本身已知的酶測定法來驗證。由于這些酶的活性，PDC活性可以通過分析NAD+的減少來測量，ADH活性可以通過分析NAD+的減少或NADH的氧化來測量(Conway 等，1987a 和 b)。正如在實驗部分中所公開的，產(chǎn)生了含有編碼PDC和ADH的重組核酸的奇異球菌屬細菌。這些細菌可以培養(yǎng)，是存活的，并穩(wěn)定地包含重組核酸。優(yōu)選情況下，重組體的穩(wěn)定性使得超過95%的轉(zhuǎn)化細菌在2個生長周期后仍將包含載體。結(jié)果顯示，PDC和ADH基因組插入片段即使在2個生長周期后仍是穩(wěn)定的。這些細菌產(chǎn)生乙醇，并且在底物特異性、培養(yǎng)條件和代謝物生產(chǎn)方面組合了許多優(yōu)點。此外，為了進一步提高乙醇生產(chǎn)，還產(chǎn)生了使其中的乳酸脫氫酶基因失活的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌。LDH(乳酸脫氫酶)基因參與丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸。1996年，Narumi和Watanabe克隆到耐放射奇異球菌的LDH基因。這種酶是四聚體，并且其晶體結(jié)構(gòu)已被解出(Coquelle 等，2007)?，F(xiàn)在，本發(fā)明人產(chǎn)生了其中所述酶被失活的新細菌。在具體實施方案中，LDH基因被全部或部分缺失，并且不編碼功能性蛋白?？梢酝ㄟ^同源重組、基因置換或定向誘變或本技術(shù)領(lǐng)域中本身已知的任何其他技術(shù)，將所述細菌或其原種中的LDH基因失活。在優(yōu)選實施方案中，通過缺失所述基因的至少一部分使LDH基因失活，所述至少一部分可以用異源核酸(例如選擇標志物)取代。LDH基因含有915個堿基對。它位于奇異球菌基因組中的坐標2362890與2363804 之間。所述基因的序列可以在例如gen&eq1799712下獲得。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細菌缺少所述基因的一部分，優(yōu)選為其至少100個連續(xù)核苷酸、更優(yōu)選至少200、300、400或 500個連續(xù)核苷酸。在實施例中產(chǎn)生了缺陷型奇異球菌屬菌株，其缺少LDH基因的589個連續(xù)核苷酸。該菌株使用特定構(gòu)建物通過雙交換來制備，所述特定構(gòu)建物包含標志物基因，其兩側(cè)帶有與LDH基因部分和(任選地)與LDH基因兩側(cè)的區(qū)域部分同源的兩個區(qū)域(參見圖3)。同源區(qū)的典型長度應該足以允許雜交和交換，例如超過200個核苷酸、優(yōu)選超過300 個核苷酸、典型在300至700個核苷酸之間。這樣的構(gòu)建物代表了本發(fā)明的具體目的(參見圖1和2)。就此而言，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)如上定義的重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌或其原種的方法，所述方法包含-提供(親代)抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌；
-對細菌進行處理以失活LDH基因，并且-選擇具有失活的LDH基因的細菌。本發(fā)明的細菌可以培養(yǎng)和/或維持在任何適合的培養(yǎng)基和裝置中。這樣的培養(yǎng)基的實例包括復合葡萄糖培養(yǎng)基或在實施例中公開的限定成分培養(yǎng)基，例如蔗糖限定成分培養(yǎng)基、淀粉限定成分培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基也可以商購獲得。本發(fā)明的另一個目的涉及使用如上定義的細菌來生產(chǎn)乙醇或其他代謝物的應用。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)生物燃料、特別是乙醇的方法，所述方法包含將如上定義的細菌在適合底物存在下培養(yǎng)，以及收集生物燃料。底物可以是任何培養(yǎng)基或各種類型的生物質(zhì)或從其衍生的產(chǎn)品。具體來說，生物燃料可以從可再生資源特別是植物或動物生物質(zhì)或從市政和工業(yè)廢物來生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語生物燃料包含“第一代生物燃料”和/或“第二代生物燃料”。第一代生物燃料從植物或動物有機材料、優(yōu)選從糖、淀粉、植物油或動物脂肪獲得。生產(chǎn)第一代生物燃料的主要來源是可食用植物或其部分。第一代生物燃料包括植物油、生物柴油、生物醇類、沼氣、合成氣和固體生物燃料。