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與rna對應(yīng)的雙鏈dna的合成方法以及擴(kuò)增方法

文檔序號:392157閱讀:887來源:國知局
專利名稱:與rna對應(yīng)的雙鏈dna的合成方法以及擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種與特定RNA對應(yīng)的雙鏈DNA的合成方法以及對該DNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)
目前,進(jìn)行RNA基因分析時,為獲得全長的cDNA,經(jīng)研究得到的方法包括SMART法、 Oligo-Capping法、Cap Trapper法等。但是,無論何種方法,如果不是具有polyA和Cap結(jié)構(gòu)的RNA,存在著無法獲得全長的cDNA,無法分析不包含Cap結(jié)構(gòu)的RNA片段等的問題。另一方面,作為能夠分析RNA片段的方法,人們熟知的有微陣列法,由于該方法需要高價的儀器,因此并不是容易用于實驗階段的方法。因此,人們期待開發(fā)一種對即使不具有Cap結(jié)構(gòu)的RNA片段也能進(jìn)行基因分析的、 操作簡便且價格低廉的能夠用于基因分析的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種價格低廉且操作簡便,由特定RNA來合成與其對應(yīng)的雙鏈DNA的方法以及擴(kuò)增該雙鏈DNA的方法。解決向題的技術(shù)手段鑒于上述情況,本發(fā)明的發(fā)明人注意到現(xiàn)在許多cDNA已建立數(shù)據(jù)庫,即使不對全長的cDNA,而只要能夠?qū)Σ糠制芜M(jìn)行分析的話,就能夠從數(shù)據(jù)庫中將cDNA確定出來, 由此對獲得RNA的cDNA片段的方法以及利用了該cDNA片段的RNA基因分析進(jìn)行了切實研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn),以mRNA、源自mRNA片段等具有polyA的RNA為模板,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物,合成第1鏈后,在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用添加有銜接子的隨機(jī)引物,從第1鏈合成第2鏈,由此,能夠價格低廉且操作簡便地獲得與具有PolyA的RNA相對應(yīng)的cDNA片段,進(jìn)而完成本發(fā)明。本發(fā)明涉及“含有與具有polyA的RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法, 其特征在于包括,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物,對具有polyA的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA的工序1 ;以及,在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA的工序2?!焙汀昂信c具有polyA的模板RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法,其特征在于包括,使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-1)的寡聚(dT)引物,對具有polyA的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 得到單鏈的工序1 ;在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-2)的寡聚(dT)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA的公序2 ;以及,利用3’末端含有銜接子-1堿基序列的引物1和3’末端含有銜接子-2堿基序列的引物2,以工序2中得到的雙鏈DNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)的工序3”。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法,盡管具有polyA的模板RNA是序列未知的RNA,但是,能夠獲得含有對應(yīng)(互補(bǔ)的)堿基序列的雙鏈DNA。即,本發(fā)明的方法能夠獲得用現(xiàn)有的方法難以獲得的、不具有Cap結(jié)構(gòu)的RNA片段所對應(yīng)的雙鏈DNA。此外,該法無需使用微陣列法那樣昂貴的儀器就能夠獲得與具有PolyA的RNA相對應(yīng)的雙鏈DNA。因此,根據(jù)本發(fā)明的方法,能夠操作簡便且價格低廉地進(jìn)行RNA的基因分析。具體地說,通過對由本發(fā)明的方法獲得的雙鏈DNA的序列進(jìn)行分析,并與公知的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,就能夠操作簡便且價格低廉地鑒定模板RNA。進(jìn)一步,根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增方法,盡管具有POlyA的RNA是微量的,但也能夠得到克隆可能的量的DNA。此外,由于得到的雙鏈DNA的鏈長不依賴于具有polyA的RNA的鏈長,所以相對于樣品中的總RNA在維持具有polyA的RNA的存有比率的情況下,就能夠進(jìn)行擴(kuò)增,并能夠應(yīng)用于RNA的定量分析。附圖簡要說明

圖1為本發(fā)明示例所示的雙鏈DNA擴(kuò)增方法的模式圖。圖2為對由實施例1的6.的菌落PCR得到的同一克隆的3種菌落的插入片段,進(jìn)行電泳后的凝膠成像照片。圖3為實施例4中以小鼠精巢作為樣品,使用小鼠抗PIWILl作為固定化載體,由免疫沉淀法得到RNA,并以該RNA為模板,使用本發(fā)明的方法合成DNA,利用安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100 Bioanalyzer)對該合成的DNA進(jìn)行毛細(xì)管電泳的結(jié)果圖。圖4為實施例4中以小鼠精巢作為樣品,使用小鼠抗IgG抗體固定化載體,由免疫沉淀法得到RNA,并以該RNA為模板,使用本發(fā)明的方法合成DNA,利用安捷倫2100生物分析儀對該合成的DNA進(jìn)行毛細(xì)管電泳的結(jié)果圖。發(fā)明的實施形式本發(fā)明所述的具有polyA的模板RNA(以下,有時也簡稱為本發(fā)明所述的模板 RNA),只要為具有polyA的RNA,就無特別限制,具體地,例如可以列舉為信使-RNA (mRNA)、 非編碼RNA(non-coding RNA) ,Alu RNA等。此外,本發(fā)明所用模板RNA不僅可以為這些RNA 的片段,也可以是不具有Cap結(jié)構(gòu)的RNA。而且,含有與這樣的缺乏Cap結(jié)構(gòu)的RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法,用微陣列法以外的現(xiàn)有方法都很難合成雙鏈DNA,但利用本發(fā)明的方法,即使是上述的RNA,也能夠簡單地合成與之相對應(yīng)的雙鏈DNA。本發(fā)明所述的模板RNA可以為已知序列也可以為未知序列,即使是未知序列也能夠合成或擴(kuò)增與之相對應(yīng)的雙鏈DNA,這是本發(fā)明的效果之一。本發(fā)明所述的模板RNA的鏈長,一般為30個堿基以上 1500個堿基,優(yōu)選為30 1000個堿基,更優(yōu)選為30 100個堿基,進(jìn)一步優(yōu)選為30 50個堿基。通過本發(fā)明的雙鏈DNA的合成方法制得的雙鏈DNA,由含有與本發(fā)明所述的模板 RNA對應(yīng)的堿基序列一部分的單鏈DNA和與該單鏈DNA相對應(yīng)的單鏈DNA組成。含有與具有polyA的RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法含有與具有polyA的RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法(以下,有時也簡稱為“本發(fā)明的雙鏈DNA的合成方法”),其特征在于,由以下工序組成
