專利名稱：從發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物產(chǎn)物的吸附方法，特指一種用菌體本身和吸附劑從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的新方法。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌肽(Nisin)是由某些乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種小肽，分子量3510 Dalton。由于它對許多革蘭氏陽性菌，尤其是對引起食品腐敗的有害微生物，如梭菌、芽孢桿菌和利斯特氏菌等有強(qiáng)烈的抑制作用，而且被人們食用后在消化道內(nèi)很快被蛋白酶分解成氨基酸，對人體安全無毒，已被全世界50多個國家和地區(qū)推廣使用，可用于鮮乳和乳制品、植物蛋白食品、魚貝類等海產(chǎn)制品、肉制品、蔬菜、沙拉醬和調(diào)味用醬汁、高水分或低脂的食品、罐裝食品、酒精飲料等的防腐保鮮。
目前制約乳酸鏈球菌肽市場競爭力的主要因素是后提取成本太高。乳酸鏈球菌肽的分離提取傳統(tǒng)上一般采用真空濃縮、溶劑沉淀、酸沉淀、離子交換層析及鹽析的路線，由于采用該路線對乳酸鏈球菌肽的吸附效率較低，總收率只有40％左右，使得乳酸鏈球菌肽的后提取成本太高，在使用成本上難于同化學(xué)防腐劑進(jìn)行競爭。
乳酸鏈球菌肽提取的傳統(tǒng)方法由Muriana和Luchansky提出，其技術(shù)路線是從發(fā)酵液中將乳酸鏈球菌肽鹽析，然后采用凝膠過濾、離子交換層析、反相高壓液相色譜(RP-HPLC)等技術(shù)對乳酸鏈球菌肽進(jìn)行分離，該方法由于不采用吸附技術(shù)，乳酸鏈球菌肽總收率僅為38％左右。
Daba等報(bào)道了一種簡便的乳酸鏈球菌肽分離純化方法，該方法先將發(fā)酵液pH調(diào)至5.5，在該pH下部分乳酸鏈球菌肽吸附到菌體細(xì)胞上，然后使乳酸鏈球菌肽從菌體細(xì)胞上解析，然而根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅僅使用菌體本身來進(jìn)行吸附，吸附效率很難超過60％，因此采用該方法乳酸鏈球菌肽總收率只有10％。
Stoffels采用HIC和離子交換樹脂法提取乳酸鏈球菌肽，乳酸鏈球菌肽的純度提高了60倍，收率可達(dá)45％左右。
國內(nèi)的乳酸鏈球菌肽后提取研究工作中，還連棟等將乳酸鏈球菌肽發(fā)酵液高溫滅活菌體后用硅藻土等吸附劑進(jìn)行吸附，但由于吸附劑和進(jìn)一步的解吸劑用量都較大，不利于降低乳酸鏈球菌肽的后提取成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的方法?？朔F(xiàn)有的技術(shù)弊端，達(dá)到利用發(fā)酵菌體本身和廉價(jià)的國產(chǎn)硅酸鈣從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽，以降低乳酸鏈球菌肽后提取成本的目的。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種從發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的新方法，其特征在于它是采用兩步吸附法，即先調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、菌體吸附、離心后上清夜再用國產(chǎn)食品級多孔硅化合物硅酸鈣吸附的技術(shù)手段，從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中吸附生物防腐劑乳酸鏈球菌肽，具體步驟如下1.發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)及第一次菌體吸附首先將含有乳酸鏈球菌菌體的發(fā)酵液用堿液調(diào)節(jié)pH至5.0-6.5，用磁力攪拌器在20-50℃條件下攪拌20-60分鐘。
2.第一次解吸上述菌體懸浮液15,000rpm離心15分鐘，收集菌體，菌體用pH6.5的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽緩沖液洗滌后再次離心收集菌體。該菌體用pH為2-3的磷酸溶液懸浮，20-50℃條件下攪拌30-90分鐘以解吸。
3.第二次硅酸鈣吸附第一次離心后收集的上清夜加入0.1％-0.8％的硅酸鈣(最適量為0.3％-0.5％)20-50℃條件下攪拌0.5-2小時，制成吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物。