生物醇類包括乙醇、丙醇和丁醇。第二代生物燃料優(yōu)選從不可食用植物或植物的不可食用部分生產(chǎn)。它們包括非糧食作物、生物質(zhì)廢物，小麥秸稈、玉米和木材。更優(yōu)選情況下，本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的方法可以在轉(zhuǎn)化反應器中執(zhí)行?！胺磻鳌笔侵赋Ｒ?guī)發(fā)酵罐或為執(zhí)行本發(fā)明特別設(shè)計的用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的任何裝置或系統(tǒng)，因此具體來說包括生物反應器、生物過濾器、生物轉(zhuǎn)盤和其他氣相和/或液相生物反應器，特別是適用于處理生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物的反應器?？捎糜诒景l(fā)明的裝置可以連續(xù)或以分批裝料方式使用。在反應器中，為了執(zhí)行本發(fā)明的方法，使用了至少一種本發(fā)明的細菌或其細菌提取物，同時對所述反應器進行布置和供料，以便在其中建立起物理化學條件，使得所述細菌對于所考慮的應用來說可以起作用，并任選允許并優(yōu)選促進細菌在其中生長。取決于底物和細菌，方法可以在好氧、厭氧或微好氧條件下進行。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的細菌抵抗脅迫條件、包括培養(yǎng)基中存在的乙醇的能力。因此，本發(fā)明的方法可以優(yōu)選在約40°C或更高溫度、特別是40-70°C之間的溫度下，在酸性pH條件下和/或在乙醇存在下執(zhí)行。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將在下面的實施例中公開，所述實施例應該被當作說明性的，并且不限制本申請的范圍。
實施例材料和方法細菌菌株和生長條件使用大腸埃希式桿菌(E. coli)菌株SCS110、JM109或DH5 α來擴增質(zhì)粒。將它們在37°C和200RPM下培養(yǎng)在Luria-Bertani(LB)營養(yǎng)肉湯中(每升含胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉IOg)。通過加入1. 5%瓊脂制備固體培養(yǎng)基。將耐放射奇異球菌Rl (D. radiodurans)在30°C和200RPM下培養(yǎng)在TGY或PGY中。 TGY培養(yǎng)基的組成如下，每升含胰蛋白胨(5g)，酵母膏(1.5g)和葡萄糖(lg)。固體培養(yǎng)基的組分是每升含胰蛋白胨(5g)，酵母膏(2. 5g)，葡萄糖(Ig)和瓊脂(15g)。PGY培養(yǎng)基的組成如下，每升含蛋白胨(IOg)，酵母膏(5g)和葡萄糖(Ig)。固體培養(yǎng)基的組分是每升含蛋白胨(IOg)，酵母膏(5g)，葡萄糖(Ig)和瓊脂(15g)。如果需要，LB或TGY培養(yǎng)基增補有適合的抗生素(對于耐放射奇異球菌轉(zhuǎn)化體來說終濃度為3μ g/ml的氯霉素，對于大腸埃希氏桿菌轉(zhuǎn)化體來說終濃度為ΙΟΟμ g/ml的氨芐青霉素)。轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌轉(zhuǎn)化使用可商購感受態(tài)細胞，即來自Mratagene的SCSllO或來自 Promega 的 JM109 進行。對于耐放射奇異球菌感受態(tài)細胞的制備來說，將靜止期新鮮培養(yǎng)物在50ml TGY中稀釋100倍。使細胞生長至對數(shù)早期(OD6tltlnm = 0. 3)；將細胞離心沉淀物重新懸浮在適當體積的冰冷2xTGY/10% ν/ν甘油/30mM CaCl2中。對于轉(zhuǎn)化來說，向100 μ 1細胞加入所需量的質(zhì)粒DNA。將混合物在冰上溫育30分鐘，然后將試管轉(zhuǎn)移到30°C。在30°C溫育90分鐘后，向細胞加入900 μ 1預加溫的hTGY。將轉(zhuǎn)化體在200RPM和30°C下振搖20小時。對它們進行連續(xù)稀釋，并鋪在適合的非選擇性或選擇性TGY平板上。DNA 操作LITMUS28i 來自于 New England Biolabs0大腸埃希氏桿菌細胞的質(zhì)粒小量制備使用來自Promega的試劑盒Wizard Plus SV minipreps DNA純化系統(tǒng)進行，中量制備使用來自Macherey-Nagel的質(zhì)粒DNA純化 NucleoBond Xtra Midi Plus EF試劑盒進行。這些制備從3_100ml靜止期大腸埃希氏桿菌培養(yǎng)物進行。對于耐放射奇異球菌的質(zhì)粒制備來說，將50ml靜止期細胞重懸浮在0. 