1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(以下,有時也簡稱為“銜接子_1”)的寡聚(dT)引物,對本發(fā)明所述的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA的工序1 ;2)在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA的工序2。可以使用本領(lǐng)域經(jīng)常使用的公知方法,進(jìn)行上述工序1,使用添加有銜接子-1的寡聚(dT)引物,對本發(fā)明所述的具有polyA的模板RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),由此得到含有與本發(fā)明所述的模板RNA互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA。可以使用市售的試劑盒進(jìn)行上述操作, 也可以使用例如核酸研究(Nucleic Acids Research), 1988. Vol. 16, No. 5 1999-2014、核酸研究,1988. Vol. 16,No. 1 265-277記載的方法。具體地例如可以為,在模板RNA中,加入添加有銜接子-1的寡聚(dT)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、4種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物,在Tris緩沖液(pH 8. 3)等的緩沖液中,于溫度一般為35 50°C,優(yōu)選為40 50°C的條件下進(jìn)行反應(yīng),時間一般為5 40分鐘,優(yōu)選為5 20分鐘。然后,進(jìn)行加熱處理或加入反應(yīng)停止液終止反應(yīng)。由此,即可得到與本發(fā)明所述的模板RNA互補(bǔ)的單鏈DNA。此時所用的本發(fā)明所述的模板RNA的量,可以根據(jù)所用樣品進(jìn)行調(diào)整,無特別限制,本發(fā)明所述的模板RNA的核酸量一般為Ing 1 μ g。例如當(dāng)使用總RNA時,其樣品量一般為IOOng 50 μ g,優(yōu)選為1 20 μ g。而且,這些RNA通常使上述核酸量包含在溶液中而用于上述工序,其溶液量一般為1 30 μ L,優(yōu)選為1 20 μ L。作為含有這樣的RNA 的樣品溶液的溶劑通常使用經(jīng)過滅菌的蒸餾水。上述寡聚(dT)引物只要是與polyA結(jié)合的引物,就無特別限制,一般可以使用本領(lǐng)域經(jīng)常使用的各種引物。具體地,可以為10 lOOmer,優(yōu)選為10 50mer,更優(yōu)選為15 30mero而且,寡聚(dT)引物添加的已知序列的DNA片段,可以是能夠作為銜接子使用的物質(zhì),一般為10 50mer,優(yōu)選為12 40mer,更優(yōu)選為15 30mer。添加有銜接子_1的寡聚(dT)弓丨物的用量,相對于Iyg模板RNA核酸量,可以含有1 250pmol,優(yōu)選為10 50pmolο上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的逆轉(zhuǎn)錄酶,只要是本領(lǐng)域經(jīng)常使用的逆轉(zhuǎn)錄酶,就無特別限制,例如可以列舉為莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV) 逆轉(zhuǎn)錄酶、禽成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus、AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(RNase H minus)等,其中優(yōu)選為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RNase H minus)。另外,各種酶的用量根據(jù)所使用的酶的種類不同而各異,相對于Iyg模板RNA核酸量,可以含有1 400個單位,優(yōu)選為10 200個單位。上述dNTPs,是本領(lǐng)域經(jīng)常使用的4種三磷酸脫氧核糖核苷酸的混合物,其使用量,相對于ι μ g模板RNA核酸量,一般為0. 1 20nmol,優(yōu)選為1 IOnmol。上述反應(yīng)終止液例如可以列舉為含有EGTA、EDTA等螯合劑的物質(zhì),其使用量根據(jù)螯合劑種類的不同而各異,按照最終濃度一般為10 lOOmmol/L,優(yōu)選為40 60mmol/L進(jìn)行添加。此外,使反應(yīng)終止的加熱處理,在溫度一般為65 100°C,優(yōu)選為65 70°C條件下進(jìn)行,時間一般為 15 60分鐘,優(yōu)選為15 30分鐘。通常,在上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中,也可加入進(jìn)行這樣的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時常用的DTT(二硫蘇糖醇)等還原劑、氯化鉀、氯化鎂、核糖核酸酶抑制劑等試劑, 這些試劑的濃度以及用量可以在本領(lǐng)域經(jīng)常使用的范圍中進(jìn)行適宜選擇。
5
上述工序1中,該工序結(jié)束后,優(yōu)選除去本發(fā)明所述的模板RNA,對得到的單鏈DNA 進(jìn)行純化。具體地,例如可以對工序1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的溶液進(jìn)行堿處理,或者進(jìn)行RNaseH 處理。上述堿處理例如可以為,將堿或其水溶液添加到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的溶液中,使反應(yīng)溶液變?yōu)閴A性。所用的堿例如可以列舉為氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬氫氧化物,氫氧化鋇、氫氧化鎂、氫氧化鈣等堿土金屬的氫氧化物,碳酸鈉等堿金屬的碳酸鹽,銨鹽,酰胺類等。其中優(yōu)選使用氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬氫氧化物,特別優(yōu)選使用氫氧化鈉。進(jìn)行堿處理時, 具體地,該溶液的pH為10 14,優(yōu)選為12 14,處理時間通常為20 120分鐘,優(yōu)選為 20 60分鐘,加熱溫度通常為50 80°C,優(yōu)選為60 70°C。進(jìn)行上述RNaseH處理時,向逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的溶液中加入RNaseH,將本發(fā)明的模板RNA與進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的對應(yīng)的 DNA進(jìn)行分離,然后使用本領(lǐng)域通常的分離柱進(jìn)行純化。這里使用的RNaseH可以為本領(lǐng)域經(jīng)常使用的任意一種RNaseH,既可以使用根據(jù)公知的方法進(jìn)行配制的RNaseH,也可以使用市售的RNaseH產(chǎn)品。此外,所使用RNaseH的用量只要為本領(lǐng)域經(jīng)常使用的范圍,就無特別限制。工序2為在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,將工序1中得到的單鏈DNA,使用5’末端添加已知序列的DNA片段(以下,有時也簡稱“銜接子-2”)的隨機(jī)引物,進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),由此,得到含有與本發(fā)明所述的模板RNA對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA。