專利名稱：一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導的測定3′端側(cè)翼未知序列的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，是一種利用限制性內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease)酶切、發(fā)卡結(jié)構(gòu)(Hairpin Structure)連接禾口巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)擴增等技術，基于已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列測定其3'端 側(cè)翼未知DNA序列的方法。
背景技術：
隨著基因工程技術以及網(wǎng)絡的發(fā)展，越來越多的基因序列被公布并可為廣大科研 工作者所利用，但是已報道的基因中有相當一部分只是獲得了部分DNA序列。當我們不知 道某個基因完整的DNA序列時，就無法對該基因進行結(jié)構(gòu)和功能的深入研究。在分子研究 過程中經(jīng)常需要克隆已知序列的側(cè)翼區(qū)域，例如根據(jù)已知的基因或分子標記獲取人、動物 和植物的調(diào)控基因；通過基因的保守區(qū)域獲得新物種中基因的非保守區(qū)域，從而獲得完整 的基因序列；鑒定基因槍轉(zhuǎn)基因法等轉(zhuǎn)基因技術所導致的外源基因的插入位點；用于染色 體測序中的空隙填補，以獲得完整的基因組序列。目前根據(jù)已知DNA序列鑒定其側(cè)翼未知 序列的方法極其有限，因而使這項工作變得繁重和棘手。隨機測序法是通過大量的隨機測 定DNA序列，并借助計算機進行排序的方法來獲取目的DNA序列。該方法存在很大的偶然 性，通常會耗費很大的人力和物力。3'-和5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情況下獲取目的基因完整的mRNA序列。RACE 法只能獲取目的基因的可轉(zhuǎn)錄序列部分，而不能確定基因的上下游調(diào)控元件序列。另外，該 方法步驟較繁瑣，mRNA又極其不穩(wěn)定，反轉(zhuǎn)錄還易受到豐度低和高級結(jié)構(gòu)的影響，因此效果 也不是很理想。而利用同位素或生物素標記探針對基因組文庫進行雜交篩選的方法，則更 是費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、應用范圍廣、成本低廉、高效準確、發(fā)卡結(jié)構(gòu) 介導的PCR擴增方法，能夠基于已知DNA序列測定其3'端側(cè)翼未知DNA序列。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括①選用單一限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA ；②將退火的 發(fā)卡結(jié)構(gòu)(HSO)與純化的酶切產(chǎn)物進行連接；③選定發(fā)卡結(jié)構(gòu)上的一段特異性互補序列作 為3'端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的特異性序列作為5'端引物；④以 發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接物為模板，用設計的引物進行二輪的PCR(巢式PCR)擴增，并對其擴增片段進 行克隆和測序。具體步驟如下(1)引物及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的設計根據(jù)已知DNA序列設計兩條5'端特異性引物，命 名為 Primer-Fl 和 Primer_F2 (18_22bp) ；Primer_F2 的 3'端距待測序列要保留 30bp 以 上長度，它比Primer-Fl更接近待測定的未知序列(見圖1和圖3)；設計一條易形成發(fā)卡 結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序列，命名為HS0(41bp)；基于HSO設計一條3'端特異性引物，命名為 HSO-R(18bp)。
HSO 5' -GATGACCGTACCCGCCTAATGAGCGGGTACGGTCATCNNNN-3'或5 ‘ -NNNNGATGACCGTACCCGCCTAATGAGCGGGTACGGTCATC-3‘HSO-R 5' -TAGGCGGGTACGGTCATC-3，其中NNNN為隨機寡 聚核苷酸，其位置、序列和長度需要根據(jù)步驟(2)選用的限制 性內(nèi)切酶的特性而定。(2)限制性內(nèi)切酶的選擇分析已知DNA序列上的限制性內(nèi)切酶位點，選用從 Primer-Fl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的內(nèi)切酶。本發(fā)明可供選擇常用的產(chǎn)生 5'末端突出四個堿基的限制性內(nèi)切酶有EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、 Xba I和Xho I等，產(chǎn)生3'末端突出四個堿基的有Aat IKPst I ,Sac I和Sph I等，產(chǎn)生 5'末端突出兩個堿基的有Cla I ,Msp I和Nde I等。(3)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的制備對合成的寡聚核苷酸序列HSO進行94°C熱變性，隨后緩慢降 溫至25°C并保持一定時間，即可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。