專利名稱：一種針對液相非純化復合靶標的電泳凝膠阻滯-selex技術方法
一種針對液相非純化復合靶標的電泳凝膠阻滯-SELEX技
術方法發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種針對液相非純化靶標的電泳凝膠阻滯-SELEX技術方法的建立和應用，具體是將非純化的靶標與文庫在液相中孵育，利用凝膠阻滯(EMSA)的原理，通過消減篩選，獲得針對篩選樣品與消減樣品中差異成分的寡核苷酸適配子，用于靶標的檢測與功能抑制等，例如特定疾病包括腫瘤的檢測、輔助診斷、治療等。獲得的寡核苷酸配基還可用于鑒定疾病狀態(tài)相關的分子標志物，如腫瘤標志物。
背景技術：
指數富集的配基系統(tǒng)進化技術，簡稱SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術，是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫篩選技術。其原理是利用單鏈隨機寡核苷酸(包括單鏈DNA和RNA)三維結構靈活易變并易與各種靶標分子結合，形成具有很強結合力復合物的特點，將人工構建合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留特異結合的寡核苷酸并經PCR擴增、富集、然后制備成富集的單鏈文庫再與靶分子重新相互作用，如此經反復數個循環(huán)，即可篩選獲得與該靶子特異結合的寡核苷酸配基(aptamer) (Tuerk C，et al. Science 1990 ；249 :505_510)。aptamer 具有精確識別、親和力高、易體外合成與修飾等特性，因此在抗體涉及的領域幾乎均可用 aptamer代替，在分析化學、基因調控、蛋白質組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應用前景(邵寧生等，生物化學與生物物理進展2006 ；33 :329-335)。從最初的單一靶標的篩選到后來的從混合體系中篩選某一類已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，SELEX顯示出了其獨特的應用價值。尤其是近年來興起的復合靶子的SELEX技術，使得人們在能夠在不知道靶分子的性質的情況下而對其進行識別成為可能。這種可以不需要完全研究了解靶物質的完整結構，就可以篩選任何狀態(tài)下的靶物質，甚至可以通過篩選獲得的配基來研究復合靶標的分子標志，為生物標志物的鑒定提供了新的思路。隨著SELEX技術方法和研究進展的突飛猛進，涌現出了多種改良SELEX技術。我們實驗室一直致力于改良SELEX方法的建立與應用方面的研究，在建立以完整細胞為靶子的消減SELEX基礎上(Wang C，et al. J Biotechnol ；2003 102 :15_22)，繼續(xù)建立了組織切片SELEX技術(Li S et al. J Pathol ；2009, 218 :327_36)。這些方法的建立為生物標志物的發(fā)現、鑒定以及疾病的診斷、靶向治療提供了基礎。但對于多數疾病，早期、敏感的血清學診斷方法是臨床迫切需求的，要發(fā)展血清學生物標志物及分子探針的研究，除了利用蛋白質組學的技術方法，針對液相標本的消減SELEX技術方法將提供有效的技術補充。因此，本實驗將以大腸桿菌誘導表達的含目的蛋白及多種大 桿菌蛋白的超聲上清為靶標模型，利用凝膠阻滯(EMSA)原理分離結合和游離的單鏈寡核苷酸，建立一種新的液相非純化靶標的消減SELEX技術方法，即EMSA-SELEX技術方法。本技術方法是利用凝膠阻滯的方法，將液相標本與單鏈核酸文庫孵育，通過將孵育后的復合物經過天然聚丙烯酰胺凝膠電泳達到分離結合核酸與游離核酸的目的，通過消減靶標的陰性篩選，最終獲得與目的靶子結合的適配子。該發(fā)明所述方法可以在醫(yī)學領域得到廣泛應用，包括篩選獲得特定疾病的體液標本或血液標本的分子識別探針一 aptamer,以及利用aptamer釣取相應的分子標志物，獲得的疾病特異aptamer還可以用于靶標分子的檢測，以及作為靶標分子或靶標分子特定結構域的功能抑制劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的 在于建立一種基于凝膠阻滯的分離技術，以液相的復合靶子標本為靶的消減SELEX方法，并提出該技術方法在臨床疾病輔助診斷和鑒定疾病相關分子標志物等方面的應用。