專利名稱：抑制hiv-1的雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)rna表達(dá)原件的構(gòu)建及功能檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起，是最嚴(yán)重的流行病之一。而抑制HIV-I的復(fù)制可以有效改善艾滋病病人的生命狀況，同時(shí)也是HIV-I 相關(guān)研究的必要實(shí)驗(yàn)手段。目前，抑制HIV-I的方法包括通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、受體類似物以及RNA干擾等方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是通過(guò)在基因轉(zhuǎn)錄水平抑制HIV-1的基因表達(dá)的方法。實(shí)現(xiàn)RNAi的方法包括化學(xué)合成小的siRNA片段直接進(jìn)行RNAi，或通過(guò)基因載體表達(dá)人工RNAi誘導(dǎo)前體進(jìn)行RNAi。化學(xué)合成siRNA由于成本較高，難于廣泛使用。通過(guò)基因載體表達(dá)人工RNAi誘導(dǎo)前體進(jìn)行RNAi，通常是通過(guò)DNA依賴的RNA聚合酶III (Pol III， TO或Hl啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的短RNA折疊而成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，稱為短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)。目前已報(bào)道針對(duì)HIV-I的近兩百條已通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)效果的siRNA或shRNA序列，為HIV-I的RNAi靶位點(diǎn)的選取提供大量信息和參考依據(jù)。但同時(shí)由于HIV-I復(fù)制迅速、突變率高的特點(diǎn)，使單一的RNAi沒(méi)有有效的抑制效果。數(shù)學(xué)模型以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，至少需要4個(gè)不同的靶位點(diǎn)的siRNA才可以有效抑制HIV-I產(chǎn)生逃逸突變。對(duì)HIV-I 的RNAi基因治療應(yīng)采用多靶位RNAi的方式。如果采用多個(gè)單獨(dú)的shRNA表達(dá)原件進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立抑制，往往會(huì)對(duì)正常的細(xì)胞RNA干擾通路進(jìn)行干擾，因此可以采用多個(gè)RNAi通過(guò)單一啟動(dòng)子進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明采用單一啟動(dòng)子表達(dá)RNA，形成特殊的雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，對(duì)HIV-I 的多個(gè)基因進(jìn)行RNAi抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)HIV-I的基因進(jìn)行抑制，設(shè)計(jì)針對(duì)HIV-I不同靶基因區(qū)域的siRNA序列，通過(guò)Two-St印PCR的方法構(gòu)建針對(duì)HIV-I的dlhRNA_VGTE的表達(dá)原件，并構(gòu)建于載體質(zhì)粒。建立體外實(shí)驗(yàn)研究其抑制HIV基因融合EGFP表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)的效果，在體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞水平中通過(guò)顯微熒光及流式細(xì)胞分析檢測(cè)其抑制HIV-I基因表達(dá)的效果。實(shí)現(xiàn)單一表達(dá)原件對(duì)多個(gè)HIV-I基因的表達(dá)抑制。本發(fā)明首先提供了抑制HIV-I的雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件(dlhRNA_VGTE)的基因序列，該序列是序列表SEQ ID No. 1所示的序列，序列標(biāo)注見附圖
4;該表達(dá)原件在真核細(xì)胞中，通過(guò)聚合酶的作用，轉(zhuǎn)錄成RNA，折疊成為dlhRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在核酸酶Dicer的作用下，被切割成為四個(gè)獨(dú)立的siRNA (19nt)分別行使RNA干擾作用。本發(fā)明根據(jù)HIV-I序列保守性和RNAi靶序列特點(diǎn)，分別選擇了 HIV的4個(gè)基因2 個(gè)結(jié)構(gòu)基因env，gag和2個(gè)調(diào)節(jié)基因vpu，tat作為抑制靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)選取權(quán)利要求1所述序列靶向HIV-I的如下四個(gè)RNAi靶序列
權(quán)利要求
1.抑制Hiv-I的雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件(dlhRNA-VGTE)的基因序列，是序列表SEQ ID No. 1所示的序列；該表達(dá)原件在真核細(xì)胞中，通過(guò)聚合酶的作用，轉(zhuǎn)錄成RNA，折疊成為 dlhRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在核酸酶Dicer的作用下，被切割成為四個(gè)獨(dú)立的siRNA(19nt)分別行使RNA干擾作用。
2.如權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于，根據(jù)HIV-I序列保守性和RNAi靶序列特點(diǎn)， 分別選擇了 HIV的4個(gè)基因2個(gè)結(jié)構(gòu)基因env，gag和2個(gè)調(diào)節(jié)基因vpu，tat作為抑制靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)選取權(quán)利要求1所述序列靶向HIV-I的如下四個(gè)RNAi靶序列GeneSense strandAnti-sense strandenvGTTGGAGAAGTGAATTATATATATATAATTCACTTCTCCAACgagGGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATCTTGTGGGGTGGCTCCCvpuGGAGCAGAAGACAGTGGCAATATTGCCACTGTCTTCTGCTCCtatGGCATCTCCTATGGCAGGAAGCTTCCTGCCATAGGAGATGCC上述序列用Blast在線進(jìn)行同源分析證實(shí)為HIV-I保守序列。
3.如權(quán)利要求1所述雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件(dlhRNA-VGTE)序列的構(gòu)建方法，其特征在于，過(guò)Two-st印PCR法獲得(long hairpin RNA, IhRNA)長(zhǎng)發(fā)卡RNA表達(dá)原件，再以 IhRNA 為模板經(jīng)過(guò) Two-st印 PCR 法獲得(double long hairpin RNA, dlhRNA)雙長(zhǎng)發(fā)卡 RNA表達(dá)原件；最終構(gòu)建含有dlhRNA-VGTE表達(dá)原件的質(zhì)粒pGMT-dlhRNA_VGTE。
4.檢測(cè)如權(quán)利要求1所述雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件(dlhRNA-VGTE)序列功能所需的 HIV 基因 EGFP 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pfeig-EGFP/pEnv-EGFP/pI^at-EGFP/pVpu-EGFP。
全文摘要
抑制HIV-1的雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件構(gòu)建及功能檢測(cè)，本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原理以及HIV-1序列保守性分析，選擇HIV-1的衣殼蛋白gag基因(532－552)，包膜蛋白env基因(1428－1448)，非結(jié)構(gòu)蛋白tat基因(131－151)和vpu基因(143－161)，設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA序列，通過(guò)兩次Two-stepPCR的方法，最終構(gòu)建雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件(序列表SEQIDNo.1所示)，通過(guò)顯微熒光觀測(cè)以及流式細(xì)胞分析定量檢測(cè)雙長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA表達(dá)原件對(duì)HIV基因EGFP融合蛋白真核表達(dá)的抑制效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)dlhRNA表達(dá)原件可以有效抑制HIV多個(gè)基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102352360SQ20111035748
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者刁丹紅, 劉暢, 孔曉紅, 梁之聘, 袁青 申請(qǐng)人:南開大學(xué)