(4)PCR模板的構(gòu)建采用步驟(2)選擇的內(nèi)切酶對基因組DNA進行單酶切，純化 的酶切產(chǎn)物與步驟(3)獲得的發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接，即可作為PCR模板。(5)巢式PCR擴增以步驟(4)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接物為模板，用Primer-Fl和HSO-R 為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，用Primer-F2和HSO-R為引物 進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)巢 式PCR原理可快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目的片段。本發(fā)明與現(xiàn)行的方法相比，具有如下的優(yōu)點1、操作簡便。與隨機測序法相比，避免了對基因組進行大規(guī)模的測序，也無需進行 繁瑣的計算和排序工作，從而節(jié)省了大量的人力、時間和財力。2、應用范圍廣。在已知部分DNA序列的基礎上，發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導的PCR擴增可應用 于各種不同基因的3'端側(cè)翼未知序列的測定。3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足夠操作，而且可供選擇的限 制性內(nèi)切酶較多。4、引物特異性強。本發(fā)明通過利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導的PCR方法，把隨機引物的擴增 轉(zhuǎn)變成特異性引物的擴增，大幅度提高了 PCR擴增的特異性和效率。5、結(jié)果驗證簡捷。巢式PCR擴增可快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目標DNA片段， 具有簡捷、準確和實用性強等特點。6、未知序列長度不限。由于基因組DNA的酶切位點是隨機分布的，本發(fā)明可獲取 未知序列長達幾Kb的片段，而且序列的準確性和真實性不會因長度的增加而影響。7、成本低廉。本發(fā)明的核心還是簡單的PCR擴增，所以無需昂貴的儀器和試劑盒。


圖1 粘性末端的3'端側(cè)翼未知DNA序列克隆示意圖宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因組DNA經(jīng)產(chǎn)生3‘粘性末端的限制性 內(nèi)切酶Pst I酶切，純化后與發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接構(gòu)建PCR模板。圖2:宇佐美曲霉EOOl第10家族木聚糖酶基因(xynlOA)3'端側(cè)翼的測序結(jié)果圖3:5'粘性末端的3'端側(cè)翼未知DNA序列克隆示意圖
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因組DNA經(jīng)產(chǎn)生5‘粘性末端的限制性 內(nèi)切酶Hind III酶切，純化后與發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接構(gòu)建PCR模板。圖4 宇佐美曲霉EOOl第11家族木聚糖酶基因(xynllA)3'端側(cè)翼的測序結(jié)果
具體實施例方式以下結(jié)合具體 實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl xynlOA 3'端調(diào)控區(qū)序列的測定。(I)DNA酶切產(chǎn)物的制備選用Pst I對宇佐美曲霉基因組DNA進行單酶切。構(gòu)建 如下酶切體系10 X H Buffer 2μ 1, Pst I 2 μ 1，基因組DNA 10 μ 1，無菌水6 μ 1 ；將上述 體系在37°C水浴中反應4h。酶切純化產(chǎn)物(20 μ 1)命名為xynlOAT。(2)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的制備=HSO(IOOym0VL) 2 μ 1，無菌水8 μ 1，充分混勻；94°C變性 3min，緩慢降溫(1°C /s)至25°C后恒溫退火30min。(3)xynlOAT 與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接10XT4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1, HSO 3μ 1, xynlOAT 5μ 1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1 ；16°C連接過夜。(4)xynlOA 3'端調(diào)控區(qū)第一輪 PCR 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，dNTP 1· 5 μ 1，HSO 連接物 2 μ 1，XynlOA-FlO. 5μ 1，HSO-R 0. 5 μ 1，水 17. 75 μ 1，Taq 酶 0· 25 μ 1 ；94°C 5min, 30 個循環(huán)(94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin)，72°C lOmin。目的產(chǎn)物命名為 xynlOAT-Out。