5M EDTA和 0. 5M EDTA飽和的丁醇中。在室溫溫育15分鐘后，將細胞離心沉淀物重懸浮在0.5M EDTA 中，并將細胞在70°C下放置30分鐘。將細胞離心沉淀物在溶菌酶緩沖液(IOmM Tris HCl, 5mMEDTA,0. 5M NaCl)中清洗兩次，然后加入5mg/ml溶菌酶(在溶菌酶緩沖液中)。將樣品在37°C下溫育30分鐘，然后加入RNAse和蛋白酶K。將混合物在56°C溫育1小時。然后向樣品加入200mM NaOH，將其顛倒幾次進行混合；向樣品加入3M乙酸鉀，將其顛倒混合；將混合物在冰上溫育10分鐘，然后向上清液加入乙醇；將該混合物在冰上溫育10分鐘，并用 70%乙醇清洗離心沉淀物。將干燥的DNA沉淀物重懸浮在水中。耐放射奇異球菌的基因組DNA提取使用來自Qiagen的商業(yè)化DNeasy⑧血液和組織試劑盒進行。這些制備從5ml靜止期培養(yǎng)物進行。寡核苷酸由Eurogentec合成。用于PCR擴增的聚合酶是來自Finnzymes的 DyNAzyme EXT DNA 聚合酶或來自 Thermo Scientific 的 Extensor Hi-Fidelity PCR 酶。 PCR片段使用來自Promega的Wizard SV凝膠和PCR Clean-Up系統(tǒng)試劑盒精制。使用T4 DNA 連接酶(New England Biolabs)進行 DNA 連接。將質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物用來自New England Biolabs的限制性酶消化。遺傳物質(zhì)(PCR或消化產(chǎn)物)通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。DNA使用來自 Eppendorf 的 Biophotometer 定量。DNA插入片段由Genecust Europe合成，并克隆到適合的載體中。
醇脫氫酶活件測試向200ml含有50mg亞硫酸氫鈉的LB瓊脂加入細1濃度為2. 5mg/ml的堿性副品紅(Sigma)無水乙醇溶液(Conway等，1987b)。將在TGY瓊脂平板(如果需要，增補有適合的抗生素)上生長兩天的耐放射奇異球菌細胞鋪在指示平板上，并在37°C溫育2至3小時。代謝物牛產(chǎn)該方法能夠評估遺傳修飾的微生物從生物質(zhì)或生物質(zhì)衍生物生產(chǎn)目標代謝物的能力。測試在30°C進行。從在葡萄糖復合培養(yǎng)基中制備的預培養(yǎng)物(處于靜止期)接種6ml富集培養(yǎng)基 (接種率為ν/ν)。所測試的富集培養(yǎng)基是葡萄糖復合培養(yǎng)基、蔗糖限定成分培養(yǎng)基、淀粉限定成分
培養(yǎng)基。葡萄糖復合培養(yǎng)基含在滲透水(osmosed)中的2g/L蛋白胨，酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L 通過壓熱滅菌法(120°C 15分鐘)對溶液進行滅菌。向該溶液加入下列溶液 MOPS 緩沖溶液(IOX) pH7 [MOPS 酸 400mM，NH4Cl 200mM, NaOH 100mM,K0H IOOmMjCaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl2 5· ^mM]；微量營養(yǎng)物(10000Χ) [ (NH4)6(Mo7) 24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4O. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；2mM FeCl3(IOOX)在 C6H5N￡i30720mM 中;K2HP04 lg/L 通過過濾(0. 2 μ m)對溶液除菌。限定成分培養(yǎng)基含在滲透水中10g/L碳源通過壓熱滅菌法(120°C 15分鐘)對溶液進行滅菌。向該溶液加入下列溶液:MOPS緩沖溶液(10X) pH7 [酸性MOPS 400mM, NH4Cl 200mM, NaOH IOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl2 5. 28mM]；微量營養(yǎng)物 (10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) 24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 2mM 在 C6H5Na3O7 20mM 中；K2HPO4 lg/L 通過過濾(0· 2 μ m)對溶液除菌。除了野生型菌株之外，在接種前向這些培養(yǎng)基添加氯霉素3yg/mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)在好氧和厭氧兩種條件下進行(Biomerieux，Genbag)。