專利名稱：家兔絮狀表皮癬菌鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，主要涉及聚合酶鏈反應(yīng)試驗中的引物在檢測、鑒定 絮狀表皮癬菌中的用途。使用這些引物能夠檢測家兔皮膚常發(fā)皮膚癬菌病的動態(tài)變化，并 為家兔皮膚癬菌病診斷、治療和兔場癬菌病凈化奠定理論基礎(chǔ)，并提供技術(shù)性指導。
背景技術(shù)：
家兔的皮膚真菌病是一種發(fā)病率高、傳染性強、難治愈的人畜共患傳染病。在家畜 中主要感染兔、犬、貓，主要侵害家兔皮毛，出現(xiàn)皮屑、結(jié)痂、脫毛、滲出、毛囊炎及癢感等癥 狀，不僅影響家兔生長發(fā)育，降低飼料報酬率和抵抗力，而且嚴重影響家兔的皮毛質(zhì)量及易 繼發(fā)其他疾病導致死亡，給養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。另外，本病還可感染人，常造成人的 體癬、頭癬和手癬，極大地影響了人們的身體健康。家兔皮膚真菌病病原以須癬毛癬菌最常 見，近年來，絮狀表皮癬菌，石膏樣小孢子菌，黃癬菌(許蘭氏原型)及念珠菌屬的熱帶念珠 菌等也有報道，其中，家兔絮狀表皮癬菌的感染呈上升趨勢，為了能快速區(qū)別鑒定該菌，非 常有必要建立一個快速、簡便的鑒定方法，能夠在兔場流行之前采取有效措施進行防控，在 引進種兔時進行皮膚癬菌病的快速檢驗、檢疫，在兔場皮癬菌凈化提供有效監(jiān)測手段。在疾病診斷方法，研究人員已經(jīng)使用以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的技術(shù)，并成 功檢測了受感染動物病原體。在家兔皮膚癬菌病診斷方面，有基于病原菌核糖體RNA基因 區(qū)的ITS，設(shè)計引物，使用PCR技術(shù)和測序分析技術(shù)加以鑒別、診斷，有利用隨機引物進行皮 膚真菌基因組DNA擴增，進行多態(tài)性分析，達到鑒別診斷的目的，但是這些方法在臨床實踐 中，成本高，實際操作和分析手段對操作人員要求較高，在臨床上難以推廣應(yīng)用。本發(fā)明的DNA序列來自不同病原菌的基因組未知功能序列，在GenBank序列比對 中未發(fā)現(xiàn)與之同源性高的序列，設(shè)計的特異性引物，通過PCR可有效區(qū)別于其它病原菌，從 而達到鑒別、鑒定的目的，本發(fā)明鑒定、檢測方法操作簡單，快速，特異性強。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組檢驗家兔絮狀表皮癬菌的核苷酸序列。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供家兔絮狀表皮癬菌鑒定方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了鑒定絮狀表皮癬菌的特異性引物序列和擴增產(chǎn)物的序列。特異性引 物對包括正向引物序列SEQ ID NO :1所述的堿基序列，反向引物序列SEQ ID NO :2，以及 SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的互補序列，擴增產(chǎn)物序列的互補序列。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定家兔絮狀表皮癬菌的方法，該方法包括以下步驟(1)提取待測癬菌DNA，或者提取待檢測家兔皮膚毛樣DNA ；(2)特異性引物對人工合成正向引物序列SEQ ID NO 1和反向引物序列SEQ ID NO :2。(3)以⑴的DNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增；