該工序2,具體地,例如可以為,將5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-2)的隨機(jī)引物,不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,含有4種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物添加到工序1得到的含有單鏈DNA的溶液中,并通常在90 98°C反應(yīng)1 15分鐘,在20 40°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在65 75°C反應(yīng)10 秒 10分鐘。工序2中使用的隨機(jī)引物的鏈長,一般為5 15mer,但當(dāng)其為6mer以下而進(jìn)行 PCR時,隨機(jī)引物與PCR引物有退火的可能性,而當(dāng)其為13mer以上時,隨機(jī)引物相互之間退火的可能性變高,因此,優(yōu)選為7 12mer,更優(yōu)選為9 12mer。具體地,B代表C (胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)或T(胸腺嘧啶),N代表A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)或T(胸腺嘧啶)時,例如可以列舉為 12N、11N、10N、9N、8N、7N、14N1B、13N1B、11N1B、10N1B、9N1B、 8N1B,優(yōu)選為 12N、11N、10N、9N、11N1B、10N1B、9N1B、8N1B 等,其中特別優(yōu)選為 11N1B、10N1B、 9N1B、12N、11N。添加到隨機(jī)引物的已知序列的DNA片段(銜接子_2),只要是能夠作為銜接子的物質(zhì)即可,其鏈長可以為10 50mer,優(yōu)選為12 40mer,更優(yōu)選為15 30mer。添加了銜接子-2的隨機(jī)引物的用量,相對于1 μ g模板RNA核酸量,可以為1 250pmol,優(yōu)選為 10 50pmol ο工序2中使用的不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,只要為不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性這兩種活性的聚合酶即可,具體地,例如可以列舉為TaqDNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等,其中優(yōu)選為TaqDNA聚合酶。工序2中,作為聚合酶,若使用既有3’ 一5’核酸外切酶活性又有鏈置換活性的聚合酶,則由于該鏈置換活性, 隨機(jī)引物退火到DNA上并延伸而得到的核苷酸鏈發(fā)生游離。其結(jié)果,由于隨機(jī)引物退火到游離后的核苷酸鏈上,因此會合成多種DNA。但是,若使用不具有3’ 一5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,由于退火到DNA上并延伸的隨機(jī)引物不會發(fā)生游離,因此能夠高效率地合成本發(fā)明的雙鏈DNA。不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的用量,根據(jù)所使用的酶的種類不同而各異,相對于IOOpg IOOng的本發(fā)明的模板DNA的核酸量,可以為1 10個單位,優(yōu)選為1 5個單位。工序2中使用的4種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNIPs)的混合物,與上述工序1中使用的核苷酸混合物相同,只要是本領(lǐng)域經(jīng)常使用的核苷酸混合物即可。其用量,相對于 IOOpg IOOng的模板DNA的核酸量,通常為0. 1 20nmol,優(yōu)選為1 lOnmol。工序2的雙鏈化反應(yīng),通常按如下順序進(jìn)行反應(yīng),在90 98°C反應(yīng)1 15分鐘, 在20 40°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在65 75°C反應(yīng)10秒 10分鐘。優(yōu)選為在94 96°C 反應(yīng)1 10分鐘,在25 35°C反應(yīng)1 3分鐘,在68 72°C反應(yīng)30秒 2分鐘。只要含有上述條件,即使階段性地改變溫度也無妨。即,也可以按照如下順序進(jìn)行,在90 98°C 反應(yīng)1 15分鐘,在25 35°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在35 45°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在 45 55°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在55 65°C反應(yīng)10秒 5分鐘,在65 75°C反應(yīng)10秒 10分鐘。下面對上述本發(fā)明的雙鏈DNA的合成方法的優(yōu)選例子進(jìn)行說明。S卩,首先向例如10 μ L核酸用量為1 20ng的具有polyA的模板RNA的溶液中, 加入1 5 μ L含有10 50 μ mol/L的5’末端添加有已知序列的寡聚(dT)引物的溶液, 以及1 5μ L含有10 200個單位/μ L的逆轉(zhuǎn)錄酶的溶液,在40 50°C反應(yīng)10 60 分鐘,而得到與模板RNA互補(bǔ)的單鏈DNA。然后,向含有與模板RNA互補(bǔ)的單鏈DNA的溶液中,加入例如氫氧化鈉等堿金屬氫氧化物,將反應(yīng)液的PH值調(diào)節(jié)至12 14,在60 70V 反應(yīng)30 60分鐘,使殘留的RNA分解。接下來,通過采用例如柱分離等提取方法的純化方法等將得到的單鏈DNA進(jìn)行純化,由此,能夠得到本發(fā)明的、含有與模板RNA互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA。進(jìn)一步,向例如10 μ L含有所得到的本發(fā)明的單鏈DNA的溶液中,加入1 5 μ L5 ~ 20 μ mol/L的在5’末端添加了已知序列的DNA片段的隨機(jī)引物,1 5 μ L各濃度為1 5mmol/L的4種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)的混合溶液,1 5個單位不具有 3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,通過如下反應(yīng),例如(1)93 98°C、1 10分鐘一(2)25 35°C、30秒 5分鐘,(3)68 72°C、1 5分鐘,即能夠得到本發(fā)明的雙鏈DNA。然后,也可采用例如柱分離將制得的本發(fā)明所述的雙鏈DNA進(jìn)行提取、純化。對含有與具有polyA的RNA相對應(yīng)堿基序列的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法本發(fā)明所述的、對含有與具有polyA的RNA相對應(yīng)堿基序列的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法(以下,有時也簡稱為“本發(fā)明的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法”),其特征在于包括以下工序1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子_1)的寡聚(dT)引物,對具有 polyA的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA的工序1 ;2)在不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-2)的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA的工序2 ;以及3)使用3’末端含有銜接子-1堿基序列的引物-1和3’末端含有銜接子_2堿基序列的引物_2,以工序2得到的雙鏈DNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)的工序3。上述工序1和工序2,與上述本發(fā)明的雙鏈DNA的合成方法中的工序1和工序2相同,其優(yōu)選操作方法也相同。即,將經(jīng)過上述工序1和工序2制得的本發(fā)明的雙鏈DNA用于工序3,就能夠?qū)信c本發(fā)明模板DNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增。