將好氧條件下的培養(yǎng)物置于培養(yǎng)箱中，在30°C和攪拌下培養(yǎng)7天。然后將培養(yǎng)物以4000rpm離心10分鐘。將上清液過濾(0. 2 μ m)，倒入其他試管中，并置于_80°C下。將厭氧條件下的培養(yǎng)物置于培養(yǎng)箱中，在30°C下培養(yǎng)4周。然后將培養(yǎng)物以 4000rpm離心10分鐘。將上清液過濾(0. 2 μ m)，倒入其他試管中，并置于_80°C下。使用氣相色譜FID分析(Varian CP-ffAX 57CB 25m*0. 32mm柱)來定量醇類。有機酸通過毛細管電泳來定量(5mM 2，6_吡啶二羧酸，0. 5mM十六烷基三甲基溴化銨；調(diào)整至 PH 5. 6的緩沖液/61cm長、50μπι直徑的毛細管，Agilent)。殘余葡萄糖通過與折光檢測器相連的 HPLC 來定量(Phenomenex LUNA 3ym NH2 100A 150*4. 6mm 柱，乙腈/H2085 15 流動相)。實施例1、耐放射奇異球菌RlL-乳酸脫氫酶(LDH)的缺失如下所述產(chǎn)生了野生型耐放射奇異球菌Rl (D. radiodurans)的LDH-突變體。a. LDH 缺失的構(gòu)建物(pDR-LDHdel)我們產(chǎn)生了名為pDR-LDHdel的新的構(gòu)建物，用于在野生型耐放射奇異球菌中部
11分缺失LDH基因(DR_2364)(參見圖1)。為此，我們使用可以在大腸埃希式桿菌中但是不能在耐放射奇異球菌中復制的LITMUS28i骨架。將合成的DNA插入片段克隆到LITMUS28i 中；該插入片段由氯霉素抗性(CamK)表達盒(1344個核苷酸)以及分別置于該表達盒的上游和下游的5’與3’側(cè)翼同源區(qū)(537個核苷酸和615個核苷酸)組成(圖2)。構(gòu)造了 pDR-LDHdel構(gòu)建物，以用CamK表達盒代替LDH基因的589個核苷酸(589個核苷酸中的某些編碼參與催化的殘基)。b. LDH缺陷性突變體的產(chǎn)生按照材料和方法中所述的程序用pDR-LDHdel轉(zhuǎn)化野生型耐放射奇異球菌，以便產(chǎn)生敲除突變體。在增補有氯霉素的TGY培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。使用在氯霉素表達盒上退火的合適引物，通過PCR來監(jiān)控氯霉素抗性表達盒對LDH基因的一部分的取代(圖幻。選擇名為03-04/8-1和03-04/11-2的兩個雙交換整合克隆，用于代謝物分析(表1)。在同源重組后，得到的細菌含有589個核苷酸的缺失，其被CamK表達盒代替。對于 03-04/8-1和03-04/11-2的其中一部分LDH基因被CamK表達盒代替的基因組區(qū)域，進行了部分測序。實施例2、耐放射奇異球菌中丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的生產(chǎn)生產(chǎn)來自運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶(ZmPDC)和醇脫氫酶(ZmADH)的耐放射奇異球菌如下所述產(chǎn)生。a.攜帶用于乙醇生產(chǎn)的基因的構(gòu)建物的產(chǎn)生為了在耐放射奇異球菌細胞中生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)生了 4個構(gòu)建物(參見圖2)。對于第一個名為pI3-DR-P-PDC-ADH的構(gòu)建物來說，將來自于運動發(fā)酵單胞菌運動亞種(Zymomonas mobilis subsp. Mobilis) ZM4 的丙酮酸脫羧酶基因(ZmPDC，ZM01360) 和醇脫氫酶II基因(ZmADH，ZM01596)(圖4)置于操縱子中，并克隆到可以在耐放射奇異球菌中復制的pI3質(zhì)粒(Masters和Minton, 1992)的BamHI和SalI中(參見圖5)。pI3載體在耐放射奇異球菌中提供氯霉素抗性。將位于延伸因子TU tufA(DR_0309)的翻譯起始密碼子上游并含有啟動子活性的432個堿基對的區(qū)域(Lecointe等，2004)，置于ZmPDC-ADH 操縱子之前。在ZmPDC與ZmADH基因之間存在間隔區(qū)，其具有置于ZmADH的翻譯起始密碼子之前的來自于耐放射奇異球菌操縱子groESL的核糖體結(jié)合序列(RBS) (Meima等，2001)。 將耐放射奇異球菌轉(zhuǎn)錄終止子iTerml 16 (Lecointe等，2004)置于ZmADH基因下游。產(chǎn)生了源自于pI3-DR-P-PDC-ADH的第二個構(gòu)建物，其被命名為pI3-DR-P_PDCtag-ADHtag。