專利名稱：新型抗ErbB2人源化抗體MIL12的制備及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型抗體及其用途。通過優(yōu)化密碼子，獲得了新型抗ErbB2人源化抗 體MIL12。應用分子生物學技術(shù)全合成了基因，經(jīng)過真核表達及純化，應用免疫學以及細胞 生物學等實驗對新抗體的功能進行評價。
背景技術(shù)：
作為表皮生長因子受體家族(ErbB家族)成員，ErbB2 (HER2，HER2/neu)是具有酪 氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。ErbB2的分子結(jié)構(gòu)可分為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域三部分，其 中胞外域又可分為D1、D3兩個極相似的由β片層圍成的桶狀結(jié)構(gòu)域和D2、D4兩個富含半 胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)域部分具有酪氨酸激酶活性。ErbB2同源或異源二聚體的形成伴隨著 細胞內(nèi)的C末端酪氨酸殘基的磷酸化，引起細胞內(nèi)含SH2、SH3和PTB結(jié)構(gòu)域的蛋白活化，募 集、激活下游相關(guān)蛋白，通過信號級聯(lián)反應，導致細胞增殖及分化。ErbB2在多種腫瘤組織中 過表達，包括乳腺癌(25 30%)、卵巢癌(18 43% )、非小細胞肺癌(13 55%)、前列 腺癌(5 46%)、胃癌(21 64%)、頭頸部腫瘤(16 50%)等上皮細胞來源的惡性腫 瘤，而在成人正常組織中表達水平很低或不表達。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，ErbB2高表達的腫瘤患 者往往對放化療不敏感，且易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，患者預后不佳。因而成為腫瘤免疫治療的理 想靶分子，也是目前腫瘤治療研究的熱點。1998年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準由Genetech公司開發(fā)的靶向ErbB2 的人源化單克隆抗體Here印tin (trastuzumab)上市，應用于ErbB2過表達的乳腺癌患者 的臨床治療。目前，Herceptin已成為廣泛應用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線臨床治療藥物。Here印tin可能通過以下幾個途徑抑制ErbB2過度表達的乳腺癌細胞生長(1)與 ErbB2特異性結(jié)合，阻斷配體介導的細胞信號傳遞，影響上皮細胞生長；(2)加速ErbB2蛋白 受體的降解；(3)通過ADCC作用提高免疫細胞攻擊和殺傷腫瘤細胞的能力，增強化療所致 的細胞毒性；(4)下調(diào)血管皮生長因子和其它血管生長因子，抑制腫瘤血管組織的生長。全抗體分子主要的表達方式為哺乳動物細胞表達，目前世界上抗體的產(chǎn)能遠低于 需求量?？贵w的產(chǎn)量除了受制于培養(yǎng)規(guī)模、生產(chǎn)工藝以及純化工藝等因素外，從很大程度上 依賴于抗體基因在哺乳動物細胞內(nèi)的表達水平。本研究在Herceptin抗體的基礎(chǔ)上，通過計算機輔助分析以及分子生物學技術(shù)， 設計獲得了一種新的抗人ErbB2人源化抗體可變區(qū)編碼基因，其編碼的抗體可變區(qū)氨基酸 序列與Here印tin相同，但在哺乳動物細胞中的表達水平遠高于Here印tin。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公布了一組新的抗體可變區(qū)基因，序列表中序列1所示基因序列編碼抗體 MIL12的輕鏈可變區(qū)氨基酸；序列表中序列2所示基因序列編碼抗體MIL12的重鏈可變區(qū)
氨基酸。本發(fā)明公布了一種新的抗人ErbB2人源化抗體MIL12，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列