上述工序3如下所述。S卩,首先制備以3’末端含有銜接子-1(本發(fā)明所述的添加到寡聚(dT)引物的已知序列的DNA片段)的方式設(shè)計出的引物1以及以3’末端含有銜接子-2(本發(fā)明所述的添加到隨機(jī)引物的已知序列的DNA片段)的方式設(shè)計出的引物2,利用引物-1、引物-2以及不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,將工序2中制得的雙鏈DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述的引物1,含有銜接子-1的全部或部分序列,其鏈長可以為12 30mer,優(yōu)選為15 25mer,更優(yōu)選為18 22mer。上述的引物2,含有銜接子-2的全部或部分序列,其鏈長可以為12 30mer,優(yōu)選為15 25mer,更優(yōu)選為18 22mer。這些引物_1和引物 2的用量,相對于工序2得到的雙鏈DNAlOpg lOOng,可以為1 250pmol,優(yōu)選為10 50pmolο工序3所用的不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,可以列舉與工序2所用的聚合酶相同的聚合酶,其優(yōu)選用量也相同。此外,本發(fā)明的擴(kuò)增方法中,工序2和工序3中,通過使用不具有3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶,很難合成鏈長不同的雙鏈DNA,因此,在維持本發(fā)明所述的模板RNA在總RNA中的存有比率的情況下,就使擴(kuò)增雙鏈DNA成為可能。上述PCR反應(yīng),可以使用本領(lǐng)域公知的方法,如核酸研究,1991. Vol. 19,3749、生物技術(shù)(BioTechniques),1994. Vol. 16,1134-1137記載的方法進(jìn)行,具體內(nèi)容如下所述。 即,例如,向利用Ing IOOng模板RNA并經(jīng)工序1和工序2制得的20 40 μ L含有本發(fā)明所述的雙鏈DNA的水溶液中,加入上述引物1,一般為0. 1 lOOpmol,優(yōu)選為0. 1 50pmol ;上述引物2,一般為0. 1 lOOpmol,優(yōu)選為0. 1 50pmol ;4種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP),一般分別為0.01 50nmol,優(yōu)選為0. 1 20nmol ;1 5個單位不具有 3’ 一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶。在Tris鹽酸緩沖液等的緩沖液中,例如在 (1)93 98°C、1 10 分鐘—(2)93 98°C、10 30 秒—50 60°C、10 30 秒—68 720C、10 30分鐘(10 30個循環(huán)),(3) 68 72°C、1 5分鐘,進(jìn)行循環(huán)反應(yīng),即能夠擴(kuò)增本發(fā)明所述的雙鏈DNA。上述PCR反應(yīng)結(jié)束后,采用本領(lǐng)域經(jīng)常使用的純化方法,例如, 優(yōu)選使用苯酚/氯仿/異戊醇混合溶液進(jìn)行提取,通過乙醇沉淀、分離柱純化、過濾器過濾等方法進(jìn)行純化。再者,下述圖1為,本發(fā)明一個示例所示的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法的模式圖。如上所述,對本發(fā)明的雙鏈DNA的合成方法以及擴(kuò)增方法得到的本發(fā)明的雙鏈 DNA,可以使用國家科學(xué)院論文集(Proceedings of the National Academy of Science), 1995,Vol 92,4347-4351等記載的本領(lǐng)域經(jīng)常使用的方法進(jìn)行堿基序列分析。具體來說例如,將使用克隆用試劑盒得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞等之后進(jìn)行培養(yǎng),通過菌落PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。然后,對質(zhì)粒進(jìn)行分離,以得到的質(zhì)粒為模板,使用試劑盒等對堿基序列進(jìn)行分析,使用分析的堿基序列進(jìn)行同源性檢索,以進(jìn)行RNA的鑒定。下面通過實施例和參考例對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明,但本發(fā)明不局限于這些實施例。實施例實施例1對3種mRNA(人白蛋白、β肌動蛋白、GAPDH)的克降1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將分別含有IXlO9拷貝的人白蛋白(2122個堿基)、β肌動蛋白(1874個堿基)、 以及GAPDH(1380個堿基)的mRNA(日本基因公司(NIPPON GENE CO.,LTD.)生產(chǎn))水溶液11 μ L,作為模板RNA水溶液。向該水溶液中加入1 μ L20 μ mol/L的逆轉(zhuǎn)錄用引物溶液 (5,-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3,)。接著,70°C 加熱 3 分鐘,使其熱變性后,在冰浴中靜置2分鐘。然后,加入2yL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用緩沖液(含有750mmol/L 氯化鉀,30mmol/L氯化鎂,50mmol/L二硫蘇糖醇的500mmol/L Tris鹽酸緩沖液(pH 8. 3)), 4 μ L dNTPs (分別為2. 5mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液的混合液,日本基因公司生產(chǎn)),1 μ L核糖核酸酶抑制劑(20個單位/ μ L,和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn)的Ribonuclease Inhibitor(Super))溶液、IyL逆轉(zhuǎn)錄酶QOO個單位/ μ L,和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn)的 Rever Script IV )溶液,在冰冷狀態(tài)下緩慢混合。42°C反應(yīng)10分鐘后,加入2 μ L 0. 5mol/ L EDTA進(jìn)行混合,停止反應(yīng)。2.堿處理向反應(yīng)停止后的溶液中,加入8μ L 0. anol/L的NaOH混合,65°C加熱30分鐘后, 在冰浴中靜置2分鐘。接下來,加入20 μ L lmol/L的TriS-HCl (pH 7.5)進(jìn)行混合后,利用 Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生產(chǎn))除去未反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物。然后,分別加入:1 μ L乙醇沉淀核酸載體(Ethachinmate)(日本基因公司生產(chǎn)),12 μ L 10mol/L醋酸銨,125 μ L乙醇,進(jìn)行混合。接著,離心分離10分鐘(18800 Xg),75%乙醇洗滌2次,沉淀,干燥后,溶解在35. 5 μ L滅菌水中。3.第2鏈合成反應(yīng)向35. 5 μ L含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的水溶液中,分別加入5 μ L Ho tGoldstar DNA 聚合酶用 10X 反應(yīng)緩沖液(Reaction Buffer,EUR0GENTEC 公司生產(chǎn)),4μ L 各 2. 5mmol/L 的dNTP混合物(日本基因公司生產(chǎn)),lyL 20 μ mol/L第2鏈合成用隨機(jī)引物溶液(5’-CA TGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3,,B 為 C、G、或 T,N 為 A、C、G 或 T),4 μ L 25mmol/ L氯化鎂,0. 