專利名稱：乳酸片球菌菌株及其生產(chǎn)片球菌素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及片球菌屬的乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)新菌株及通過培 養(yǎng)該菌株制備片球菌素的方法。
背景技術：
為了減少微生物引起的食品腐敗和食源性疾病，人類采用諸如干燥、加熱、鹽腌、 發(fā)酵和化學防腐等方法進行食品防腐，由于擔心長期攝入化學防腐劑的副作用，消費者更 加青睞不添加防腐劑的食品或僅添加天然防腐劑的食品，但不添加防腐劑的食品容易出現(xiàn) 微生物污染的狀況，如冷藏食品中會有嗜冷性病原菌單核細胞增多癥李氏桿菌，梭狀芽胞 桿菌和腐敗微生物假單胞菌、明串珠菌，它們引起食品安全問題或食品貨架期的問題。由于使用化學防腐劑可能出現(xiàn)問題，尋找某些細菌產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物抑制或殺 死有害微生物的研究成為研究的熱點。這些天然的抑菌物質可以替代那些化學防腐劑如二 氧化硫、苯甲酸、山梨酸和亞硝酸鹽。其中用食品級微生物乳酸菌產(chǎn)生的細菌素作為生物食 品防腐劑以保證食品安全性和貨架期的研究受到極大的關注。細菌素相當穩(wěn)定，可生物降 解、可被消化、在低濃度就可發(fā)揮作用。數(shù)種細菌素對許多食品腐敗和致病菌有殺菌活性， 如蠟樣芽胞桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌，單核細胞增多癥李氏桿菌， 金黃色葡萄球菌等。乳酸菌特別是乳球菌、乳桿菌、片球菌、明串珠菌、和鏈球菌傳統(tǒng)上用作發(fā)酵食品 和蔬菜的出發(fā)菌，因為它們可以產(chǎn)生良好的風味和防腐作用。其抑菌活性的重要原因之一 就是乳酸菌產(chǎn)生的細菌素。已從乳球菌、乳桿菌和片球菌發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生細菌素的菌株。從明串 珠菌、肉桿菌、鏈球菌、腸球菌和雙岐桿菌也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生細菌素的菌株。由乳酸菌產(chǎn)生的細菌 素本質為具有生物活性的蛋白質或蛋白復合物，對種屬相近的細菌有抑菌活性。乳酸菌產(chǎn) 生的細菌素有多種，其分子量、理化特性、抑菌譜、和作用方式都不盡相同。已報道有數(shù)株片球菌產(chǎn)生細菌素。最初，發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵黃瓜分離的戊糖片球菌 FBB-61, FBB-63，和 L-7230 對植物乳桿菌有抑制作用(Etchells et al, Appl Microbiol, 1964)。進一步研究表明，戊糖片球菌菌株FBB-61和L-7230抑制革蘭氏染色陽性菌片球菌、 乳桿菌、明串珠菌、腸球菌、微球菌、金黃色葡萄球菌和芽胞桿菌中的一些菌株(Fleming et al, Appl Microbiol，1975)。這些菌株的抑菌物質后來被證明是細菌素，命名為片球菌素 A(Daeschel et al,ApplEnviron Microbiol，1985)。后來發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌FBB-61 也對單核 細胞增多癥李氏桿菌有抑菌活性，然而，也發(fā)現(xiàn)該菌株并非對所有革蘭氏染色陽性細菌有 抑制作用，對一些革蘭氏染色陰性細菌和酵母完全無效(Hoover et al,Food Biotechnol, 1989)。另一個課題組從發(fā)酵香腸分離出一株產(chǎn)細菌素的乳酸片球菌(菌株H)，抑制其他 乳酸菌菌株的生長，產(chǎn)生的細菌素命名為片球菌素AcH(Mumia et al, J Ind Microbiol, 1987)。乳酸片球菌PAC1.0產(chǎn)生細菌素，命名為片球菌素PA-I (Gonzalez et al, Appl Environ Microbiol，1987)，對乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、雙發(fā)酵 乳桿菌、腸膜明珠菌有抑菌活性，對單核細胞增多癥李氏桿菌有抑菌活性。
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美國專利4，883，673 (Gonzalez, 1989)提供了一種用乳酸片球菌產(chǎn)生的細菌素抑 制色拉和色拉調味料中微生物腐敗的方法。美國專利4，^9，445(Vandenbergh et al., 1990)提供了一種用乳酸片球菌產(chǎn)生的細菌素抑制單核細胞增多癥李氏桿菌的方法。美國 專利5，219，603(BOudreauX et al. , 1993)提供了一種使用乳酸片球菌產(chǎn)生的片球菌素延 長生肉和加工肉制品貨架期的方法。美國專利5，445，835 (Vedamuthu et al. , 1995)提供 了一種用產(chǎn)片球菌素的乳酸片球菌延長酸奶貨架期的方法。上述美國專利都是將產(chǎn)生乳酸 片球菌素的乳酸片球菌用于某種食品以延長其貨架期或抑制其中的微生物。國內(nèi)專利公開 號為CN 101050437A (孫愛友等，2007)公開了一種乳酸片球菌菌株和乳酸片球菌素的生產(chǎn) 方法，該專利提供的菌株產(chǎn)生片球菌素效價為18，000AU/mL。許多研究表明培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對細菌素的產(chǎn)生有重要影響，細菌的培養(yǎng)條件 不但嚴重影響到它的生長情況，而且還與細菌素的產(chǎn)量密切相關，這些因素主要包括培養(yǎng)