(5) xynlOA 3'端調(diào)控區(qū)第二輪 PCR : 10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1, xynIOAT-Out 0·5 μ 1，Xynl0A-F20.5 μ 1，HSO-R 0·5 μ 1，水 19.25 μ 1，Taq 酶 0· 25 μ 1 ; 940C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 xynlOAT-In。(6)xynlOAT-In的克隆和測序?qū)ynlOAT-In按照割膠回收試劑盒說明書上的操 作步驟進行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結(jié)果如圖2所示。實施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 xynIlA 3'端調(diào)控區(qū)序列的測定。(I)DNA酶切產(chǎn)物的制備選用Hind III對宇佐美曲霉基因組DNA進行酶切。構(gòu)建 如下酶切體系10 X M Buffer 2 μ 1，Hind III 2μ 1,0. 1% BSA 2 μ 1，基因組 DNA ΙΟμΙ，無 菌水4μ 1 ；將該體系在37°C水浴中反應4h。酶切純化產(chǎn)物(20 μ 1)命名為xynllAT。(2)發(fā)卡接頭的制備=HSO(IOOym0VL) 2 μ 1，無菌水8 μ 1，充分混勻；94°C變性 3min，緩慢降溫(1°C /s)至25°C后恒溫退火30min。(3)xynllAT 與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接10XT4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1, HSO 3μ 1, xynIlAT 5μ 1，Τ4 DNALigase 1 μ 1 ； 16°C連接過夜。(4) xyn IlA 3'端調(diào)控區(qū)第一輪 PCR :10XPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1, HSO 連接物 2 μ 1，XynllA-FlO. 5μ 1，HSO-R 0· 5 μ 1，無菌水 17. 75 μ 1，Taq 酶 0· 25 μ 1 ; 94 °C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s，56°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 xynIlAT-Out ο(5)xynllA 3'端調(diào)控區(qū)第二輪 PCR :10XPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1,xynIlAT-Out 0· 5 μ 1，Xynl 1A-F20. 5 μ 1，HSO-R 0· 5 μ 1，無菌水 19. 25 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1 ； 94 0C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s，55°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 xynllAT-In。
(6) xynlIAT-In的克隆和測序?qū)ynllAT-In按照割膠回收試劑盒說明書上的操 作步驟進行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結(jié)果如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)介導的PCR擴增已知DNA序列3'端側(cè)翼未知序列的方法，其特征在 于選用限制性內(nèi)切酶單酶切基因組DNA ；將純化的酶切產(chǎn)物與發(fā)卡結(jié)構(gòu)進行連接；利用引 物設計軟件選定發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列上的互補序列作為3'端引物以及兩條靠近未知序列端的已 知DNA序列上的特異性序列作為5'端引物；以發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接物為模板，采用設計的引物進 行巢式PCR擴增以獲取已知DNA序列3'端側(cè)翼的未知序列；(1)引物及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的設計根據(jù)已知DNA序列設計兩條5'端特異性引物，命名為 Primer-Fl和Primer_F2 (18_22bp) ；Primer-F2的3'端距離待測序列要保留30bp以上長 度，它比ft~imer-Fl更接近待測定的未知序列；設計一條易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序 列，命名為HS0(41bp)；基于HSO設計一條3'端特異性引物，命名為HSO-R(18bp)；HSO 5' -GATGACCGTACCCGCCTAATGAGCGGGTACGGTCATCNNNN-3'或 5 ‘ -NNNNGATGACCGTACCCGCCTAATGAGCGGGTACGGTCATC-3‘，HSO-R 5‘ -TAGGCGGGTACGGTCATC-3’，其中NNNN為隨機寡聚核苷酸，其位置、序列和長度需要根據(jù)步驟( 選用的限制性內(nèi) 切酶的特性而定；(2)限制性內(nèi)切酶的選擇分析已知DNA序列上的限制性內(nèi)切酶位點，選用從 Primer-Fl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的內(nèi)切酶；本發(fā)明可供選擇常用的產(chǎn)生 5'末端突出四個堿基的限制性內(nèi)切酶有EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、 