5 μ L HotGoldstar DNA聚合酶(5U/ μ L, EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),在冰浴中緩慢混合,按照如下條件進(jìn)行第2鏈合成反應(yīng)95 0C 10 分鐘一30 0C 1 分鐘一40 °C 30 秒一50 °C 30 秒一60 °C 30 秒一72 °C 2 分鐘 —95°C 1分鐘一冰浴2分鐘。然后,利用Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生產(chǎn)),從得到的溶液中除去未反應(yīng)的第2鏈合成用引物。之后,分別加入1 μ L乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),12yL 1011101/1醋酸銨,125111^乙醇,進(jìn)行混合。接著,離心分離10分鐘(18800 X g), 75%乙醇洗滌2次,沉淀,干燥后,溶解在34. 5 μ L滅菌水中。4. PCR向34. 5μ L由3.得到的水溶液中,分別加入5μ LHotGoldstar DNA聚合酶用 10Χ反應(yīng)緩沖液(EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),4yL 2. 5mmol/L dNTP混合物(日本基因公司生產(chǎn)),1 μ L PCR 引物溶液(含有 20 μ mol/L、5,-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3,或者 5,-GACCATATGACGAGATCCGAG-3,),4 μ L25mmol/L 氯化鎂,0. 5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶
9(5U/ μ L EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),在冰浴中緩慢混合,按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)950C 10 分鐘一950C 20 秒· 60°C 10 秒· 72°C 30 秒 Q4 個循環(huán))—72°C 2 分鐘。然后,利用hvisorb Spin PCRapid Kit Qnvitek公司生產(chǎn)),從得到的溶液中除去未反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物。之后,分別加入IyL乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),12 μ L 10!1101/1醋酸銨、125 4 1^乙醇,進(jìn)行混合。接下來,離心分離10分鐘 (18800 Xg),75%乙醇洗滌2次,將沉淀物干燥后,溶解在4 μ L滅菌水中。5.轉(zhuǎn)化向2yL由4.制得的含有克隆用cDNA的溶液中,加入IyL 20ng/yL的pGEM Teasy Vector (Promega 公司生產(chǎn))禾口 3 μ L DNA Ligation Kit Mighty Mix(TAKARA BIO(株)生產(chǎn))溶液,16°C反應(yīng)30分鐘,將克隆用cDNA插入載體中。然后,使用EC0S Competent Ε. coli DH5 α (日本基因公司生產(chǎn)),通過42°C下45秒的熱休克法將上面所得物全部轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞。接下來,在含有100 μ g/mL氨芐西林鈉的Luria-Bertani ’ s broth (LB)瓊脂培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)16小時。6.菌落 PCR將培養(yǎng)基上單一的48個菌落的每個的一部分,加入到白蛋白cRNA擴(kuò)增用反應(yīng)液 [全量 10yL:lyL IOXUniversal Buffer (日本基因公司生產(chǎn)),1 μ L2. 5mM dNTPs (分別為2. 5mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液的混合液(日本基因公司生產(chǎn)),各1 μ L 5 μ mol/L 的兩種引物溶液(5,-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3,、5,-GAAGCACAGAGAAAAGAGGCAA AATG_3,),5. 9“1^滅菌水,0. IyL Gene Taq NT (5個單位/ μ L、日本基因公司生產(chǎn))]中,在冰浴中緩慢混合,按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)95 0C 2 分鐘一95 0C 20 秒· 58 °C 10 秒· 72 °C 20 秒(30 個循環(huán))一72°C 1 分鐘。此外,對于同一 48個菌落,對β肌動蛋白以及GAPDH同樣進(jìn)行PCR反應(yīng)。但是,β肌動蛋白的反應(yīng)溶液(全量10 μ L)、除所用引物為β肌動蛋白擴(kuò)增用引物 (5,-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3\5‘ -GTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3,)之外,其他條件與擴(kuò)增白蛋白時相同。另外,GAPDH的反應(yīng)溶液(全量10yL)、除所用引物為GAPDH擴(kuò)增用引物(5,-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3 \ 5 ‘ -GAGCACAGGGTACTTTATTGATGG-3,)之外,其他條件與擴(kuò)增白蛋白時相同。然后,向制得的各PCR反應(yīng)液中加入2μ L 6 X Loading Buffer Triple Dye (日本基因公司生產(chǎn)),進(jìn)行混合。7.電泳將5μ L由6.制得的溶液,進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳,在0. 5 μ g/mL溴乙啶染色液中浸泡10分鐘后,使用FAS- III (紫外照射機(jī)東洋紡織)確認(rèn)各菌落插入片段的種類。 3種克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在第1 3泳道的電泳結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,菌落1為源自 GAPDH的插入片段,菌落2為源自β肌動蛋白的插入片段,菌落3為源自白蛋白的插入片段。而且,對于48菌落,判斷它們到底屬于3種mRNA的哪一種的判斷結(jié)果如表1所示。[表 1]mRNA菌落數(shù)白蛋白15β肌動蛋白19GAPDH14總計48結(jié)果表明,β肌動蛋白白蛋白GAPDH= 19 15 14。由此,3種mRNA的比值在1 1 1左右,由此判定,在反映mRNA的存有比率的情況下進(jìn)行擴(kuò)增。S卩,通過本發(fā)明的方法得到的雙鏈DNA,在維持其存在比率的情況下便可進(jìn)行擴(kuò)增。此外,實施例1所用的mRNA的堿基序列如下所示。