PCR 25 μ L 反應(yīng)體系10 XPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 1 μ L,25mmol/L Mg2+I μ L, Taq DNA聚合酶1. 5U，lOmmol/L引物各lyL，模板(基因組DNA) 1 μ L，不足部分 用雙蒸水補足。反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min，變性 94°C 30s，退火 60°C 30s，延伸 72°C 100s，35 個 循環(huán)；72°C延伸IOmin。(4)PCR產(chǎn)物擴增的產(chǎn)物經(jīng)0.8-1%瓊脂糖凝膠電泳、熒光顯色后，通過目測或與 標準樣品比較擴增片段大小達到鑒定絮狀表皮癬菌的目的。當擴增產(chǎn)物為單一 DNA片段，大小為1030bp，判定為絮狀表皮癬菌；當DNA條帶數(shù)為0，判定為無絮狀表皮癬菌感染。下列實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明，可以用于以下典型實驗方案達到發(fā)明 內(nèi)容的目的，本發(fā)明的實施例并不限于此，凡依照本發(fā)明公開序列和引物進行的PCR所做 的修改、優(yōu)化的實施內(nèi)容，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


以須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌標準株及臨床菌株基因 組DNA為樣本，鑒定絮狀表皮癬菌。泳道樣品1 =DNAMarker =4500, 3000,1200,800, 500, 200bp ；2 須毛癬菌標準菌株；3-5 須毛癬菌臨床菌株；6 犬小孢子菌標準菌株；7-8 犬小 孢子菌臨床菌株；9 絮狀表皮癬菌標準菌株；10-12 絮狀表皮癬菌臨床菌株；13 石膏小 孢子菌標準菌株；14 石膏小孢子菌臨床菌株；15 空白對照；16 兔基因組DNA。
具體實施例方式實施例1 所選菌株須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌標準株各一 株。將上述菌株接種于真菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基(大豆胨1%，葡萄糖4%，瓊脂1.8%，氯霉 素0. 005%，放線菌酮0. 05% )的菌絲體接種于150ml真菌選擇性液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng) 10-15天，挑取菌絲體于研缽中，液氮研磨，將磨碎的菌絲體0. 05-0. Ig于1. 5ml Eppendorf 管中，采用尿素法提取基因組DNA，具體操作如下0. 05-0. Ig研磨好的菌絲樣品加入ImL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/L Tri s-HClpH 8. 0,62. 5mmol/LNaClU % SDS)，搖勻，12000r/min 離心 5min，吸取上清液，上清液 12000r/min再次離心5min ；將上清液移入另一新管中，加入等體積的苯酚氯仿異戊醇 (25 24 1)溶液，用力振蕩數(shù)次混勻，12000r/min離心5min ；取上清到一新管中加入 等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH 5. 2)，_20°C放置30min, 12000r/min離心 15min ；棄上清液，倒置使管壁液體流盡，70%無水乙醇洗沉淀，室溫放置干燥30min，溶于 50ul雙蒸水中，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｌ禺愋砸飳θ斯ず铣烧蛞镄蛄蠸EQ ID NO :1和反向引物序列SEQ ID NO 2。采集健康家兔血1ml，用全血基因組DNA提取試劑盒提取家兔基因組DNA，作為PCR 反應(yīng)陰性對照樣本，具體操作可參考所購相關(guān)試劑盒說明書。以上述DNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增PCR 25 μ L 反應(yīng)體系10 XPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 1 μ L,25mmol/LMg2+I yL,Taq DNA聚合酶1. 5U，10mmol/L引物各1 μ L，模板(基因組DNA) 1 μ L，不足部分 用雙蒸水補足。反應(yīng)條件預(yù)變性940C 5min ；變性 94°C 30s，退火 60°C 30s,延伸 72°C 100s, 35 個 循環(huán)；72°C延伸IOmin。取擴增產(chǎn)物各5ul，0. 