專利名稱：半乳糖激酶在合成n-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的應(yīng)用，屬于生 物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前許多的天然產(chǎn)物和藥物都帶有糖基，糖基的改變會(huì)影響這些糖綴合物的生物 學(xué)功能及性質(zhì)，如影響其穩(wěn)定性，半衰期等。對(duì)糖綴合物的糖基進(jìn)行改變首先需要得到糖基 供體，因此，如何得到糖基供體成為研究中的關(guān)鍵步驟。N-乙酰半乳糖(GalNAc)是一種重要的糖基，在生物體內(nèi)廣泛存在并且參與 許多的生物功能。合成含有N-乙酰半乳糖(GalNAc)的糖綴合物需要核苷乙酰半乳糖 (UDP-GalNAc)作為糖基供體。UDP-GalNAc可以通過核苷乙酰葡萄糖(UDP-GlcNAc)轉(zhuǎn)換 得到，但是這種生產(chǎn)方法產(chǎn)量很低，成本較高。一個(gè)更有效的方法是利用激酶將felNAc 作為底物生產(chǎn)N-乙酰半乳糖-1-磷酸(GalNAc-I-P)，然后在焦磷酸化酶的作用下，生成 UDP-GlcNAc。目前生產(chǎn)得到feilNAc-1-P的激酶主要是通過feilNAc激酶，還未見有其它激酶用 于生產(chǎn)feilNAc-1-P的報(bào)道。作為GalNAc-I-P的衍生物，葡萄糖磷酸也具有重要的生物功能。目前得到葡 萄糖-1-磷酸步驟非常復(fù)雜。生物體內(nèi)一般是先合成葡萄糖-6-磷酸，然后在激酶pgm的 作用下，再合成葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)。目前還沒有發(fā)現(xiàn)有直接利用Glc產(chǎn)生Glc-I-P 的激酶。利用本發(fā)明中的半乳糖激酶(felk)，可以直接將葡萄糖直接生成Glc-1-P。本發(fā) 明提供了一種非常有效簡(jiǎn)便的合成Glc-I-P的方法。半乳糖激酶(EC 2. 7. 1. 6，ATP :D-galactose_l-phosphototransferase，Ga IK) 主要是可以催化MgATP依賴的磷酸化作用，使半乳糖C-I位的羥基磷酸化從而得到 Gal-I-P (半乳糖-1-磷酸)。由于其在酶法制備磷酸糖的過程中具有應(yīng)用價(jià)值，因此，對(duì)不 同來源的半乳糖激酶的進(jìn)行底物適應(yīng)性研究引起了廣泛關(guān)注。目前對(duì)已有的(ialk底物適應(yīng)性研究表明，D-半乳糖，2-脫氧-半乳糖，3-脫氧-半 乳糖，2-氨基-2-脫氧-半乳糖，D-巖藻糖，ATP, 2' -dATP，3，-dATP都是GalKs可能的底 物。但是目前發(fā)現(xiàn)的feilK不能利用N-乙酰半乳糖(GalNAc)生成felNAc-1-P及其衍生物。同時(shí)，目前僅僅發(fā)現(xiàn)只有來源于乳酸菌的feilk具有非常微弱的合成Glc-I-P的能 力。由于其微弱的活性(對(duì)gal的利用是對(duì)glc利用率的沈倍)，因此利用來源于乳酸菌 的feilK生產(chǎn)Glc-I-P基本不可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其 衍生物的應(yīng)用。
術(shù)語(yǔ)解釋酶活⑶是指在40°C，pH 8.0的條件下，半乳糖激酶在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾 底物生成N-乙酰半乳糖的酶量。氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖磷酸及 N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(1)將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的半乳糖激酶用Tris-HCl溶液配制成半乳 糖激酶溶液；(2)將與N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物用Tris-HCl溶液配制成N-乙酰 半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；(3)將半乳糖激酶溶液與N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按6 IOmmol/U的比例混合，并加入MgCl2和ATP ；然后在40 45°C反應(yīng)3 4h，經(jīng)純化步驟，獲 得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。所述的N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物為葡萄糖-1-磷酸。所述的iTris-HCl 溶液濃度為 50mM、pH 8. 0。所述步驟(3)中，MgCl2終濃度為5mM，ATP終濃度為5mM。所述步驟(1)中的半乳糖激酶采用如下步驟制得<1>將核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的基因片段插入到質(zhì)粒pMCSG7中，制得重 組質(zhì)粒 pMCSG7-GalK ；<2>將步驟<1>制得的經(jīng)驗(yàn)證目的基因被正確插入的重組質(zhì)粒pMCSG7_GalK轉(zhuǎn)化 到E. coli BL2KDE3)中的菌體進(jìn)行蛋白表達(dá)，得到酶液；<3>將步驟<2>制得的酶液經(jīng)純化步驟，制得半乳糖激酶。所述步驟<2>中的蛋白表達(dá)，條件如下培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，轉(zhuǎn)速220rpm搖床培養(yǎng)；當(dāng)OD6tltlnm達(dá) 到0. 6-0. 8時(shí)，加入終濃度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12小時(shí)，即得。所述步驟<3>中的純化步驟，具體如下將酶液冷凍離心收集菌體，用平衡緩沖液洗滌重懸細(xì)胞，破壁后；離心取上清，經(jīng) 層析和透析，然后經(jīng)濃縮后獲得。