3由序列1編碼；其重鏈可變區(qū)氨基酸序列由序列2編碼。本發(fā)明公布的抗人ErbB2人源化抗體MIL12的一個特征在于，該抗體在哺乳動物 細胞中的表達水平要明顯優(yōu)于Here印tin。本發(fā)明公布的抗體MIL12的一個特征是可以特異性識別結(jié)合靶抗原ErbB2。本發(fā)明公布的抗體MIL12的一個特征是有效地抑制、殺傷ErbB2陽性的腫瘤細胞。本發(fā)明公布了抗體MIL12可用于生產(chǎn)治療不當增殖相關(guān)疾病藥物的應用前景。本發(fā)明還公布了抗體MIL12制備方法，具體實施過程如下1)利用計算機輔助分析，獲得新抗體基因；2)利用全合成PCR技術(shù)合成抗體基因；3)抗體的表達及鑒定；4)抗體生物學活性鑒定。下面參照上述步驟詳細描述MIL12抗體的設計及制備過程。設計及制備本發(fā)明抗 體的方法僅僅是說明相關(guān)方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修 改的方法。1)利用計算機輔助分析，獲得新抗體基因根據(jù)抗體氨基酸序列，選擇在哺乳動物細胞中常用的密碼子進行反向翻譯，通過 生物信息學技術(shù)合理優(yōu)化，增加基因的穩(wěn)定性及其在哺乳動物細胞的表達水平，獲得相應 的抗體基因。2)利用全合成PCR技術(shù)合成抗體基因；根據(jù)獲得的抗體基因。利用基因全合成PCR技術(shù)，設計相應的引物，通過重疊PCR 的方法獲得全長基因；克隆入克隆載體，進行序列測定。3)抗體的表達及鑒定a)抗體的表達將抗體基因構(gòu)建至真核表達載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)等方 法瞬時轉(zhuǎn)染真核表達細胞，培養(yǎng)足夠長時候后收獲上清，其中含有表達的目的抗體。b)雙夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA):以合適的抗體包被后作為捕獲抗體，經(jīng)過 封閉后，加入待測樣品以及標準樣品進行捕獲反應；隨后利用合適的酶標二抗進行顯色反 應，測定樣品中目的蛋白的含量。c) SDS-PAGE 依據(jù)目的蛋白的大小配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)實驗需 要制備還原電泳樣品或非還原電泳樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白；經(jīng)過考馬斯 亮藍染色后，確定目的蛋白分子量。4)抗ErbB2抗體生物學活性鑒定a)流式細胞分析收集目的細胞；緩沖液(PBS+2%胎牛血清)洗滌后，加入一抗， 4。C反應30mins ；緩沖液洗滌2次，加入相應的二抗，4°C避光反應30mins，緩沖液洗滌2次 后重懸在鞘液中直接進行流式細胞分析或者以的多聚甲醛固定，4°C避光保存。b)抑制生長實驗以ErbB2陽性細胞作為靶細胞，加入不同濃度的抗體作用于靶 細胞，設立陰性對照、陽性對照及實驗組；作用48h后，以MTT法測定抗體對靶細胞生長抑制 活性。c)抗體依賴的細胞毒試驗(ADCC)標記ErbB2陽性細胞作為靶細胞，用淋巴細胞 分離液從外周血中分離出外周血單個核細胞作為效應細胞；根據(jù)相應比例混合后，加入不等量的抗體，于圓底96孔培養(yǎng)板上進行殺傷實驗，設立實驗孔、靶細胞自發(fā)釋放孔、最大釋 放孔及背景孔；37°C孵育2h。利用多功能酶標儀進行檢測，計算殺傷率。


圖1抗體MIL12基因的電泳分析。其中泳道1為核酸標準分子量DL2000 ；泳道2 為輕鏈可變區(qū)基因；泳道3為重鏈可變區(qū)基因。圖2抗體平均表達量比較。圖3 SDS-PAGE分析抗體MIL12的分子量。泳道1為MIL12 ；泳道2為Here印tin ； 泳道3為人IgG ;M表示標準蛋白分子量Marker。圖4抗體MIL12特異性識別表達ErbB2抗原的SKV03、MCF7、SKBR3等靶細胞。 A. MCF7 細胞；B. SKBR3 細胞；C. SK0V3 細胞。圖5 MIL12特異性識別外源性表達的ErbB2抗原。A. R2表示ErbB2_EGFP轉(zhuǎn)染陽 性細胞；B. MIL12識別外源表達的ErbB2。圖6流式分析技術(shù)測定MIL12抗體與Here印in對靶細胞的親和力。圖7 MIL12抑制腫瘤細胞系生長。A.抗體抑制MCF7細胞生長；B.抗體抑制SK0V3 細胞生長。圖8抗體介導ADCC殺傷腫瘤細胞系。A.抗體介導ADCC殺傷MCF7細胞；B.抗體 介導ADCC殺傷SK0V3細胞。