白蛋白mRNA,Human (日本基因公司生產(chǎn))GGGUUUAGCUUUUCUCUUCU⑶CAACCCCACACGCCUUUGGCACAAUGAAGUGGGUAACCUUUAUUUCCCUUCUUUUUCUCUUUAGCUCGGCUUAUUCCAGGG ⑶⑶⑶ UUCGUCGAGAUGCACACAAGA ⑶ GAG⑶UGCUCAUCGGUUUAAAGAUUUGGGAGAAGAAAAUUUCAAAGCCUUGGUGUUGAUUGCCUUUGCUCAGUAUCUUCAGCAGUGUCCAUUUGAAG⑶CAUGUAAAAUUA⑶GAAUGAAGUAACUGAAUUUGCAAAAACAU ⑶⑶ UGCUGAUGA ⑶ CAGCUGAAAAUU ⑶ GACAAAUCACUUCAUACCCUUUUUGGAGACAAAUUAUGCACA⑶UGCAACUCUUC⑶GAAACCUAUG⑶GAAAUGGCUGACUGCUGUGCAAAACAAGAACCUGAGAGAAAUGAAUGCUUCUUGCAACACAAAGAUGACAACCCAAACCUCCCCCGAUUG⑶GAGACCAGAGGUUGAU⑶GAUGUGCACUGCUUUUCAUGACAAUGAAGAGACAUUUUUGAAAAAAUACUUAUAUGAAAUUGCCAGAAGACAUCCUUACUUUUAUGCCCCGGAACUCCUUUUCUUUGCUAAAAGGUAUAAAGCUGCUUUUACAGAAUGUUGCCAAGCUGCUGAUAAAGCUGCCUGCCUGUUGCCAAAGCUCGAUGAACUUCGGGAUGAAGGGAAGGCUUC ⑶ CUGCCAAACAGAGACUCAA ⑶⑶ GCCAGUCUCCAAAAAUUUGGAGAAAGAGCUUUCAAAGCAUGGGCAGUAGCUCGCCUGAGCCAGAGAUUUCCCAAAGCUGAGUUUGCAGAAGUUUCCAA⑶UA⑶GACAGAUCUUACCAAAGUCCACACGGAAUGCUGCCAUGGAGAUCUGCUUGAAUGUGCUGAUGACAGGGCGGACCUUGCCAAGUAUAUCU⑶GAAAAUCAAGAUUCGAUCUCCAGUAAACUGAAGGAAUGCU⑶GAAAAACCUCU⑶UGGAAAAAUCCCACUGCAUUGCCGAAGUGGAAAAUGAUGAGAUGCCUGCUGACUUGCCUUCAUUAGCUGCUGAUUUUGUUGAAAGUAAGGAUGUUUGCAAAAACUAUGCUGAGGCAAAGGAUGUCUUCCUGGGCAUGUUUUUGUAUGAAUAUGCAAGAAGGCAUCCUGAUUACUCU⑶CGUGCUGCUGCUGAGACUUGCCAAGACAUAUGAAACCACUCUAGAGAA⑶GCUGUGCCGCUGCAGAUCCUCAUGAAUGCUAUGCCAAA ⑶⑶ UCGAUGAAUUUAAACCUCUUGUGGAAGAGCCUCAGAAUUUAAUCAAACAAAAUU⑶GAGCUUUUUGAGCAGCUUGGAGAGUACAAAUUCCAGAAUGCGCUAUUA ⑶ UC ⑶ UACACCAAGAAAGUACCCCAA ⑶⑶ CAACUCCAACUCUUGUAGAG ⑶ CUCAAGAAACCUAGGAAAAGUGGGCAGCAAAU⑶UGUAAACAUCCUGAAGCAAAAAGAAUGCCCUGUGCAGAAGACUAUCUAUCC ⑶ GGUCCUGAACCA ⑶ UAU ⑶⑶⑶ UGCAUGAGAAAACGCCAGUAA ⑶ GACAGA ⑶ CACCAAAUGCUGCACAGAAUCCUUG⑶GAACGGGCGACCAUGCUUUUCAGCUCUGGAAGUCGAUGAAACAUACGUUCCCAAAGAGUUUAAUGCUGAAACAUUCACCUUCCAUGCAGAUAUAUGCACACUUUCUGAGAAGGAGAGACAAAUCAAGAAACAAACUGCACUUGUUGAGCUU⑶GAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGA
GCAACUGAAAGCU⑶UAUGGAUGAUUUCGCAGCUUUUGUAGAGAA⑶GCUGCAAGGCUGACGAUAAGGAGACCUGCUUUGCCGAGGAGGGUAAAAAACUUGUUGCUGCAA⑶CAAGCUGCCUUAGGCUUAUAACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAAAGCUUAUUCAUCU⑶UUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCU⑶GCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAAUCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGβ肌動蛋白mRNA,Human (日本基因公司生產(chǎn))GGGUUUACCGCCGAGACCGCGUCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCUCGCCUUUGCCGAUCCGCCGCCCGUCCACACCCGCCGCCAGCUCACCAUGGAUGAUGAUAUCGCCGCGCUC⑶CGUCGACAACGGCUCCGGCAUGUGCAAGGCCGGCUUCGCGGGCGACGAUGCCCCCCGGGCCGUCUUCCCCUCCAUCGUGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGC⑶GAUGGUGGGCAUGG⑶CAGAAGGAUUCCUAU⑶GGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAUCCUCACCCUGAAGUACCCCAUCGAGCACGGCAUC⑶CACCAACUGGGACGACAUGGAGAAAAUCUGGCACCACACCUUCUACAAUGAGCUGCGUGUGGCUCCCGAGGAGCACCCC⑶GCUGCUGACCGAGGCCCCCCUGAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAUGACCCAGAUCAU⑶UUGAGACCUUCAACACCCCAGCCAUGUACGUUGCUAUCCAGGCU⑶GCUAUCCCUGUACGCCUCUGGCCGUACCACUGGCAUC⑶GAUGGACUCCG⑶GACGGG⑶CACCCACACUGUGCCCAUCUACGAGGGGUAUGCCCUCCCCCAUGCCAUCCUGCGUCUGGACCUGGCUGGCCGGGACCUGACUGACUACCUCAUGAAGAUCCUCACCGAGCGCGGCUACAGCUUCACCACCACGGCCGAGCGGGAAAUC⑶GC⑶GACAUUAAGGAGAAGCUGUGCUACGUCGCCCUGGACUUCGAGCAAGAGAUGGCCACGGCUGCUUCCAGCUCCUCCCUGGAGAAGAGCUACGAGCUGCCUGACGGCCAG⑶CAUCACCAUUGGCAAUGAGCGGUUCCGCUGCCCUGAGGCACUCUUCCAGCCUUCCUUCCUGGGCAUGGAGUCCU⑶GGCAUCCACGAAACUACCUUCAACUCCAUCAUGAA ⑶⑶ GACGUGGACAUCCGCAAAGACCUGUACGCCAACACA ⑶ GCUGUCUGGCGGCACCACCAUGUACCCUGGCAUUGCCGACAGGAUGCAGAAGGAGAUCACUGCCCUGGCACCCAGCACAAUGAAGAUCAAGAUCAUUGCUCCUCCUGAGCGCAAGUACUCCGUGUGGAUCGGCGGCUCCAUCCUGGCCUCGCUGUCCACCUUCCAGCAGAUGUGGAUCAGCAAGCAGGAGUAUGACGA⑶CCGGCCCCUCCAUCGUCCACCGCAAAUGCUUCUAGGCGGACUAUGACUUAGUUGC⑶UACACCCUUUCUUGACAAAACCUAACUUGCGCAGAAAACAAGAUGAGAUUGGCAUGGCUUUAUUUGUUUUUUUU⑶UUUGUUUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGCUUGACUCAGGAUUUAAAAACUGGAACG⑶GAAG⑶GACAGCA⑶CG⑶UGGAGCGAGCAUCCCCCAAAGUUCACAAU⑶GGCCGAGGACUUUGAUUGCACAUU⑶UGUUUUUUUAAUA⑶CAUUCCAAAUAUGAGAUGCGUU⑶UACAGGAAGUCCCUUGCCAUCCUAAAAGCCACCCCACUUCUCUCUAAGGAGAAUGGCCCAGUCCUCUCCCAAGUCCACACAGGGGAG⑶GAUAGCAUUGCUUUCGUGUAAAUUAUGUAAUGCAAAAUUUUUUUAAUCUUCGCCUUAAUACUUUUUUAUUUU⑶UUUAUUUUGAAUGAUGAGCCUUCGUGCCCCCCCUUCCCCCUUUUUU⑶CCCCCAACUUGAGAUGUAUGAAGGCUUUUG⑶CUCCCUGGGAGUGGGUGGAGGCAGCCAGGGCUUACCUGUACACUGACUUGAGACCAGUUGAAUAAAAGUGCACACCUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGCGAPDH mRNA, Human(日本基因公司生產(chǎn))GGGUUUAAAUUGAGCCCGCAGCCUCCCGCUUCGCUCUCUGCUCCUCCU⑶UCGACA⑶CAGCCGCAUCUUCUUUUGCGUCGCCAGCCGAGCCACAUCGCUCAGACACCAUGGGGAAG⑶GAAG⑶CGGA⑶CAACGGAUUUG⑶CGUAUUGGGCGCCUG⑶CACCAGGGCUGCUUUUAACUCUGGUAAAGUGGAUAUUGUU
