專利名稱：44個snp位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)個體識別，特別涉及SNP位點(diǎn)的基因分型，尤其是一種用于法 醫(yī)學(xué)個體識別的44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
法醫(yī)檢案工作中，由于高溫、潮濕、暴曬、微生物等因素的影響，生物性檢材中的 DNA分子經(jīng)常被損壞，發(fā)生斷裂，分子變小，大片段丟失，無法進(jìn)行有效的STR分型，使案件 偵破限于困境。目前，法醫(yī)DNA分析中解決高度降解檢材DNA樣本分型的技術(shù)主要集中在 兩個方面一種是miniSTR(小片段短串聯(lián)重復(fù))分析技術(shù)。這種技術(shù)是通過將STR(短 串聯(lián)重復(fù))遺傳標(biāo)記的擴(kuò)增引物設(shè)計的盡可能接近重復(fù)區(qū)域而縮短PCR產(chǎn)物片段長度， 應(yīng)用于高度降解檢材和微量檢材中可以提高DNA分型的成功率。但在分析高度降解檢材 方面，miniSTR基因座分析的DNA片段范圍在80 150bp，對于< IOObp的高度降解DNA， miniSTR基因座分析技術(shù)仍然具有局限性。而且，由于擴(kuò)增片段長度和熒光染料種類的限 制，在一個復(fù)合擴(kuò)增體系中只可以同時擴(kuò)增較少的miniSTR基因座，一般為一種熒光物質(zhì) 標(biāo)記一個基因座，一個擴(kuò)增體系最多可同時復(fù)合4個miniSTR基因座，要想達(dá)到個體識別效 能，就必須增加復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的數(shù)量，至少需要3 4個復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，因此，不適合微量檢 材的應(yīng)用。另一種是SNPs分析技術(shù)，SNPs (單核苷酸多態(tài)性)是繼限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragmeng length polymorphism, RELP)禾口短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STRs)之后被發(fā)現(xiàn)的又一種人類遺傳性標(biāo)記，被稱為第三代遺傳標(biāo)記，指人類基因 組中特定部位的單個堿基序列的變異，其在人類基因組中分布極為廣泛，大約每1000個堿 基中就存在一個SNP，估計在人類基因組中大約有數(shù)百萬個SNPs，數(shù)量超出STR基因座數(shù)目 的幾個數(shù)量級，而且，SNPs具有突變率低，擴(kuò)增片段短，適合高通量檢測和易于分型等特點(diǎn)， 因此在法醫(yī)學(xué)個體識別應(yīng)用中具有廣闊前景。選用可靠的多重分型方法，許多SNPs位點(diǎn)可 以在短至45 55bp (變異位點(diǎn)兩側(cè)引物序列長度)的擴(kuò)增片段內(nèi)分型，因此，當(dāng)DNA樣本 嚴(yán)重降解或遇到檢材微量時，SNPs分析將更有價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于個體識別的44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù) 合檢測的方法及試劑盒，使待測靶DNA的片段范圍縮短至69 125bp，提高對高度降解DNA 分型的成功率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是用于個體識別的44個SNP位 點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的試劑盒，其包括a)擴(kuò)增體系PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs, PCR 引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑核酸外切酶I (Exo I)及其緩 沖溶液(Exo I Buffer)、蝦堿性磷酸酶(SAP)及其緩沖溶液(SAP Buffer), c)延伸反 應(yīng)試劑延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液，d)測試試劑=Hi-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ，所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點(diǎn)的引物組成，所述44個SNP基因位點(diǎn)在NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫的rs號分別為rs 1109037，rs3780962, rs987640,rs9951171,rs430046,rs338882,rs2342747,rsl0092491,rsl821380,rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791, rs740598, rs2272998, rs7205345, rsl0773760, rs221956,rs576261,rsl498553,rs2399332, rsl058083,rs993934,rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。上述SNP基因位點(diǎn)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選取(1)具有高的雜合度(彡0. 4)；⑵等 位基因頻率在全球各大人群之間差異小(Fst < 0. 06) ； (3)系統(tǒng)內(nèi)SNPs之間要處于連鎖平 衡狀態(tài)，位點(diǎn)之間的物理距離至少大于1Mb ;(4)系統(tǒng)內(nèi)的SNP數(shù)目要足夠多以達(dá)到個體識 別效能；所有SNP位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)在公開刊物上發(fā)表。其相關(guān)信息見表1。表ISNP基因位點(diǎn)相關(guān)信息