8%瓊脂糖電泳，在凝膠成像分析儀上觀察，圖1結(jié)果表明該 特異性引物能特異性擴增出絮狀表皮癬菌，為大小約1030bp單一條帶，須癬毛癬菌、石膏 小孢子菌、犬小孢子菌和兔基因組DNA、空白對照無擴增片段。實施例2 所選菌株須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌標準株各一株 及臨床分離株。上述菌株只是作為實驗材料，也可選擇其他分離株，對本發(fā)明實施沒有影 響。將上述菌株接種于真菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基(大豆胨1%，葡萄糖4%，瓊脂1. 8%, 氯霉素0. 005%，放線菌酮0. 05% )的菌絲體接種于150ml真菌選擇性液體培養(yǎng)基，28°C 培養(yǎng)10-15天，挑取菌絲體于研缽中，液氮研磨，將磨碎的菌絲體0. 05-0. Ig于1.5ml Eppendorf管中，提取基因組DNA，具體操作如下0. 05-0. Ig 研磨好的菌絲樣品(100mmol/L Tris-HCl ρΗ9· 0,40mmol/L EDTA PH8.0)，振蕩混勻，加/入IOOyL 10% SDS，300 μ L氯化芐，劇烈振蕩，使管內(nèi)混合物呈 乳狀，50°C保溫lh，每隔幾分鐘振蕩混勻1次，冷卻至室溫，加入300 μ L預(yù)冷的3mol/ LNaAc (pH5. 2)溶液，混勻，然后冰浴15min，11000r/min離心15min ；取上清液，加等體積氯 仿異戊醇(24 1)，混勻，12000r/min離心5min;取上清，取上清到一新管中加入等體積 的異丙醇和 1/10 體積的 3mol/L NaAc (pH 5. 2)，_20°C放置 20min, 12000r/min 離心 15min ； 棄上清液，倒置使管壁液體流盡，70%無水乙醇洗沉淀，室溫放置干燥30min，溶于50 μ L雙 蒸水中，-20°C保存?zhèn)溆?。采集健康家兔?ml，用全血基因組DNA提取試劑盒提取家兔基因組DNA，作為PCR 反應(yīng)陰性對照樣本，具體操作可參考所購相關(guān)試劑盒說明書。特異性引物對人工合成正向引物序列SEQ ID NO :1和反向引物序列SEQ ID NO 2。以上述DNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增PCR 25 μ L 反應(yīng)體系10 XPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 1 μ L,25mmol/L Mg2+I μ L, Taq DNA聚合酶1. 5U，10mmol/l引物各lyL，模板(基因組DNA) 1 μ L，不足部分 用雙蒸水補足。反應(yīng)條件預(yù)變性940C 5min ；變性 94°C 30s，退火 60°C 30s,延伸 72°C 100s, 35 個 循環(huán)；72°C延伸IOmin。取擴增產(chǎn)物各5 μ L，0. 8%瓊脂糖電泳，熒光顯色后，在凝膠成像分析儀通過目測 與標準樣品比較擴增片段大小達到鑒定絮狀表皮癬菌的目的。結(jié)果該特異性引物能特異性擴增出絮狀表皮癬菌標準菌株和臨床菌株，為大小 約1030bp單一條帶，須癬毛癬菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌標準菌株及臨床菌株和兔基 因組DNA、空白對照無擴增片段。結(jié)果判定當擴增產(chǎn)物為單一 DNA片段，大小為1030bp，判 定為絮狀表皮癬菌；當DNA條帶數(shù)為0，判定為無絮狀表皮癬菌。
實施例3 所選菌株絮狀表皮癬菌標準株一株，臨床家兔皮膚毛樣5個樣本。上述菌株只是 作為實驗材料，也可選擇其他分離株，對本發(fā)明實施沒有影響。將須癬毛癬菌標準菌株接種于真菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基(大豆胨1 %，葡萄糖4%， 瓊脂1. 8%，氯霉素0. 005%，放線菌酮0. 05% )的菌絲體接種于150ml真菌選擇性液體培 養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)10-15天，挑取菌絲體于研缽中，液氮研磨，將磨碎的菌絲體0. 05-0. Ig于