上述平衡緩沖液成分如下500mM NaCl, 20mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH 8. 0 ；破壁 條件為400w超聲破壁10分鐘；離心條件為12000g冷凍離心30分鐘；層析為鎳離子親和 柱層析，洗脫緩沖液為500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. 0，500mM 咪唑；透析用 20mM、pH 8. 0的Tris-HCl緩沖液透析。上述濃縮，步驟如下先用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到的濃縮液用硅膠柱進(jìn)行純化，用CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液濃度梯度混合物作為洗脫液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液的比例變 化從1 1到0 1，再將含有產(chǎn)物的洗脫液進(jìn)行合并，并用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。本發(fā)明有益效果如下利用本發(fā)明的來源于S. pneumoniae TIGR4的半乳糖激酶(GalK) (GenBank accession No. AAK75925)，可以高效的合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物，克服了現(xiàn)有研究中由于半乳糖激酶不能合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸或者合成葡萄糖-1-磷酸 的效率非常低，無法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的技術(shù)偏見，本發(fā)明中所述的來源于S. pneumoniae TIGR4的半乳糖激酶(galK)對(duì)gal的利用是對(duì)glc利用率的3倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他來源的半 乳糖激酶對(duì)gal與glc利用率之間的差距，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 feilKSpe4蛋白表達(dá)純化；其中(A)GalKSpe4 蛋白純化；(B) SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖；其中M 蛋白分子量；泳道1 全細(xì)胞提取物泳道2 洗滌后電泳；泳道3 洗脫后電 泳；泳道4:洗脫后電泳；圖2酶活最適溫度及pH(A)最適溫度；⑶最適pH圖3 TLC檢測(cè)結(jié)果其中泳道1 =ATP ；泳道 2 =Gal ；泳道 3 =Glc ；泳道 4 =GlcNAc ；泳道=GalNAc ；泳道 6 GlcNAc-I-P ；泳道7 =Glc-I-P ；泳道8 以Gal為底物的酶反應(yīng)；泳道9 以Glc為底物的酶 反應(yīng)as substrate ；泳道10 =GlcNAc為底物的酶反應(yīng)；泳道11 =GalNAc為底物的酶反應(yīng)；圖 4 Gal-I-P MS 結(jié)果圖 5 GalNAc-I-P MS 結(jié)果圖 6 Glc-I-P MS 結(jié)果圖 7 Gal-I-P NMR 結(jié)果圖 8 GalNAc-I-P NMR 結(jié)果圖 9 Glc-I-P 匪R 結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法及試劑如無特殊說 明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。實(shí)施例1材料和方法1. 1菌種與方法E. coli DH5 α 購(gòu)買于 Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)，蛋白表達(dá)菌株 Ε. coli BL21 (DE3)F- ompT hsdSB (r>TB) gal dcm (DE3)購(gòu)買于 Novagen (Carlsbad, CA)。 PMCSG7質(zhì)粒來自于Novagen (Madison, WI)。PCR所使用的試劑和各種限制性酶來自 Invitrogen (Carlsbad, CA)。Qiagen (Valencia，CA)。質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)買 于 Qiagen 公司(Valencia，CA)。鎳離子親和層析柱(5ml)及 HiLoad_16/60_superdex 200 柱購(gòu)買于 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)。1. 2 從 S. pneumonia TIGR4 中克隆 galK 基因。基因 galK 的 DNA序列(GenBank accession No. AAK75925)從 S. pneumoniae TIGR4 基因組中提取出來，PCR引物如下
GalKS :5，-TACTTCCAATCCAATGCGATGGCACAACATCTTACT-3， (SEQ ID NO. 3)GalKA :5’ -TTATCCACTTCCAATGCTAGTCAAGGACGCGAG-3，(SEQ ID NO. 3) 擴(kuò)增得到1100-bp的DNA片段，通過DNA測(cè)序證明了該序列的正確性。PCR片段被 克隆到質(zhì)粒PMCSG7中。隨后，重組質(zhì)粒pMCSG7-GalK被轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α細(xì)胞中。挑 取的單菌落用限制圖譜和DNA測(cè)序分析。測(cè)序正確的重組載體被轉(zhuǎn)化到Ε. coli BL2KDE3) 中進(jìn)行蛋白表達(dá)。1. 3 feilKSpe4的過表達(dá)及蛋白純化。含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE!3)菌株在IL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 370C，轉(zhuǎn)速220rpm。