本發(fā)明通過以下技術方案建立首先建立篩選靶與消減靶的模型，以某一融合蛋白的基因工程大腸桿菌誘導表達后超聲上清為篩選靶，以標簽蛋白的基因工程大腸桿菌誘導后超聲上清未消減靶；人工合成的單鏈DNA寡核苷酸文庫；利用凝膠阻滯的原理，對樣品進行消減SELEX篩選；經過數十輪篩選，篩選靶標與消減靶標之間的差異成分的寡核苷酸適配子得到富集，對富集的寡核苷酸文庫進行鑒定；對富集的文庫進行隨機測序；挑取數條序列，經化學合成，然后鑒定與靶標結合的特異性，獲得單個的特異適配子；對于差異成分未知的樣品，通過特異寡核苷酸適配子親和釣取其結合的靶分子，聯合生物質譜鑒定，即可鑒定樣品中的差異成分，為生物標志物的鑒定提供新的思路。本發(fā)明優(yōu)點1)本發(fā)明以液相的復合靶子為靶進行消減SELEX篩選，適合篩選難以純化的靶標、要求靶標保持空間構像的樣品、以及未知靶標的液相標本的篩選，如血液、唾液、尿液等臨床標本的篩選。2)通過凝膠阻滯分離，可以將結合的寡核苷酸與游離的寡核苷酸有效分離，縮短了篩選輪次。3)通過引進消減篩選，可以獲得針對兩類不同來源標本中未知的差異成分的特異適配子，也可以獲得針對靶標分子異構體或特定結構域的適配子。4)利用獲得的特異寡核苷酸適配子，可以親和釣取鑒定未知的靶分子，為生物標志物的鑒定提供了新的思路。也可以利用獲得的特異寡核苷酸適配子檢測靶分子，或阻斷靶標的生物功能。因此，本發(fā)明所建立的方法在基礎研究、臨床醫(yī)學領域具有廣泛的應用價值。


圖1 本發(fā)明所用的篩選靶標與消減靶標的10% SDS-PAGE分析。其中，1、含消減靶標的未純化大腸桿菌表達后超聲上清；2、含篩選靶標的未純化大腸桿菌表達后超聲上清； 3、低分子量蛋白標準；圖2 篩選后文庫的鑒定。其中，a.文庫與未純化靶標及消減靶標的結合；b.第10 輪富集文庫與純化后消減靶蛋白及不同量的靶蛋白的結合。
具體實施例方式下面通過以大腸桿菌表達的含目的融合蛋白的未純化超聲上清為靶標，以含標簽蛋白的未純化超聲上清為消減靶標，進行消減SELEX篩選，以及對獲得的富集文庫的鑒定來進一步描述本發(fā)明。1.合成隨機單鏈DNA寡核苷酸文庫和相應的引物GP35 文庫5，-GCAATGGTACGGTACTTCC (35N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3‘引物正義引物(Plong-I):5，-GCAATGGTACGGTACTTCC-3，反義引物(Pll):5，-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3反義引物(Pstem-Ioop)5’ -GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’ 注N 代表A、Τ、G、C任意一種。Plong-I與Pll用于擴增雙鏈產物，Plong-I與Pstem-loop用于擴增單鏈產物。上述單鏈DNA(ssDNA)均由上海生工公司合成。2.利用大腸桿菌表達靶分子蛋白2. 1利用基因重組的方法，構建含目的蛋白——葡糖基轉移酶 (Glucosyltransferase，GTF)催化區(qū)(Catalytic，CAT)基因的原核表達質粒，5，端融合 NusA標簽蛋白基因以促進蛋白可溶性表達。同樣的方法構建僅表達NusA標簽蛋白的原核表達質粒。2. 2重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，常規(guī)IPTG誘導表達，收集表達菌體， 超聲破碎，離心后分別獲得含有目的蛋白NusA-CAT及NusA對照蛋白可溶性表達超聲上清； 該部分未純化上清作為篩選靶標及消減靶標。2. 3利用載體上含有的重組蛋白C端的His標簽對誘導表達后的超聲上清進行純化，獲得純化的rNusA-CAT蛋白和NusA蛋白便于篩選后適配子的鑒定。3.基于EMSA分離的消減SELEX篩選3. 1將一定濃度的ssDNA文庫溶解于合適體積的三蒸水中，于100°C變性5min后立即置于冰上充分冷卻(第1輪篩選ssDNA文庫的用量為1，500pmol,以后每輪篩選的投入量遞減)；3. 2將ssDNA文庫與NusA蛋白的未純化上清在37°C共孵育2h，使ssDNA文庫與消減靶充分作用；3. 3ssDNA文庫與蛋白的共同孵育體系加入IOX上樣緩沖液，6%天然PAGE分離；3. 4卸膠，核酸染色后置于紫外燈下觀察。對照GP35的原庫的位置，將這一位置的膠回收，經凝膠洗脫緩沖液洗脫6h以上后，乙醇沉淀回收。4.基于EMSA分離的陽性篩選4. 1將消減文庫用篩選緩沖液溶解，于100°C變性5min后立即置于冰上充分冷卻； 4. 2文庫與含rNusA-CAT蛋白的誘導表達菌體超聲上清在37°C共孵育2h (隨著篩選輪數的增加可適當減少孵育時間，以增加篩選配基的親和力和特異性)，使消減文庫與篩選靶充分作用；4. 3將孵育體系進行6 %的天然PAGE分離；