4.第二次解吸上述吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物離心后收集沉淀，用蒸餾水洗滌一次后用10％-30％發(fā)酵液體積的解吸劑進(jìn)行解吸，使用的解吸劑為含有有機(jī)酸鹽或無機(jī)酸鹽的十二烷基磺酸納水溶液，在20-50℃條件下攪拌25-60分鐘進(jìn)行解吸，十二烷基磺酸納使用濃度為0.3％-1％。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)合乳酸鏈球菌菌體本身在特定pH條件下對乳酸鏈球菌肽的吸附能力以及廉價(jià)的國產(chǎn)食品級多孔硅化合物硅酸鈣對乳酸鏈球菌肽良好的吸附能力的特點(diǎn)，并分別采用不同方法進(jìn)行解吸，降低吸附劑和解吸劑的使用量，從而降低乳酸鏈球菌肽的后提取成本。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明提供了一種廉價(jià)簡便的乳酸鏈球菌肽吸附新工藝，即采用即先調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、菌體吸附、離心后上清夜再用國產(chǎn)食品級多孔硅化合物硅酸鈣吸附的技術(shù)手段，從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中獲得生物防腐劑乳酸鏈球菌肽。具體步驟如下1)發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)及第一次菌體吸附首先將含有乳酸鏈球菌菌體的發(fā)酵液用堿液調(diào)節(jié)pH至5.0-6.5，實(shí)驗(yàn)證明最佳pH值為6.0-6.5，用磁力攪拌器在20-50℃條件下攪拌20-60分鐘，最佳攪拌時間為30-45分鐘。
2)第一次解吸上述菌體懸浮液15,000rpm離心15分鐘，收集菌體，菌體用pH6.5的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽緩沖液洗滌后再次離心收集菌體，該無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽緩沖液包括磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀中的任何一種。該菌體用pH為2-3的磷酸溶液(最適pH為2-2.5)懸浮，20-50℃條件下攪拌30-90分鐘(最佳攪拌時間為40-50分鐘)以解吸。
3)第二次硅酸鈣吸附第一次離心后收集的上清夜加入0.1％-0.8％的硅酸鈣(最適量為0.3％-0.5％)20-50℃條件下攪拌0.5-2小時(最佳攪拌時間為1-1.5小時)，制成吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物。
4)第二次解吸上述吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物離心后收集沉淀，用蒸餾水洗滌一次后用10％-30％體積的解吸劑進(jìn)行解吸，使用的解吸劑為十二烷基磺酸納，在20-50℃條件下攪拌25-60分鐘(最佳攪拌時間為30-40分鐘)進(jìn)行解吸，十二烷基磺酸納使用濃度為0.3％-1％(最適濃度為0.4％-0.6％)。有機(jī)酸鹽或無機(jī)酸鹽，包括氯化物、硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、或酒石酸鹽中的任何一種，濃度為1.5-4％，常用的如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化銨、氯化鐵、硫酸鉀、碳酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉、硝酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鈉等。
本發(fā)明的方法中，整個流程乳酸鏈球菌肽的吸附率為97-100％，解吸劑對乳酸鏈球菌肽的解吸效率為90-95％。
本發(fā)明的創(chuàng)造性在于研制出乳酸鏈球菌肽的兩步吸附法，即充分發(fā)揮菌體本身在特定pH條件下對乳酸鏈球菌肽的吸附能力和硅酸鈣化合物對剩余乳酸鏈球菌肽的良好的吸附能力，并分別采取不同的措施進(jìn)行解吸，即菌體吸附的乳酸鏈球菌肽采用低PH條件使之解吸，硅酸鈣化合物吸附的乳酸鏈球菌肽采用表面活性劑解吸，不僅提高了乳酸鏈球菌肽的吸附和解吸效率，還大大降低了吸附劑和解吸劑的使用量，該創(chuàng)新技術(shù)為降低乳酸鏈球菌肽的后提取成本打下了良好基礎(chǔ)。
實(shí)施例2本實(shí)施例中，從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌肽的具體步驟如下1.發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)及第一次菌體吸附取2000ml乳酸鏈球菌肽發(fā)酵液用堿液調(diào)節(jié)pH至6.0，用磁力攪拌器在20℃條件下攪拌30分鐘。