實施例一抗ErbB2抗體MIL12合理設計及基因合成一、材料引物設計軟件為biosim軟件，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase 為 TAKARA 公司產(chǎn)品；dNTP 為 TAKARA 公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy vector system為Invitrogen公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；基因測序由北京諾賽基因 組研究中心有限公司完成；其他相關(guān)試劑均為市購。二、方法結(jié)果1、抗體MIL12的基因獲得根據(jù)Herceptin抗體的氨基酸序列，選擇在哺乳動物細胞中使用頻率較高的密碼 子，進行反向翻譯，通過生物信息學技術(shù)合理優(yōu)化，增加基因的穩(wěn)定性及其在哺乳動物細胞 的表達水平，獲得抗體的輕鏈可變區(qū)基因序列(序列1)及重鏈可變區(qū)基因序列(序列2)。 根據(jù)實施例2中構(gòu)建抗體真核表達載體需要，在抗體輕鏈可變區(qū)基因5’端及3’端分別引 入EcoR V和Xho I酶切位點；在抗體重鏈鏈可變區(qū)基因5’端及3’端分別引入Pvu II和 BstE II酶切位點。2、引物設計根據(jù)基因全合成的原理，利用計算機輔助設計軟件，設計引物，考慮引物的二級結(jié) 構(gòu)、GC含量等相關(guān)參數(shù)。每條基因設計10條引物，分別編號為PU P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9及P10，用于基因全合成。3、全基因合成1)引物合成后以無菌水稀釋，方法如下a)取引物管12000RPM離心2mins，引物按IOOuM的濃度稀釋，_20°C保存；

b)取少量引物P2 P9混合成終濃度為IOuM作為使用液；
c)取少量引物Pl和PlO混合稀釋成終濃度為IOuM作為使用液P1/P10 2)基因全合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下
a)取IuL P2 P9混合引物作為模板，配制如下Overlap PCR體系
P2 P9混合引物 dNTP
IOXBuffer
Pyrobest DNA polymerase P1/PI0引物 無菌水補足總體積為50uL b)將以上PCR體系進行如下反應
IuL 3uL 5uL 0. 3uL
4uL (引物先不加)
95 "C5mins94 0C30s “62 0C30s72 0C30s72 0C7mins
個循環(huán)
反應結(jié)束后，降到室溫。 加入引物P1/P10，進行如下PCR反應
95 °C5mins94 °C30s Λ62 °C30s72 °C30s72°C7mins
25個循環(huán)反應結(jié)束后，降到室溫。c) 1 2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，抗體重鏈基因回收350bp大小片段，輕 鏈基因回收320bp大小片段。d)回收加尾(Pyrobest DNA polymerase不能在PCR產(chǎn)物3，端加尾A，所以不能 直接連接T載體)，作如下IOuL體系
回收片段
IOXBuffer
dNTP
普通Taq酶
8. 2uL IuL 0. 5uL 0. 3uL
反應條件如下72°C 20mins,反應結(jié)束后，降到室i e)取加尾產(chǎn)物，連接pGEM-T Easy載體
6
加尾產(chǎn)物 4. 2uL2 X 連接 Buf5uLT 載體0. 5uLT4 連接酶0. 3uL室溫連接2h或者4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有 100 μ g/mL氨卞青霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100 μ g/mL氨 卞青霉素(終濃度)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取質(zhì) 粒，獲得的質(zhì)粒進行核酸測序鑒定。Overlap PCR擴增后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得特異大小的目的條帶(圖1)； 產(chǎn)物經(jīng)過回收、加尾、克隆等分子生物學技術(shù)，成功克隆入PGEM-TEasy載體；經(jīng)過測序鑒 定，合成的基因與目的序列一致。