4 所述44個SNP基因位點(diǎn)的PCR引物和延伸引物的序列參見表2。根據(jù)NCBI的SNP 數(shù)據(jù)庫(dbSNP)提供的DNA序列，設(shè)計44個SNP位點(diǎn)的PCR引物，PCR引物長度20 29個 堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物長度69 125bp，退火溫度60士5°C，GC含量40 60%。又設(shè)計了延伸 引物，延伸引物的3’末端位于多態(tài)性位點(diǎn)的上游1個堿基處，延伸引物與模板DNA互補(bǔ)部 分的特異性引物長度18 30個堿基，退火溫度50士2°C。同一反應(yīng)管中，被檢測突變相同 的位點(diǎn)的引物長度相差3 6個堿基，為了改變引物的長度，區(qū)分不同的位點(diǎn)，在特異性引 物的 5，端加 poly(dT)或 poly(dCT)。表2 44個SNP基因位點(diǎn)的PCR引物和延伸引物的序列表 利用上述的試劑盒進(jìn)行個體識別的測試方法，按照下列步驟進(jìn)行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在擴(kuò)增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增 條件為95°C、5min預(yù)變性；然后依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，進(jìn)行35個循環(huán)；再 在65°C保持7min ；最終在4°C保存，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)應(yīng)用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化反應(yīng)條件37°C、lh，然 后8(TC、15min，最終在4°C保存，得純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物；d)對純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至所述的延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；所述的延伸反應(yīng) 的條件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s進(jìn)行25個循環(huán)，最終保存在4°C，得延伸產(chǎn)物；e)應(yīng)用蝦堿性磷酸酶純化延伸產(chǎn)物將延伸產(chǎn)物加入至蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液的混合液中，在下列條件下進(jìn)行純 化反應(yīng)371、111，651、151^11，最終保存在41，得純化后的延伸產(chǎn)物；f)檢測、確定產(chǎn)物，將步驟e)中得到的純化后的延伸產(chǎn)物中加入至所述的測試試劑中，混勻；然后 95°C變性3min，4°C迅速冷卻后進(jìn)行電泳檢測；最后根據(jù)延伸產(chǎn)物峰的位置和顏色確定44 個SNP基因位點(diǎn)的基因型。采用本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果在于采用本發(fā)明可以快速、準(zhǔn)確地獲得44個SNP位 點(diǎn)的基因分型，并通過熒光自動分型設(shè)備檢測分析，對人類生物檢材進(jìn)行個體識別。本發(fā)明 在對高度降解檢材DNA的法醫(yī)學(xué)個體識別方面具有很大的優(yōu)勢和潛力。


圖1和圖2分別是本發(fā)明的檢測結(jié)果的附圖。
具體實(shí)施例方式
用于個體識別的44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的試劑盒，其包括a)擴(kuò)增體系PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑 核酸外切酶I及其緩沖溶液、蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液，c)延伸反應(yīng)試劑延伸引物和 SNaPshot 反應(yīng)混合液，d)測試試劑Hi_Di 甲酰胺和 GeneScan Size Standards_120LIZ， 所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點(diǎn)的引物組成，所述44個SNP基因位點(diǎn)在 NCBI 中 SNP 數(shù)據(jù)庫的 rs 號分別為 rsl 109037, rs3780962, rs987640, rs9951171, rs430046, rs338882, rs2342747, rsl0092491, rsl821380, rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791,rs740598,rs2272998,rs7205345,rsl0773760,rs221956,rs576261,rsl498553, rs2399332, rsl058083, rs993934, rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。所述PCR引物和延伸引物的序列表、濃度分別參見表2和表3。所述延伸引物由延伸引物混合物I (26個位點(diǎn))和延伸引物混合物II (18個位點(diǎn)) 由不同長度的延伸引物組成，分別針對44個SNP位點(diǎn)的多態(tài)性位點(diǎn)。表3PCR引物和延伸引物的濃度 利用上述的試劑盒進(jìn)行個體識別的測試方法，按照下列步驟進(jìn)行a)提取DNA，得DNA提取液；b)多重PCR擴(kuò)增包含44個SNP位點(diǎn)的DNA片段
在擴(kuò)增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。所述PCR 擴(kuò)增體系的總體積為25 y L，擴(kuò)增體系的組分、濃度或含量如下
10XPCR緩沖溶液 Mg2+ (25mM) dNTPs(lOmM)
PCR引物(濃度參見表3) Taq DNA 聚合酶(5U/ u L) 模板 DNA(1 lOng/iiL) 去離子水
擴(kuò)增的熱循環(huán)參數(shù)
2. 5u L 5. 5 u L 2u L
1 u L 0. 3u L 1 u L 12. 7u L
35循環(huán)
95°C 95 °C 60 °C 65 °C 65°C
4°C
得擴(kuò)增產(chǎn)物；
c)應(yīng)用核酸外切酶I (Exo I)和蝦堿性磷酸酶(SAP)純化步驟b)所得的擴(kuò)增產(chǎn)
5min
30s
30s
30s
7min
保存
物，純化反應(yīng)體系和純化反應(yīng)條件如下擴(kuò)增產(chǎn)物的純化反應(yīng)體系，體積10 ii L 10 X Exo I Buffer1 u L10 X SAP Buffer1 u LExo I (5U/ u L)2u LSAP(lU/u L)2u L擴(kuò)增產(chǎn)物4 ii L擴(kuò)增產(chǎn)物純化反應(yīng)的條件37 °Clh80 °C15min4°C保存得到純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物；d)將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至所述的延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；延伸反應(yīng) 試劑和延伸反應(yīng)條件如下延伸反應(yīng)體系，反應(yīng)體積10 ii L SNaPshot 反應(yīng)混合液5 ii L純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物3iiL延伸引物(3. 3 13. 3 iiM，具體參見表3) luL去離子水1 ii L