在該構(gòu)建物中，將his-標簽(6個組氨酸)置于ZmPDC的C-端中，并將c-myc標簽(EQKLISEEDL) 置于ZmADH的C-端中(圖5)。對于構(gòu)建物ρ 13-DR-P-PDC-P-ADH來說，將含有名為Term85的推測的轉(zhuǎn)錄終止子的區(qū)域置于ZmPDC基因下游，并將位于延伸因子TUtufB (DR_2050)的翻譯起始密碼子上游的234個核苷酸(其對應于tufB啟動子區(qū)，Lecointe等，2004)置于I~erm85 與ZmADH基因之間(圖5)。最后一個構(gòu)建物源自于pI3-P-PDC-P_ADH，其被命名為 ρ 13-DR-P-PDCtag-P-ADHtag ；在該載體中，將his標簽(6個組氨酸)置于ZmPDC的C-端中，并將c-myc標簽(EQKLISEEDL)置于ZmADH的C-端中(圖5)。b.生產(chǎn)ZmPDC和ZmADH的耐放射奇異球菌菌株的產(chǎn)生將耐放射奇異球菌感受態(tài)細胞用帶有ZmPDC和ZmADH基因的不同構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。篩選轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。使用特異性引物通過PCR擴增或通過從耐放射奇異球菌克隆提取的構(gòu)建物的酶消化，來監(jiān)控質(zhì)粒的存在。對于4種構(gòu)建物中的每一種，使用了兩個克隆進行代謝研究。(表1)。實施例3、生產(chǎn)ZmPDC和ZmADH的整合耐放射奇異球菌LDH-突變體的產(chǎn)生用其后跟有分別在PtufA和PtufB啟動子控制下的ZmPDC和ZmADH基因的氯霉素抗性表達盒，替換野生型耐放射奇異球菌的LDH基因(DR_2364)的589個核苷酸。為了產(chǎn)生該PDC+ADH+LDH-突變體，通過PCR擴增了下列3個核苷酸序列-使用pDR-LDHdel作為模板，使用弓丨物EG3IF和EG32R (參見下表)擴增了其后跟有氯霉素抗性表達盒的5’側(cè)翼同源區(qū)-使用pI3-P-PDC-P-ADH作為模板，使用引物EG33F和EG34R(參見下表)擴增了 P-PDC-P-ADH 序列-使用pDR-LDHdel作為模板，使用引物EG35F和EG36R(參見下表)擴增了3，側(cè)翼同源區(qū)引物列表
EG31FSEQ ID NO :55 '-TTCCCCGCCTGGGTATCACGTC-3 ‘EG32RSEQ ID NO :65，-CTCGGATCCTTCACAGTTCTCCGCCCCCTCC-3 ‘EG33FSEQ ID NO :75 '-GAGGGATCCGTCGGGTGTCGAGCATCGTGATC-3 ‘EG34RSEQ IDNO 85，-CCTCCTGCAGTTGTTTTTGCAATAAACAAAAACAAAA AAACCCCC-3'EG35FSEQ ID NO :95 '-GAGACTGCAGTGGAACGAGCAGGTGCGCGCC-3 ‘EG36RSEQ ID NO :105'-ACGCGT GAGC AAAGGGCGGCG-3'使用這三個擴增子的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化耐放射奇異球菌，以獲得突變體 PDC+ADH+LDH-(圖8)。篩選轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。使用適合引物，通過PCR監(jiān)控LDH基因的部分缺失、氯霉素抗性基因和ZmPDC與ZmADH基因的基因組插入。選擇被命名為18-06/1-1 和18-06/1-3的兩個雙交換整合克隆用于代謝物分析(表1和4)。實施例4、耐放射奇異球菌Rl重組體醇脫氫酶活性我們使用Conway和合作者(1987b)的比色測試，測定了用具有ZmPDC和ZmADH基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的不同重組體中的醛產(chǎn)生和ADH活性。該測試是基于由ADH從乙醇產(chǎn)生的乙醛與無色染料相互作用后形成的紫色希夫堿的形成。如圖6中所示，本發(fā)明的重組體在增補有乙醇、堿性副品紅和亞硫酸氫鈉的LB瓊脂平板上在37°C溫育2至3小時后，變?yōu)樽仙?這種顯色顯示出用質(zhì)粒ρ 13-DR-P-PDC-P-ADH或ρ 13-DR-P-PDCtag-P-ADHtag轉(zhuǎn)化的重組體的每個克隆中的ADH活性。在這些重組體中，ZmADH基因轉(zhuǎn)錄由tufB啟動子控制。實施例5、耐放射奇異球菌Rl重組體代謝物生產(chǎn)分析了由本發(fā)明的重組體生產(chǎn)的代謝物。我們能夠檢測由本發(fā)明的重組體(例如克隆M-03/4-2、03-04/4-1、03-04/4-2) 與野生型重組體或用模擬載體骨架pI3轉(zhuǎn)化的對照重組體所產(chǎn)生的代謝物的變化(參見表2-5)。具體來說，在不同培養(yǎng)條件下檢測到乙醇的生產(chǎn)，而親代菌株不產(chǎn)生乙醇。