Xba I和Xho I等；產(chǎn)生3'末端突出四個堿基的有Aat II, Pst K Sac I和Sph I等；產(chǎn) 生5'末端突出兩個堿基的有Cla I ,Msp I和Nde I等；(3)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成對合成的寡聚核苷酸序列HSO進行94°C熱變性3min，隨后緩慢 降溫至25°C并保持30min，即可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；G)PCR模板的構(gòu)建采用步驟(2)選擇的內(nèi)切酶對基因組DNA進行單酶切，純化的酶 切產(chǎn)物與步驟(3)形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)進行連接，即可作為PCR模板；(5)巢式PCR擴增以步驟(4)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接物為模板，用I^rimer-Fl和HSO-R為引 物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，用ft~imer-F2和HSO-R為引物進行 第二輪PCR擴增；將兩輪PCR (巢式PCR)擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)巢式PCR 原理可快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，操作過程中所使用的反應體系和條件如下(1)按如下的體系和條件單酶切宇佐美曲霉EOOl基因組DNA(以I^stI為例) IOXHBuffer 2μ 1, Pst I 2 μ 1，基因組DNA 10 μ 1，無菌水6 μ 1 ；將該體系在37°C水浴中 反應4h ；純化回收酶切產(chǎn)物并溶于20 μ 1無菌水中；酶切純化產(chǎn)物命名為xynlOAT ；(2)按如下體系和條件形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)=HSO(IOOym0VL)2 μ 1，去離子水8 μ 1，混勻； 94°C熱變性3min，隨后緩慢降溫(1°C /s)至25°C后恒溫退火30min ；(3)按如下的體系和條件連接xynlOAT與發(fā)卡結(jié)構(gòu)HS0:10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，HSO 3 μ 1，xynlOAT 5μ 1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1 ； 16°C連接過夜；(4)按如下的體系和條件進行第一輪PCR擴增10XPCRBuffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1，步驟(3)連接產(chǎn)物 2 μ 1，XynlOA-Fl 0. 5 μ 1，HSO-R 0. 5 μ 1，無菌水 17. 75 μ 1， iTaq 酶 0· 25μ 1 ;94°C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ；首 輪PCR擴增產(chǎn)物命名為xynlOAT-Out ；按如下的體系和條件進行第二輪PCR擴增10XPCRBuffer 2· 5μ 1，dNTP 1· 5 μ 1，xynlOAP-Out 0· 5 μ 1，Xynl0A-F20. 5 μ 1，HSO-R 0· 5μ 1，無 菌水 19. 25μ 1，Taq 酶 0. 25μ 1 ;94°C 5min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)， 72°C IOmin ；第二輪PCR擴增產(chǎn)物命名為xynlOAT-In。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用限制性內(nèi)切酶酶切、發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接和巢式PCR擴增等技術，基于已知DNA序列測定其3′端側(cè)翼未知DNA序列的方法。該方法通過合成一條易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序列；選用單一限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，純化后與發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接；利用引物設計軟件選定發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列上的互補序列作為3′端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的特異性序列作為5′端引物；以發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接物為模板，用設計的引物進行巢式PCR擴增以獲取已知DNA序列3′端側(cè)翼的未知序列。本發(fā)明具有操作簡便、應用范圍廣、操作限制少、引物特異性強、結(jié)果驗證簡捷、未知序列長度不限和成本低廉等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102140502SQ20101055088
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者唐存多, 張慧敏, 李劍芳, 汪俊卿, 譚中標, 鄔敏辰, 陳偉 申請人:江南大學