12
GCCAUCAAUGACCCCUUCAUUGACCUCAACUACAUGGUUUACAU⑶UCCAAUAUGAUUCCACCCAUGGCAAAUUCCAUGGCACC⑶CAAGGCUGAGAACGGGAAGCUU⑶CAUCAAUGGAAAUCCCAUCACCAUCUUCCAGGAGCGAGAUCCCUCCAAAAUCAAGUGGGGCGAUGCUGGCGCUGAGUAC⑶CGUGGAGUCCACUGGCGUCUUCACCACCAUGGAGAAGGCUGGGGCUCAUUUGCAGGGGGGAGCCAAAAGG⑶CAUCAUCUCUGCCCCCUCUGCUGAUGCCCCCAU ⑶ UC ⑶ CAUGG ⑶⑶ GAACCAUGAGAAGUAUGACAACAGCCUCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAG⑶CAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACUGUGGAUGGCCCCUCCGGGAAACUGUGGC⑶GAUGGCCGCGGGGCUCUCCAGAACAUCAUCCCUGCCUCUACUGGCGCUGCCAAGGCUGUGGGCAAG⑶CAUCCCUGAGCUGAACGGGAAGCUCACUGGCAUGGCCUUCCGUGUCCCCACUGCCAAC ⑶⑶ CA ⑶ GGUGGACCUGACCUGCCGUCUAGAAAAACCUGCCAAAUAUGAUGACAUCAAGAAGGUG⑶GAAGCAGGC⑶CGGAGGGCCCCCUCAAGGGCAUCCUGGGCUACACUGAGCACCAG⑶GGUCUCCUCUGACUUCAACAGCGACACCCACUCCUCCACCUUUGACGCUGGGGCUGGCAUUGCCCUCAACGACCACUUU⑶CAAGCUCAUUUCCUGGUAUGACAACGAAUUUGGCUACAGCAACAGG⑶GGUGGACCUCAUGGCCCACAUGGCCUCCAAGGAGUAAGACCCCUGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCUCACUGCUGGGGA⑶CCCUGCCACACUCA⑶CCCCCACCACACUGAAUCUCCCCUCCUCACAGUUGCCAUGUAGACCCCUUGAAGAGGGGAGGGGCCUAGGGAGCCGCACCUU⑶CAUGUACCAUCAAUAAAGUACCCUGUGCUCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGC^MM 2 Il 2 車合成時不同帶來的不同擴(kuò) 曾效果。1.源自HeLa細(xì)胞的Ago2結(jié)合的RNA的取得(1)人抗Ago2抗體固定化載體的制備向 20μ L 磁性載體 Dynabeads ProteinG(InvitroGen 公司生產(chǎn))中力口入 ImlPBS (ρΗ 7. 4),混合后,使用磁性支架將載體提取出來。然后,向載體中加入5μ L lmg/ mL人抗Ago2抗體(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))和95 μ L磷酸緩沖生理鹽水(PBS ρΗ 7. 4) 的混合液,室溫反轉(zhuǎn)搖勻1小時。接下來,使用磁性支架將載體提取出來,使用Iml PBS (ρΗ 7.4)清洗3次,最后用Iml PBS (ρΗ 7.4)混懸,所得溶液即為人抗Ago2抗體固定化載體溶液。(2) HeLa細(xì)胞提取液的制備向IX IO7個HeLa細(xì)胞中,加入Iml細(xì)胞裂解液(含有20mM Tris鹽酸、200mM氯化納、2. 5mM氯化鎂的0. 05w/v% NP-40 (和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))),使用移液器將細(xì)胞混懸。將混懸液在冰浴中靜置10分鐘,離心分離Q0000Xg,20分鐘、4°C)后,取上清液即為 HeLa細(xì)胞提取液。(3)源自HeLa細(xì)胞的RNA的純化使用磁性支架從人抗Ago2抗體固定化載體溶液中將載體提取后,添加ImlHeLa細(xì)胞提取液,冷藏條件下反轉(zhuǎn)搖勻3小時。使用磁性支架對載體進(jìn)行二次提取后,使用Iml細(xì)胞裂解液,將其清洗3次。然后,在載體中加入50 μ L0. 5W/v%十二烷基硫酸鈉(SDQ溶液, 將與載體結(jié)合的蛋白質(zhì)溶出。向溶出液中加入350 μ L滅菌水,400 μ L苯酚氯仿異戊醇05 24 1)的混合物,使用渦旋混合器混合后,進(jìn)行離心分離O0000Xg,10分鐘)。 然后,取上層液,加入400 μ L氯仿,使用渦旋混合器混合后,進(jìn)行離心分離Ο0000 X g,10分鐘)。進(jìn)一步,取上層液,加入3μ L乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),40μ L 3Μ醋酸鈉,Iml乙醇,使用渦旋混合器混懸后,進(jìn)行離心分離Ο0000 X g,15分鐘)。使用Iml 70v/ 乙醇將得到的沉淀物洗凈后,室溫下風(fēng)干20分鐘,溶解在IlyL滅菌水中,即得純化的 RNA溶液。2.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將11 μ L通過上述人抗Ago2抗體固定化載體制得的RNA溶液,以及1 μ L20 μ M的寡聚(dT)引物溶液(5,-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3,),進(jìn)行混合。然后,將混合液在70°C孵育3分鐘后,在冰浴中降溫。然后,加入4yL 2. 5mM dNTP 混合液(日本基因公司生產(chǎn)),1 μ L 20U/ μ L RNase超級抑制劑(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn)),2 μ L ReverseScript IV用10 X反應(yīng)緩沖液(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn)),1 μ L 200U/ μ L Reverse Script IV (逆轉(zhuǎn)錄酶、和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn)),混合后得到總量為20 μ L 的反應(yīng)液,42°C反應(yīng)10分鐘。然后,加入2μ L 0. 5mol/LEDTA,充分混合,停止反應(yīng)。3.堿處理反應(yīng)停止后,加入8μ L 0. 2mol/L的NaOH,進(jìn)行混合,65°C加熱30分鐘后,在冰浴中靜置2分鐘。接下來,加入20 μ L lmol/L的Tris-HCl(pH 7. 5),進(jìn)行混合后,利用 Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生產(chǎn))除去未反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物。然后,分別加入1 μ L乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),12 μ L 10mol/L醋酸銨,125 μ L乙醇,進(jìn)行混合。接著,離心分離10分鐘(18800Xg),75%乙醇洗滌2次,沉淀,干燥后,溶解在;35. 5yL滅菌水中。4.第2鏈合成反應(yīng)向35. 5μ L上述3.得到的含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的水溶液中,分別加入 5 μ LHotGoldstar DNA聚合酶用IOX反應(yīng)緩沖液(EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),4yL各 2. 