4. 4卸膠，核酸染色，置于紫外燈下觀察。對照GP35的原庫的位置，將高于這一位置以上的膠切膠(由于ssDNA與蛋白相結合后泳動速度變慢，所以高于GP35的位置)，經凝膠洗脫緩沖液洗脫他以上后，乙醇沉淀回收。5.結合文庫的擴增5. 1將乙醇沉淀回收到ssDNA用適量的水溶解后，加入PCR反應體系直接擴增；5. 2PCR 反應條件95°C 預變性 5min ；94°C 變性 lmin，37 °C 退火 80sec，58 °C 延伸 lmin，擴增3個循環(huán)；最后58°C終延伸5min。5. 3再次PCR確定最終擴增循環(huán)數取IOul上述PCR產物為模板，再次PCR擴增， 從12個循環(huán)開始，每3個循環(huán)取樣，8% 7M尿素膠分析。選擇目標條帶PCR產量大、無雜帶的循環(huán)數為合適循環(huán)數，將剩余90ul PCR產物全部擴增。5. 4將全部擴增的PCR產物通過8% 7M尿素膠回收，凝膠洗脫緩沖液洗脫后再乙醇沉淀回收，核酸定量儀確定ssDNA的量，用于下一輪的篩選。6.重復η輪篩選(步驟3-5)7.放射性同位素檢測文庫的富集情況7. 1利用Τ4多核苷酸激酶的末端轉移反應將富集文庫標記放射性同位素，按試劑盒說明書操作。7. 2將標記好的ssDNA文庫置于沸水中煮2_;3min，然后冰水浴IOmin備用；7. 3文庫與篩選靶標及消減靶標共同孵育，同前進行凝膠阻滯實驗，將膠進行磷屏顯影。7. 4富集程度最好的文庫與不同濃度的純化蛋白進行EMSA結合實驗。實驗結果通過建立的基于EMSA分離的消減SELEX篩選，獲得了特異識別融合蛋白中CAT結構域的富集文庫。因此，該方法能夠從兩組液相標本中篩選針對差異成分的寡核苷酸適配子。利用富集的文庫還可以對差異成分進行釣取鑒定。由圖2可以得到結論篩選靶標與消減靶標的差異成分在于前者為重組的融合蛋白，后者為標簽蛋白，兩者其余的菌體蛋白成分大致相同。由圖3可以得到結論經過篩選后，第5輪文庫、第10輪文庫均有富集，第10輪文庫富集程度最高。且第10輪富集文庫與不同濃度的融合蛋白呈現劑量相關的結合，與標簽蛋白無結合，說明富集文庫僅結合篩選靶標中差異的CAT結構域。
權利要求
1.一種針對液相非純化復合靶標的電泳凝膠阻滯-SELEX技術方法，其特征是利用電泳凝膠阻滯與SELEX技術結合的原理，針對液相未純化差異靶標進行消減篩選，獲得特異識別差異靶標的特異寡核苷酸適配子。
2.根據權利要求1中所述方法，篩選的靶標可以是大腸桿菌誘導表達后超聲上清。
3.根據權利要求1中所述方法，篩選的靶標可以是細胞培養(yǎng)上清或提取的細胞組份。
4.根據權利要求1中所述方法，篩選的靶標可以是血清樣品、體液樣品、組織提取成分寸。
5.根據權利要求1中所述方法，SELEX篩選采用的可以是單鏈DNA文庫，也可以是RNA 文庫或修飾后的DNA或RNA文庫。
6.權利要求1中所述方法在生物醫(yī)藥領域中的應用，包括靶標分子的釣取、檢測、純化和功能抑制劑的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對液相非純化復合靶標的電泳凝膠阻滯-SELEX技術方法的建立和應用。具體是將非純化的靶標與單鏈寡核苷酸文庫在液相中孵育，利用電泳凝膠阻滯的原理，通過消減篩選，獲得針對篩選樣品與消減樣品中差異成分的特異寡核苷酸適配子，用作靶標的檢測與功能抑制等。獲得的寡核苷酸適配子還可用于鑒定和發(fā)現疾病相關的分子標志物。
文檔編號C12N15/10GK102382813SQ20101026626
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權日2010年8月30日
發(fā)明者丁紅梅, 劉農樂, 夏偉, 李少華, 李慧, 李潔, 王芳, 趙強, 邵寧生 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所