根據(jù)Here印tin抗體的基因信息，利用相似的方法我們還合成了 Here印tin原始 基因序列。實施例二抗ErbB2抗體MIL12表達、鑒定及生物學功能鑒定一、材料抗體真核表達載體pTGS-FRT-DHFR由本公司構(gòu)建并申請國家專利(專利授權(quán)號 ZL200510064335. 0)；引物應用biosim軟件設計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；脂質(zhì) 體、MTT為Invitrogen公司產(chǎn)品，羊抗人IgG、及辣根酶標記的羊抗人IgG及人IgG為本公 司制備；內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；SKV03、MCF7、SKBR3購自ATCC ；DELFIA EuTDA細胞毒作用 試劑盒為PE公司產(chǎn)品；其他試劑為市購產(chǎn)品。一、方法1、抗體的表達1. 1抗體真核表達載體的構(gòu)建選擇本公司獲得的含有人IgGl抗體恒定區(qū)基因的表達載體pTGS-FRT-DHFR(專利 授權(quán)號ZL200510064335. 0)作為本發(fā)明抗體的表達載體。將實施例一所述獲得的MIL12抗 體及Herceptin抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆載體用相應的內(nèi)切酶消化(重鏈可變區(qū)基因用 Pvu II和BstE II消化，輕鏈可變區(qū)基因用EcoR V和Xho I消化)后，與經(jīng)相同內(nèi)切酶消 化的載體連接。經(jīng)過轉(zhuǎn)化等分子生物學常用技術(shù)，構(gòu)建獲得真核表達載體。以MIL 12抗體 表達載體的構(gòu)建為例，具體實施如下a)如實施例一所述，獲得的抗體MIL12輕重鏈可變區(qū)基因構(gòu)建到pGEM-TEasy載體 中，獲得的載體分別命名為PGEM-T-MIL12VL和pGEM_T_MIL12VH ；b)取 pGEM-T-MIL12VL 用 EcoR V 和 Xho I 消化；c)取 1 μ g pTGS-FRT-DHFR 載體，用 EcoR V 和 Xho I 消化。用 DNA 連接酶 T4 連 接所得的經(jīng)EcoR V及Xho I消化的pTGS-FRT-DHFR載體和用EcoR V及Xho I消化的抗體 MIL12輕鏈可變區(qū)基因。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有100 μ g/mL氨卞青霉 素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100 μ g/mL氨卞青霉素(終濃度) 的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取質(zhì)粒。所提取的質(zhì)粒經(jīng) EcoR V和Xho I消化后，用瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇一個攜帶有抗體MIL12輕鏈可變 區(qū)基因的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，獲得的攜帶抗ErbB2人源化抗體MIL12輕鏈可變區(qū)基因的 質(zhì)粒 pTGS-MIL12VL。d)取 pGEM-T-MIL12VH 用 Pvu II 和 BstE II 消化；e)取 1 μ g pTGS_MIL12VL 載體，用 Pvu II 和 BstE II 消化。用 DNA 連接酶 T4 連 接所得的經(jīng)Pvu II和BstE II消化的pTGS-MIL12VL載體和用Pvu II和BstE II消化的 抗體MIL12重鏈可變區(qū)基因。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有100 μ g/mL氨卞 青霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100 μ g/mL氨卞青霉素(終濃 度)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取質(zhì)粒。