5mmol/L的dNTP混合物(日本基因公司生產(chǎn)),1 μ L 20 μ mol/L第2鏈合成用隨機(jī)引物溶液(5,-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3,,B 為 C、G 或 T,N 為 A、C、G 或 T), 4μ L 25mmol/L 氯化鎂,0. 5μ L HotGoldstarDNA 聚合酶(5U/μ L,EUR0GENTEC 公司生產(chǎn)), 在冰浴中緩慢混合,按照如下條件進(jìn)行第2鏈合成反應(yīng)95 0C 10 分鐘一30 0C 1 分鐘一40 °C 30 秒一50 °C 30 秒一60 °C 30 秒一72 °C 2 分鐘 —95°C 1分鐘一冰浴2分鐘。另外,取35. 5μ L同樣進(jìn)行了上述1. 3.的反應(yīng)而得到的含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的水溶液,除以下反應(yīng)溫度以外,與上述反應(yīng)相同地,進(jìn)行了第2鏈合成反應(yīng)95"C 10分鐘一30"C 1分鐘一72°C 2分鐘一95°C 1分鐘一冰浴2分鐘。接著,利用hvisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生產(chǎn)),從得到的各個溶液中除去未反應(yīng)的第2鏈合成用引物。之后,分別加入IyL乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),12 μ L 10!1101/1醋酸銨,125“1^乙醇,進(jìn)行混合。進(jìn)而,分別離心分離10分鐘 (18800 X g),使用75%乙醇洗滌2次,將沉淀物干燥,溶解在34. 5 μ L滅菌水中。5. PCR分別向34. 5 μ L由4.得到的2種水溶液中,分別加入5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶用10Χ反應(yīng)緩沖液(EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),4yL 2. 5mmol/L dNTP混合物(日本基因公司生產(chǎn)),各 1 μ L PCR 引物溶液(20 μ mol/L、5,-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3,和5,-GACCATATGACGAGATCCGAG-3,),4 μ L 25mmol/L 氯化鎂,0. 5 μ L HotGoldstar DNA 聚合酶(5U/ μ L、EUR0GENTEC公司生產(chǎn)),在冰浴中緩慢混合,按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)95 0C 10 分鐘一95 0C 20 秒· 60 °C 10 秒· 72 °C 30 秒 Q4 個循環(huán))—72°C 2 分鐘。接著,利用Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek公司生產(chǎn)),從得到的各個溶液中除去未反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物。之后,分別加入IyL乙醇沉淀核酸載體(日本基因公司生產(chǎn)),12 μ L 10!1101/1醋酸銨,125 4 1^乙醇,進(jìn)行混合。進(jìn)而,離心分離10分鐘 (18800 Xg),75%乙醇洗滌2次,將沉淀物干燥后,溶解在5 μ L滅菌水中。得到的溶液中,對每1 μ L,使用安捷倫2100生物分析儀進(jìn)行鏈長分析。其結(jié)果如表2所示。[表 2]
權(quán)利要求
1.一種含有與具有POlyA模板RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法,其特征在于包括,1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)弓丨物,對具有polyA的模板RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA的工序1,和2)在不具有3’一 5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈 DNA的工序2。
2.如權(quán)利要求1記載的合成方法,其特征在于,在工序1之后,進(jìn)一步包括將工序1制得的單鏈DNA進(jìn)行純化的工序。
3.如權(quán)利要求1記載的合成方法,其特征在于,具有polyA的RNA鏈長為30 1500個堿基。
4.如權(quán)利要求1記載的合成方法,其特征在于,隨機(jī)引物的鏈長為5 15mer。
5.如權(quán)利要求1記載的合成方法,其特征在于,工序2的雙鏈化反應(yīng),按如下順序進(jìn)行反應(yīng),90 98°C、1 15分鐘,20 40°C、10秒 5分鐘,65 75°C、10秒 10分鐘。
6.一種含有與具有polyA模板RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法,其特征在于包括,1)使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-1)的寡聚(dT)引物,對具有polyA 的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA的工序1,2)在不具有3’一5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段(銜接子-2)的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA的工序2,以及3)使用3’末端含有銜接子-1堿基序列的引物-1和3’末端含有銜接子-2堿基序列的引物_2,以工序2得到的雙鏈DNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)的工序3。
7.如權(quán)利要求6記載的擴(kuò)增方法,其特征在于,在工序1之后,進(jìn)一步包括對工序1制得的單鏈DNA進(jìn)行純化的工序。
8.如權(quán)利要求6記載的擴(kuò)增方法,其特征在于,具有polyA的RNA鏈長為30 1500個堿基。
9.如權(quán)利要求6記載的擴(kuò)增方法,其特征在于,隨機(jī)引物的鏈長為5 15mer。
10.如權(quán)利要求6記載的擴(kuò)增方法,其特征在于,工序2的雙鏈化反應(yīng),按如下順序進(jìn)行反應(yīng),90 98°C、1 15分鐘,20 40°C、10秒 5分鐘,65 75°C、10秒 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種價格低廉、操作簡便,由特定RNA合成對應(yīng)的雙鏈DNA的方法以及擴(kuò)增該雙鏈DNA的方法。含有與具有polyA的模板RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的合成方法,其特征在于,工序1為使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物,對具有polyA的模板RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到單鏈DNA;工序2為在不具有3’→5’核酸外切酶活性和鏈置換活性的聚合酶的存在下,使用5’末端添加已知序列的DNA片段的隨機(jī)引物,將工序1中得到的單鏈DNA進(jìn)行雙鏈化反應(yīng),得到雙鏈DNA。本發(fā)明還提供含有與具有polyA的模板RNA相對應(yīng)的堿基序列的雙鏈DNA的擴(kuò)增方法,其特征在于,工序3為將得到的雙鏈DNA進(jìn)一步進(jìn)行PCR反應(yīng)。
文檔編號C12N15/09GK102428180SQ20108002092
公開日2012年4月25日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者林田幸信 申請人:和光純藥工業(yè)株式會社
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