表1:重組體的名稱
權(quán)利要求
1.一種重組抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬(Deinococcus)細菌，其中所述細菌含有編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)和/或醇脫氫酶(ADH)的重組核酸。
2.權(quán)利要求1的細菌，其中所述重組核酸編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)和醇脫氫酶(ADH)。
3.權(quán)利要求1或2的細菌，其中所述重組核酸分子整合在細菌基因組中，或包含在質(zhì)粒中。
4.權(quán)利要求1至3任一項的細菌，其中PDC和ADH核酸置于同一構(gòu)建物中的操縱子中。
5.權(quán)利要求1至4任一項的細菌，其中PDC和ADH核酸來自于發(fā)酵單胞菌屬 (Zymomonas)。
6.權(quán)利要求1至5任一項的細菌，其中所述細菌具有包含失活的乳酸脫氫酶(LDH)基因的修飾的基因組。
7.權(quán)利要求6的細菌，其中LDH基因全部或部分缺失，并且不編碼功能性蛋白。
8.權(quán)利要求6或7的細菌，其中在所述細菌或其原種中，已通過同源重組、基因置換或定向誘變將LDH基因失活。
9.前述權(quán)利要求任一項的細菌，其中所述細菌的基因組缺少LDH基因的至少589個連續(xù)的核苷酸。
10.前述權(quán)利要求任一項的細菌，其是奇異球菌屬細菌，優(yōu)選自耐放射奇異球菌 (D. radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、墨氏奇異球菌(D. murrayi)、解纖維奇異球菌(D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌(D. deserti)，更優(yōu)選為嗜熱奇異球菌屬細菌。
11.一種生產(chǎn)生物燃料、特別是乙醇的方法，其包含將權(quán)利要求1-10任一項的細菌在合適的底物存在下培養(yǎng)，并收集生物燃料。
12.權(quán)利要求11的方法，其中培養(yǎng)在約40°C或更高溫度下、在酸性pH條件下和/或乙醇存在下進行。
13.權(quán)利要求1-10任一項的細菌在生產(chǎn)乙醇中的應用，優(yōu)選在約40°C或更高溫度下， 或在酸性PH培養(yǎng)條件下生產(chǎn)乙醇中的應用。
14.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1至10任一項的重組細菌或其原種的方法，所述方法包含-提供抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌；-在所述選定的細菌中導入編碼PDC和/或ADH的重組核酸分子；-任選地對細菌進行進一步處理以失活LDH基因，并選取具有失活的LDH基因的細菌。
15.一種質(zhì)粒構(gòu)建物，其中所述質(zhì)粒在抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬 (Deinococcus)細菌中復制，并含有編碼PDC和/或ADH的核酸，所述核酸優(yōu)選來自發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，最優(yōu)選選自 pI3-DR-P-PDC_ADH、pI3-P-PDC-P_ADH 和 ρI3-DR-P-PDCtag-P-ADHtag。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組細菌及其應用，特別是用于乙醇生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及這種細菌的生產(chǎn)方法以及適用于這種生產(chǎn)的核酸構(gòu)建物。具體來說，本發(fā)明涉及缺少功能性LDH基因和/或含有編碼PDC和ADH的重組核酸的細菌。本發(fā)明的細菌可以從任何抗脅迫細菌生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/04GK102421890SQ201080020915
公開日2012年4月18日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者亞奎斯·比頓, 伊瑟爾·格貝爾 申請人:德諾芙公司