所提取的質(zhì) 粒經(jīng)Pvu II和BstE II消化后，用瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇一個攜帶有抗體MIL12重 鏈可變區(qū)基因的克隆。作為上述程序的結(jié)果，在pTGS-MIL12VL基礎(chǔ)上獲得的攜帶抗ErbB2人源化抗體 MIL12重鏈可變區(qū)基因的質(zhì)粒pTGS-MIL12。1. 2抗體表達將獲得的抗體MIL12以及Here印tin的真核表達載體，通過脂質(zhì)體介導的方法瞬 時轉(zhuǎn)染至CHO細胞，48h后收獲上清，通過雙夾心ELISA法以及SDS-PAGE等實驗分析目的抗 體的表達情況。利用羊抗人IgG以及辣根酶標記的羊抗人IgG進行雙夾心ELISA法檢測上清中 抗體的含量，以未轉(zhuǎn)染上清作為陰性對照，人IgG純品作為標準品。ELISA實驗結(jié)果顯示， MIL12抗體以及Herc^pitn抗體表達上清中均有抗體表達。其中MIL12抗體表達量約為 9. 3士2. 13 μ g/mL，遠高于Here印tin抗體表達量4. 3士2.43 μ g/mL(圖2)。以非還原的 形式進行SDS-PAGE實驗，結(jié)果顯示表達的MIL12抗體與Here印in抗體分子量一致，均為 155KDa(圖 3)。2、抗體的功能鑒定2. 1 MIL12單克隆抗體的識別鑒定利用表達ErbB2抗原的SKV03、MCF7、SKBR3等腫瘤細胞系對獲得的抗體MIL12進 行識別功能鑒定。流式細胞分析結(jié)果(圖4)顯示，MIL12抗體可以特異性地識別SKV03、 MCF7、SKBR3等腫瘤細胞系。將ErbB2胞外區(qū)及跨膜區(qū)基因構(gòu)建在pEGFP-Nl載體上，與EGFP 融合表達。結(jié)果顯示(圖5)，MIL12能特異性識別外源性表達的ErbB2抗原；提示本發(fā)明獲 得的抗體MIL12可以特異地結(jié)合ErbB2抗原。進一步利用流式分析技術(shù)，測定不同濃度的抗體與靶細胞的結(jié)合情況，結(jié)果顯示， MIL12抗體的親和力與Hercepin相近(圖6)。2. 2抑制及殺傷腫瘤細胞功能利用SKV03、MCF7等腫瘤細胞系對獲得的抗體抑制腫瘤細胞生長及殺傷腫瘤細胞 的功能進行驗證。利用SKV03、MCF7進行生長抑制實驗(圖7)，與人IgG對照組相比較，MIL12具有 明顯的抑制SKV03、MCF7細胞生長的活性，并且抑制活性與陽性對照Hercetpin類似。ADCC實驗中以標記的SKV03、MCF7細胞為靶細胞，以人外周血單個核細胞為效應 細胞，當效靶比為50 1時，抗體都能有效殺傷靶細胞(圖8)，結(jié)果與陽性對照Hercetpin 類似。
8
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種抗體可變區(qū)基因，輕鏈可變區(qū)基因如序列1所示；重鏈可變區(qū)基因如序列2所示。
2.本發(fā)明涉及一種抗體，其特征在于該抗體可變區(qū)由權(quán)利要求1所述抗體可變區(qū)基因編碼。
3.權(quán)利要求1所述抗體可變區(qū)基因編碼的抗體在抑制ErbB2陽性細胞不當存活或者不 當增殖中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型抗ErbB2人源化抗體MIL12的制備及其應用。本發(fā)明公開了一組新的基因序列，其編碼的抗體輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列與已上市抗體Herceptin相同，但其在哺乳動物細胞內(nèi)的表達水平遠高于Herceptin。體外生物學功能評價結(jié)果提示，獲得的上述抗體能夠特異性識別erbB2抗原，并且能介導ADCC效應殺傷erbB2陽性的腫瘤細胞，生物學活性與Herceptin類似。本發(fā)明還公開了上述抗體的制備方法。
文檔編號C12N15/13GK101974535SQ20101052886
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者馮健男, 劉旭, 呂明, 朱康勤, 沈倍奮, 耿樹生, 黎燕 申請人:北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司;中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所