13
延伸反應(yīng)的熱循環(huán)參數(shù)
96°C10s ,
50°C5s I 25 循環(huán)
60 °C30s ‘
4°C保存得延伸產(chǎn)物；e)應(yīng)用蝦堿性磷酸酶純化延伸產(chǎn)物延伸產(chǎn)物純化反應(yīng)體系，反應(yīng)體積10 ii L 10 X SAP Buffer1 u LSAP (5U/ u L)2u L去離子水5 ii L延伸產(chǎn)物2u L延伸產(chǎn)物純化反應(yīng)條件37 °Clh65 °C15min4°C保存得純化后的延伸產(chǎn)物；f)檢測、確定產(chǎn)物，將步驟e)中得到的純化后的延伸產(chǎn)物中加入11. 5ii L Hi_Di甲酰胺和0. 5 y L GeneScan Size Standards-120 LIZ 混勻；然后 95°C變性 3min，4°C迅速冷卻后，用美國 AB 公司的DNA自動分析儀進(jìn)行電泳檢測，檢測條件1500V電壓，36cm毛細(xì)管，P0P4凝膠，電泳 20min;應(yīng)用Data Collection 3. 0軟件收集數(shù)據(jù)，GenemapperV 3. 2軟件進(jìn)行結(jié)果分析。其 中一實(shí)施例的結(jié)果圖見附圖1和圖2。
1權(quán)利要求
44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的試劑盒，其包括a)擴(kuò)增體系PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑核酸外切酶Ⅰ及其緩沖溶液、蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液，c)延伸反應(yīng)試劑延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液，d)測試試劑Hi Di甲酰胺和GeneScanTM Size Standards 120LIZ，其特征在于，所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點(diǎn)的引物組成，所述44個SNP基因位點(diǎn)在NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫的rs號分別為rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的試劑盒，其特征在于所述 44個SNP基因位點(diǎn)的PCR引物和延伸引物的序列參見表2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的44個SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測的試劑盒，其特征在于 同時復(fù)合擴(kuò)增包含44個SNPs位點(diǎn)的DNA片段。
4.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行個體識別的測試方法，其特征在于按照下列步驟 進(jìn)行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在擴(kuò)增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件 為95°C、5min預(yù)變性；然后依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，進(jìn)行35個循環(huán)；再在 65°C保持7min ；最終在4°C保存，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；c)應(yīng)用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化反應(yīng)條件37°C、lh，然后 80°C、15min,最終在4°C保存，得純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物；d)對純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至所述的延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；所述的延伸反應(yīng)的 條件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s進(jìn)行25個循環(huán)，最終保存在4°C，得延伸產(chǎn)物；e)應(yīng)用蝦堿性磷酸酶純化延伸產(chǎn)物將延伸產(chǎn)物加入至蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液的混合液中，在下列條件下進(jìn)行純化反 應(yīng)371、111，651、151^11，最終保存在41，得純化后的延伸產(chǎn)物；f)檢測、確定產(chǎn)物，將步驟e)中得到的純化后的延伸產(chǎn)物中加入至所述的測試試劑中，混勻；然后95°C變 性3min，4°C迅速冷卻后進(jìn)行電泳檢測；最后根據(jù)延伸產(chǎn)物峰的位置和顏色確定44個SNP 基因位點(diǎn)的基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于個體識別的44個SNPs位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測試劑盒和檢測方法，所述試劑盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR緩沖液，核酸外切酶Ⅰ，蝦堿性磷酸酶，延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液；PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點(diǎn)的引物，分別針對包含44個SNP位點(diǎn)的DNA片段。采用本發(fā)明可以快速、準(zhǔn)確地獲得44個SNP位點(diǎn)的基因分型，并通過熒光自動分型設(shè)備檢測分析，對人類生物檢材進(jìn)行個體識別。
文檔編號C12Q1/68GK101921860SQ201010265870
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者叢斌, 婁春光, 李淑瑾 申請人:河北醫(yī)科大學(xué)