基的PH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、供氧量、生物量等等(Bogovi6-Matija^6 et al, Process
Biochemist, 1998)。一般來講，在菌體進入穩(wěn)定期以前細菌素的含量隨著時間的延長而增 加，穩(wěn)定期后隨著培養(yǎng)時間的不斷延長細菌素的活性反而不斷損失。但未見針對乳酸片球 菌產(chǎn)生片球菌素的培養(yǎng)條件的全面優(yōu)化的報道。細菌素作為一種小分子蛋白質，具有蛋白質的一些基本特性，所以分離純化蛋白 質的提取方法同樣適用于細菌素的提取。片球菌素在PH值6時吸附于產(chǎn)生菌的表面，而 pH值2時則解吸附，因此，常用這種調整pH值的方法使片球菌素得到濃縮和純化(Yang et al，Appl EnvironMicrobiol，1992)。這種方法成本低，易于操作，純化時不加任何有害化學 物質，安全性高，可滿足用于食品防腐劑的片球菌素的生產(chǎn)。如進行片球菌素性質研究，則 需進行高度的純化。獲得高純度片球菌素的方法有硫酸鹽沉淀、凝膠層析、離子交換層析、 高效液相色譜等。但目前的各種提取和純化方法中只涉及從發(fā)酵液中提取分泌到細胞外的 細菌素，而仍然殘留于細胞內(nèi)的片球菌素的提取方法未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明通過對野生型乳酸片球菌 (Pediococcusacidilatici)菌株 PA003 用硫酸二乙酯(diethyl sulfate, DES)和氯化鋰 (LiCl)復合誘變劑進行誘變，得到的一株片球菌素高產(chǎn)突變菌株P2，該菌株能夠產(chǎn)生大量 片球菌素。本發(fā)明另一個目的是提供一種通過培養(yǎng)該乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2而生產(chǎn)片球菌素的方法并從培養(yǎng)基和細胞中回收片球菌素的方法，以克服 現(xiàn)有技術中野生型乳酸片球菌片球菌素產(chǎn)量低和提取方法得率低的問題。乳酸片球菌PA003菌株從國內(nèi)發(fā)酵酸菜中分離，產(chǎn)生的抑菌物質為蛋白質性質的 片球菌素(周志江等，食品科學，2006)。本發(fā)明用基因工程手段克隆該片球菌素基因，根 據(jù)基因測序結果推斷其含44個氨基酸，與乳酸片球菌PAC1. O片球菌素PA-I的結構基因 pedA(Accession number M83924)同源性為100%。pedA基因編碼62個氨基酸的前體蛋 白，經(jīng)翻譯后修飾，去除18個氨基酸的前導肽，成熟的具有抑菌活性的片球菌素為含44個 氨基酸的多肽。根據(jù)GenBank發(fā)布的乳酸片球菌PAC1. O片球菌素PA-I的結構基因pedA (Accessionnumber M83924)的DNA序列設計一對引物，上游引物序列為5，-ATG AAA AAA ATT GAAAAA TTA ACT-3，(SEQ ID NO. 2)，下游引物為 5，-CTA GCA TTT ATG ATT ACC TTG-3，(SEQ ID NO. 3)。用堿裂解法提取乳酸片球菌PA003的全細胞DNA作為模板，用PCR 反應擴增PedA基因。PCR反應的條件為94°C預變性3min，然后94°C變性30s，44°C復性 20s，72°C延伸15s，經(jīng)30個循環(huán)后再72°C延伸lOmin。PCR擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳 后進行觀察。將PCR產(chǎn)物克隆至pTA2 Vector載體，重組質粒轉化大腸桿菌DH5 α，篩選含 有重組質粒的轉化子，提取其重組質粒，測定重組質粒中乳酸片球菌ΡΑ003的pedA基因的 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)，測序結果為1 ATGAAAAAAATTGAAAAATTAACTGAAAAAGAAATGGCCAATATCATTGGTGGTAAATAC61 TACGGTAATGGGGTTACTTGTGGCAAACATTCCTGCTCTGTTGACTGGGGTAAGGCTACC121 ACTTGCATAATCAATAATGGAGCTATGGCATGGGCTACTGGTGGACATCAAGGTAATCAT181 AAATGCTAG序列中前討個核苷酸序列編碼18個氨基酸的前導肽，之后的132個核苷酸序列 編碼44個氨基酸的成熟片球菌素，最后的三個核苷酸為終止密碼。突變菌株P2通過化學誘變的方法得到。用正交試驗確定DES誘變條件為片球菌 菌液濃度為106_108Cfu/mL，DES濃度為0. 6% -1. 0%，誘變時間為20min-30min，誘變溫度為 370C -41°C，其中最佳誘變條件為片球菌菌液濃度為107cfu/mL，DES濃度為0. 8%，誘變時 間為30min，誘變溫度為37°C，試驗中共獲得20個片球菌素產(chǎn)量提高的突變菌株。挑選產(chǎn) 量提高幅度最大的五株繼續(xù)進行LiCl誘變育種試驗，從中進一步篩選出5株產(chǎn)量提高的突 變菌株，其中突變菌株P2的片球菌素效價最高。本發(fā)明乳酸片球菌P2主要有以下特性為革蘭氏染色球菌，通常以雙球菌或四疊球菌形式出現(xiàn)，無運動性，不形成芽胞， 兼性厭氧。最適生長PH值為6.2，最適生長溫度為25-401。生長依賴可發(fā)酵的碳水化合 物，以EMP途徑發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸，不產(chǎn)氣，為同型乳酸發(fā)酵菌。主要生理生化特性見表 1。表1乳酸片球菌P2的主要生理和生化特性