當(dāng)OD600nm達(dá)到0. 6-0. 8之間時(shí)，加入終濃度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行蛋白 誘導(dǎo)表達(dá)。在16°C下過夜，冷凍離心收集菌體。蛋白的表達(dá)情況通過SDS-PAGE方法檢測(cè)。蛋白純化平衡緩沖液(500mMNaCl, 20mM Tris_HCl，pH 8. 0，20mM 咪唑)，洗滌重 懸細(xì)胞，400w超聲破壁10分鐘。12，OOOg冷凍離心30分鐘取上清，將上清加到預(yù)先平衡過 的鎳離子親和層析柱中。洗脫緩沖液(500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. 0，500mM咪唑) 洗脫目的蛋白，收集目的蛋白并用Tris-HCl緩沖液(20mM，pH 8.0)透析。目的蛋白的純度 及分子量，用12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。Bradford法測(cè)定蛋白濃度。純化出來的蛋白命名 為feilKSpe4，酶液中加入20%甘油并保存在-20冰箱中待用。1.4酶活性質(zhì)檢測(cè)及酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)描述蛋白GalKSpe4 對(duì) Gal 的活性反應(yīng)體系(8mM Gal, IOmM ATP,5mM MgCl2,6yM GALK)在Tris-HCl緩沖液QOmM，pH 8. 0)中在45°C下孵育180分鐘。在反應(yīng)中被消耗 的還原糖用DNS方法定量測(cè)定，以D-Gal作為參比。溫度Q5-50°C )和pH(3. 0-11. 0)對(duì) GalKSpe4的影響均在以Gal為底物的情況下測(cè)定。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)是通過測(cè)定反應(yīng)過程O分鐘，每隔30秒取樣測(cè)定)中線性部分的斜 率得到的。1. 5 GalKSpe4的底物適應(yīng)性GalKSpe4催化Gal、Glc、GalNAc的能力是在45°C條件下孵育混合物汕檢測(cè)，混合 物中含有 50mM Tris-HCl, pH 8. 0,5mM MgCl2, 5mM ATP 和適量的酶 GalKSpe4。通過沸水浴 5分鐘終止反應(yīng)，隨后離心去除蛋白沉淀。上清用薄層層析法分析產(chǎn)物生成情況，展開劑為 正丁醇乙酸水=2 1 1 (體積比)。1.6純化磷酸化的產(chǎn)物反應(yīng)混合物(IOml)中包括40mMGal/Glc/GalNAc, 50mM ATP,5mM MgCl2,1. 5mg/ml GalKSpe4, IOOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)。45°C條件下孵育汕后，反應(yīng)液沸水浴5分 鐘，離心除去蛋白沉淀。上清用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到的濃縮液用硅膠柱進(jìn)行純化，用 CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液濃度梯度混合物作為洗脫液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3W甲醇溶 液的比例變化從1 1到0 1。將含有產(chǎn)物的洗脫液進(jìn)行合并，并用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行 濃縮。1. 7鑒定產(chǎn)物薄層層析分析法在硅膠板上進(jìn)行的。200-400目的硅膠用來純化產(chǎn)物。純化得到 的所有化合物均用質(zhì)譜和氫譜做了充足的分析和鑒定。質(zhì)譜在Bruker Micro TOF分光儀 上進(jìn)行。氫譜在400MHz下用Bruker DPX 400分光儀分析的。
2試驗(yàn)結(jié)果2. 1 GalKSpe4 表達(dá)與純化為了研究fetlKSpe4酶學(xué)性質(zhì)，將克隆的fetlKSpe4基因轉(zhuǎn)入pMCSG7載體中。重組 酶在E. coli中表達(dá)，并用鎳柱純化。收集純酶并用Tris-HCl緩沖液QOmM，pH 8. 0)進(jìn)行 透析脫鹽。純化得到的felKSpe4分子量為37KD，這與通過氨基酸序列計(jì)算得到的理論分子 量相吻合(圖1)2. 2酶活性質(zhì)研究經(jīng)研究溫度及pH對(duì)酶活的影響，發(fā)現(xiàn)，GalKSpe4的最適溫度為45°C，在25°C時(shí)也 有酶活。但是當(dāng)溫度在45°C以上是，酶會(huì)迅速失活，溫度達(dá)到55°C時(shí)，酶幾乎沒有了活性。 如圖4B所示，不同pH下fetlKSpe4的酶活性質(zhì)研究表明，該酶在中性pH環(huán)境下可催化Gal 的磷酸化，最適pH為8.0(圖2)。2. 3利用feilKSpe4合成糖磷酸及其衍生物通過TLC實(shí)驗(yàn)和DNS反應(yīng)測(cè)定了糖/糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化率(圖3)。已證明，通過普 通硅膠柱從反應(yīng)液上清中成功分離得到了產(chǎn)物，并進(jìn)一步通過LC-MS和NMR鑒定了產(chǎn)物的 性質(zhì)。feilKSpe4的底物適應(yīng)性研究表明，該酶對(duì)Gal具有很高的活性，同時(shí)，它也可以利用 Glc 和 GalNAc。利用 GalKSpe4 可以有效的合成 Gal-l-P，Glc-I-P, GalNAc-I-P (圖 4-8).同時(shí)還檢測(cè)了 fetlKSpe4對(duì)于不同的底物(fell、Glc、GalNAc)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)， 其結(jié)果與底物適應(yīng)性研究相吻合。該酶對(duì)于fell的0&值(4. 22!!^1!!!^1)約是對(duì)于 Glc (1. 42mM_1 mirT1)和 GalNAc (1. 37mM_1 mirT1)的 3 倍(表 1)。表1 fetlKSpe4對(duì)不同糖的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)