2.第一次解吸上述菌體懸浮液15,000rpm離心15分鐘，收集菌體，菌體用pH6.5的磷酸鈉緩沖液洗滌后再次離心收集菌體。該菌體用pH為2的磷酸溶液懸浮，20℃下攪拌40分鐘以解吸。
3.第二次硅酸鈣吸附第一次離心后收集的上清夜加入0.4％的硅酸鈣，20℃條件下攪拌1小時，制成吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物。
4.第二次解吸上述吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物離心后收集沉淀，用蒸餾水洗滌一次后用200ml解吸劑進(jìn)行解吸，使用的解吸劑為十二烷基磺酸納，在20℃條件下攪拌30分鐘進(jìn)行解吸，十二烷基磺酸納使用濃度為0.5％，其中含有2％的氯化鈉。
經(jīng)過分析測試，整個流程中乳酸鏈球菌肽的總吸附率為97％，總解吸效率為91％。
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的新方法，其特征在于它采用兩步吸附法，即先調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、菌體吸附、離心后上清夜再用國產(chǎn)食品級多孔硅化合物硅酸鈣吸附的技術(shù)手段，從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中獲得生物防腐劑乳酸鏈球菌肽，具體步驟如下①發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)及第一次菌體吸附首先將含有乳酸鏈球菌菌體的發(fā)酵液用堿液調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，用磁力攪拌器在20-50℃條件下攪拌30-45分鐘；②第一次解吸上述菌體懸浮液15,000rpm離心15分鐘，收集菌體，菌體用pH6.5的無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽緩沖液洗滌后再次離心收集菌體，菌體用pH為2-2.5的磷酸溶液懸浮，20-50℃條件下攪拌40-50分鐘以解吸；③第二次硅酸鈣吸附步驟①中收集的上清夜加入0.3％-0.5％的硅酸鈣，20-50℃條件下攪拌1-1.5小時，制成吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物；④第二次解吸制成的吸附劑-乳酸鏈球菌肽復(fù)合物離心后收集沉淀，用蒸餾水洗滌一次后用10％-30％發(fā)酵液體積的解吸劑進(jìn)行解吸，使用的解吸劑為十二烷基磺酸納與有機(jī)酸鹽或無機(jī)酸鹽的混合物，在20-50℃條件下攪拌30-40分鐘進(jìn)行解吸。
2.在權(quán)利要求第1項(xiàng)步驟①所記載的方法中，所使用的堿液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀中的至少一種。
3.在權(quán)利要求第1項(xiàng)步驟②所記載的方法中，該無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽緩沖液包括磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀中的任何一種。
4.在權(quán)利要求第1項(xiàng)步驟④所記載的方法中，十二烷基磺酸納使用濃度為0.4％-0.6％；有機(jī)酸鹽或無機(jī)酸鹽，包括氯化物、硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、或酒石酸鹽中的任何一種，濃度為1.5-4％。
全文摘要
一種從發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌肽的新方法，它采用兩步吸附法，即先調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、菌體吸附、離心后上清夜再用國產(chǎn)食品級多孔硅化合物硅酸鈣吸附的技術(shù)手段，從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中獲得生物防腐劑乳酸鏈球菌肽，首先采用菌體本身在特定pH條件下吸附乳酸鏈球菌肽，再用廉價(jià)的國產(chǎn)硅酸鈣吸附劑吸附，以減少化學(xué)吸附劑的使用量，降低在食品防腐中廣泛應(yīng)用的乳酸鏈球菌肽產(chǎn)品的后提取成本。
文檔編號C07K1/14GK1724562SQ20041006939
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者莊緒亮, 邱季杰, 謝慧君 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心