1.5ml Eppendorf管中，采用氯化芐法提取基因組DNA，臨床毛樣采用氯化芐法提取基因組 DNA,具體操作如下0. 05-0. Ig 研磨好的菌絲樣品、0. 01-0. Ig 家兔皮膚毛樣(IOOmmol/L Tris-HCl pH9. 0,40mmol/L EDTA pH8. 0)，振蕩混勻，加入 100 μ L 10% SDS，300 μ L氯化芐，劇烈振蕩， 使管內(nèi)混合物呈乳狀，50°C保溫lh，每隔幾分鐘振蕩混勻1次，冷卻至室溫，加入300μ L預(yù) 冷的3mol/LNaAc (pH5. 2)溶液，混勻，然后冰浴15min, 11000r/min離心15min ；取上清液， 加等體積氯仿異戊醇(24 1)，混勻，12000r/min離心5min ；取上清，取上清到一新管中 加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH 5. 2)，_20°C放置20_60min，12000" min離心15-30min ；棄上清液，倒置使管壁液體流盡，70%無水乙醇洗沉淀，室溫放置干燥 10-30min，溶于50 μ L雙蒸水中，_20°C保存?zhèn)溆?。特異性引物對人工合成正向引物序列SEQ ID NO :1和反向引物序列SEQ ID NO 2。采集健康家兔血1ml，用全血基因組DNA提取試劑盒提取家兔基因組DNA，作為PCR 反應(yīng)陰性對照樣本，具體操作可參考所購相關(guān)試劑盒說明書。以上述DNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增PCR 25 μ L 反應(yīng)體系10 XPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/LdNTP 1 μ L,25mmol/L Mg2+I μ L, Taq DNA聚合酶1. 5U，10mmol/l引物各lyL，模板(基因組DNA) 1 μ L，不足部分 用雙蒸水補足。反應(yīng)條件預(yù)變性940C 5min ；變性 94°C 30s，退火 60°C 30s,延伸 72°C IOOs, 35 個 循環(huán)；72°C延伸IOmin。取擴增產(chǎn)物各5ul，瓊脂糖電泳，在凝膠成像分析儀上觀察，結(jié)果表明5個臨床 樣有1個擴增產(chǎn)物為單一 DNA片段，大小為1030bp，判定為絮狀表皮癬菌，4個毛樣的擴增 條帶數(shù)為0，判定為非絮狀表皮癬菌。將5個毛樣接種PDA平板，28°C培養(yǎng)2-7天，挑取菌絲 體，通過形態(tài)學、生物學驗證，結(jié)果表明陽性條帶的毛樣分離到絮狀表皮癬菌，其他為須癬 毛癬菌，結(jié)果同PCR結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供了一種快速鑒定家兔絮狀表皮癬菌的分子生物學方法，其特征是A.用于鑒定絮狀表皮癬菌的寡核苷酸引物對，即正向引物序列SEQID NO 1(5'-GCCC GAGACAGCCGACCAGTACCTTAT-3，)和反向引物序列 SEQ ID NO :2 (5，-CTGGAAACTTGTGATTGCGA GCGGTTTG-3’ )及其反向序列；B.用于鑒定絮狀表皮癬菌的長度為1030bp的核苷酸序列及其反向序列；C.一種鑒定絮狀表皮癬菌的方法，包括以下步驟(1)提取待測菌或家兔皮膚毛樣DNA；(2)以(I)DNA為模板，使用SEQID NO 1和SEQ ID NO 2引物進行PCR擴增；(3)通過目測PCR產(chǎn)物凝膠電泳后顯色結(jié)果，來鑒定絮狀表皮癬菌擴增條帶為大小1030bp單一條帶，判定為絮狀表皮癬菌；須癬毛癬菌、石膏小孢子菌、 犬小孢子菌和兔基因組DNA、空白對照無擴增片段。
全文摘要
絮狀表皮癬菌是家兔最為常見的皮膚癬菌病致病菌之一，本發(fā)明公開了用于鑒定絮狀表皮癬菌特異性引物序列，通過利用這對引物序列，通過PCR擴增，可特異性鑒定出絮狀表皮癬菌，速度快，可靠性高，為家兔皮膚癬菌病診斷和兔場癬菌病凈化奠定理論基礎(chǔ)，并提供技術(shù)性指導。
文檔編號C12Q1/04GK102127590SQ201010284689
公開日2011年7月20日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者廖黨金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李紅, 林毅, 謝晶, 趙素君 申請人:廖黨金, 文豪, 曹冶, 李江凌, 李紅, 林毅, 謝晶, 趙素君