權(quán)利要求
1.氨基酸序列如SEQID NO. 1所示的半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及 N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)將氨基酸序列如SEQID NO. 1所示的半乳糖激酶用Tris-HCl溶液配制成半乳糖激 酶溶液；(2)將與N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物用Tris-HCl溶液配制成N-乙酰半乳 糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；(3)將半乳糖激酶溶液與N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按6 IOmmol/U的比例混合，并加入MgCl2和ATP ；然后在40 45°C反應(yīng)3 4h，經(jīng)純化步驟，獲 得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的Tris-HCl溶液濃度為50mM、pH8. 0。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中，MgCl2終濃度為5mM，ATP 終濃度為5mM。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的半乳糖激酶采用如下步驟 制得<1>將核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的基因片段插入到質(zhì)粒pMCSG7中，制得重組質(zhì) 粒 pMCSG7-GalK ；<2>將步驟<1>制得的經(jīng)驗(yàn)證目的基因被正確插入的重組質(zhì)粒pMCSG7-GalK轉(zhuǎn)化到 E. coli BL2KDE3)中的菌體進(jìn)行蛋白表達(dá)，得到酶液；<3>將步驟<2>制得的酶液經(jīng)純化步驟，制得半乳糖激酶。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟<2>中的蛋白表達(dá)，條件如下培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，轉(zhuǎn)速220rpm搖床培養(yǎng)；當(dāng)OD6tltlnm達(dá)到 0. 6-0. 8時(shí)，加入終濃度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12小時(shí)，即得。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟<3>中的純化步驟，具體如下將酶液冷凍離心收集菌體，用平衡緩沖液洗滌重懸細(xì)胞，破壁后；離心取上清，經(jīng)層析和透析，然后經(jīng)濃縮后獲得。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述平衡緩沖液成分如下500mMNaCl, 20mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH 8. 0 ；破壁條件為400w超聲破壁10分鐘；離心條件為 12000g冷凍離心30分鐘；層析為鎳離子親和柱層析，洗脫緩沖液為500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. 0,500mM 咪唑；透析用 20mM、pH 8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液透析。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述濃縮，步驟如下先用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到的濃縮液用硅膠柱進(jìn)行純化，用CH2Cl2/5mM NH4HCO3的 甲醇溶液濃度梯度混合物作為洗脫液，CH2Cl2/5mM NH4HCO3的甲醇溶液的比例變化從1 1 到0 1，再將含有產(chǎn)物的洗脫液進(jìn)行合并，并用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。
10.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物為葡 萄糖-1-磷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及半乳糖激酶在合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸及其衍生物的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。包括(1)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的半乳糖激酶配制成半乳糖激酶溶液；(2)將與N-乙酰半乳糖或N-乙酰半乳糖衍生物配制成N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液；(3)將半乳糖激酶溶液與N-乙酰半乳糖溶液或N-乙酰半乳糖衍生物溶液按比例混合，并加入MgCl2和ATP；反應(yīng)后，經(jīng)純化步驟，獲得N-乙酰半乳糖-1-磷酸或N-乙酰半乳糖-1-磷酸衍生物。本發(fā)明克服了現(xiàn)有研究中由于半乳糖激酶不能合成N-乙酰半乳糖-1-磷酸或者合成葡萄糖-1-磷酸的效率非常低，無法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的技術(shù)偏見。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102127570SQ20101054835
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者沈杰, 王鵬, 陳敏, 陳蕾蕾 申請(qǐng)人:山東大學(xué)