權利要求
1.乳酸片球菌(Pediococcusacidilatici)P2CGMCC No. 4213。
2.一種采用權利要求1所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No. 4213生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將保存的乳酸片球菌菌株P2CGMCCNo. 4213接種于MRS平板，37°C培養(yǎng)M_3Mi，挑 取典型的單個菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)活化；(b)活化后接種至本發(fā)明提供的改良MRS培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)方法如下 將活化的乳酸片球菌菌種P2CGMCC No. 4213接種至改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為 35-37°C，pH值5. 5-7. 55，培養(yǎng)時間15_22h，接種量0. 3-0. 6%，發(fā)酵液溶解氧保持20-25%， 發(fā)酵培養(yǎng)過程中流加葡萄糖；所述改良MRS培養(yǎng)基每升組成為酪蛋白胨7-10g，牛肉膏10-15g，酵母提取物5-9g，葡萄糖3-5g，乙酸鈉3_5g，檸檬酸 胺l_5g，吐溫801-2mL，磷酸氫二鉀l_2g，硫酸鎂0. 2_2g，硫酸錳0. 1-0. 5g，碳酸鈣10_20g， ρΗ6· 2-6. 8 ；(c)培養(yǎng)15-22小時后從發(fā)酵產(chǎn)物中提取片球菌素。
3.根據(jù)權利要求2所述生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步驟(b)發(fā)酵過程 中流加葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)7小時后按0. 025g/L濃度流加葡萄糖，每5升發(fā)酵液體積按aiil/ min的流加速度進行間歇流加。
4.根據(jù)權利要求2所述生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述步驟(c)從發(fā)酵產(chǎn) 物中提取片球菌素包括細胞外細菌素和細胞內(nèi)細菌素，所述細胞內(nèi)細菌素的提取方法為首先將菌液PH值調到2. 0，4°C電磁攪拌12h，離心棄上清得菌體，加無菌水清洗沉淀菌 體，再離心棄上清得菌體；然后將菌體重懸于細胞壁裂解液I中，在37°C條件下保持15min，加入細胞壁裂解液 II，迅速混勻，常溫保持7min，離心取上清液，在70°C條件下保持30min，滅酶；所述細胞壁裂解液I為25%蔗糖，30mg/ml溶菌酶；所述細胞壁裂解液II為3% SDS, 0. 2M NaOH。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici)P2CGMCC No.4213以及采用所述乳酸片球菌P2生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，將乳酸片球菌菌株P2培養(yǎng)活化后接種至本發(fā)明提供的改良MRS培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)方法如下將活化的乳酸片球菌菌種P2接種至改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為35-37℃，pH值5.5-7.5，培養(yǎng)時間15-22h，接種量0.3-0.6％，發(fā)酵液溶解氧保持20-25％，發(fā)酵培養(yǎng)過程中流加葡萄糖；培養(yǎng)1522小時后從發(fā)酵產(chǎn)物中提取片球菌素。用本發(fā)明提供的改良MRS培養(yǎng)基和經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)發(fā)酵條件下進行發(fā)酵，片球菌素產(chǎn)量達到22,000AU/ml以上，結合使用本發(fā)明提供的從細胞內(nèi)提取未分泌的片球菌素的方法，總片球菌素產(chǎn)量達27,500AU/ml以上，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P1/04GK102115720SQ201010566509
公開日2011年7月6日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權日2010年11月30日
發(fā)明者周志江, 李靜, 韓燁 申請人:天津大學