專利名稱：生物轉(zhuǎn)化液中分離純化2＇-脫氧腺苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從生物轉(zhuǎn)化液中分離純化2'-脫氧腺苷 的方法
背景技術(shù)：
2'-脫氧腺苷是脫氧核糖核酸DNA的結(jié)構(gòu)片段，是基因藥物和基因工程研究的 重要原材料，具有很好的生理活性，雖未有報(bào)道其可直接用于抗病毒，但是可作為一種重要 的原料，經(jīng)過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)改造得到的2 ‘-脫氧腺苷類似物具有良好的抗腫瘤活性，因此在市 場(chǎng)上有廣泛需求。2'-脫氧腺苷可通過(guò)脫氧核糖核酸的降解而得到，但是由于降解后產(chǎn) 物分離困難等原因，使得該方法并不實(shí)用。脫氧腺苷也可通過(guò)化學(xué)合成法合成，但其步驟過(guò) 于復(fù)雜，比如一些基團(tuán)的保護(hù)與去保護(hù)以及糖基的活化等。圖1是一種化學(xué)合成方法，以 3飛二苯甲酰基腺苷為原料和N，N-二甲基苯甲酰胺及碳酰氯反應(yīng)，再與硫化氫及吡啶反 應(yīng)，然后經(jīng)三正丁基錫化氫脫氧，最后經(jīng)甲醇氨脫保護(hù)得到脫氧腺苷。上述化學(xué)法生產(chǎn)2 ‘-脫氧腺苷有以下缺點(diǎn)1、其原料1-氯-3，5_ 二對(duì)硝基 苯-2-脫氧核糖不易得到，需要自己生產(chǎn)；2、產(chǎn)率較低(約26%)，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；3、 是使用汞鹽，不利于環(huán)保與工人健康；4、得到的產(chǎn)物為α，β混合物，后期純化困難，產(chǎn)品 純度低。通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法合成2'-脫氧腺苷的方法(見(jiàn)圖2所示)，具有步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng) 時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，避免了以上不足。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的研究較多，但對(duì)提取 純化工藝的研究卻相對(duì)較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離純化2 ‘-脫氧腺苷的方法。本發(fā)明提供的分離純化2'-脫氧腺苷的方法，包括如下步驟1)生物轉(zhuǎn)化液預(yù)處理將生物轉(zhuǎn)化液離心，取上清液，置于0_25°C冰箱中保存，得到預(yù)處理完畢的所述生 物轉(zhuǎn)化液；2)樣品吸附及2'-脫氧腺苷的解析將pH值調(diào)節(jié)至5-8的所述預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液上樣于所述層析柱中，依次用 碳酸鈉水溶液和乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集用所述乙醇水溶液洗脫得到的洗脫液；所述層析柱中的介質(zhì)為離子交換樹(shù)脂或大孔吸附樹(shù)脂；3)結(jié)晶將所述步驟2)得到的洗脫液中加入無(wú)水乙醇，于0-25°C結(jié)晶后得到2' _脫氧腺 苷晶體粗品，將所述2' _脫氧腺苷晶體粗品用乙醇水溶液進(jìn)行重結(jié)晶，得到所述2'-脫 氧腺苷。上述方法的步驟1)中，所述生物轉(zhuǎn)化液是按照如下方法所得以2'-脫氧胸苷為核糖基供體，腺嘌呤為堿基供體，通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的核糖磷酸化酶進(jìn)行生物 轉(zhuǎn)化，得到所述生物轉(zhuǎn)化液。制備所述生物轉(zhuǎn)化液步驟中，所述微生物為瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)，所述瑞士乳桿菌的保藏編號(hào)CGMCC 1. 1877(中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)；所述離心步驟中，溫度為0-25°C，優(yōu)選4°C， 時(shí)間為10-60分鐘，優(yōu)選20分鐘，轉(zhuǎn)速為3000-8000rpm，具體可為3500rpm、5000rpm或 3500-5000rpm,優(yōu)選 4000rpm,離心半徑為 150_400mm，優(yōu)選 200mm。所述步驟2)中，所述離子交換樹(shù)脂優(yōu)選為陰離子型樹(shù)脂。各種常用的由公開(kāi)商 業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)所得陰離子交換樹(shù)脂均適用，如717型陰離子型樹(shù)脂、D201型陰離子型樹(shù)脂或 D290型陰離子型樹(shù)脂，優(yōu)選717型陰離子型樹(shù)脂；各種常用的由公開(kāi)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)所得大 孔吸附樹(shù)脂均適用，如DlOl型大孔吸附樹(shù)脂、DM18型大孔吸附樹(shù)脂、HPD722型大孔吸附樹(shù) 脂或AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，優(yōu)選DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。所述層析柱中的介質(zhì)在使用前進(jìn) 行如下預(yù)處理將所述層析柱中的介質(zhì)先用乙醇水溶液浸泡后，用去離 子水洗滌后用氫氧 化鈉水溶液浸泡，再用去離子水洗滌至中性后用鹽酸水溶液浸泡，最后用去離子水洗滌至 中性；所述乙醇水溶液的體積百分濃度為75-99.9%，優(yōu)選95%，所述氫氧化鈉水溶液的濃 度為0. 5-2. Omo 1/L,優(yōu)選lmol/L，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 5-2. Omo 1/L,優(yōu)選lmol/L。所 述用乙醇水溶液浸泡步驟中，時(shí)間為12-36小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)；所述用氫氧化鈉水溶液浸泡 步驟中，時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)；所述用鹽酸水溶液浸泡步驟中，時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu) 選4小時(shí)。所述步驟2)洗脫步驟中，所述碳酸鈉水溶液的濃度為0. 05M-0. 2M，具體為 0. 1-0. 15M，優(yōu)選0. 1M，所述乙醇水溶液的體積百分濃度為30-75%，具體為45-55 %，優(yōu)選 45%。所述用碳酸鈉水溶液進(jìn)行洗脫步驟中，所述碳酸鈉水溶液的用量為所述分離純化 2 ‘-脫氧腺苷用層析柱的柱體積的2-10倍，具體為2-6倍、2倍或6倍，優(yōu)選4倍，洗脫 次數(shù)為1次；所述用乙醇水溶液進(jìn)行洗脫步驟中，所述乙醇水溶液的用量為所述分離純化 2'-脫氧腺苷用層析柱的柱體積的1-5倍，具體為3-4倍，優(yōu)選3倍，洗脫次數(shù)為1次。該 步驟中，用碳酸鈉水溶液洗脫的目的是去除層析柱中蛋白等雜質(zhì)。洗脫速率為洗脫液由層 析柱頂端依靠重力自然流出的速率，不需額外人為設(shè)定洗脫速率。所述步驟3)所述加入無(wú)水乙醇步驟中，無(wú)水乙醇的用量為所述步驟2)得到的洗 脫液體積的0. 2-2倍，優(yōu)選0. 5倍；所述2'-脫氧腺苷晶體粗品用乙醇水溶液進(jìn)行重結(jié) 晶步驟中，所述乙醇水溶液的體積百分濃度為10-50%，具體為20%、30%或20-30%，優(yōu)選 45%，所述乙醇水溶液的用量為所述2'-脫氧腺苷粗品體積的0. 2-2倍，具體為0. 4倍、2 倍或0. 4-2倍，優(yōu)選0.4倍。上述方法的步驟1)中，所述生物轉(zhuǎn)化液具體可按照包括如下步驟的方法制備而 得將瑞士乳桿菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌體，將所述菌體破碎，制成細(xì)胞破碎 液，向所述細(xì)胞破碎液中加入2'-脫氧胸苷和腺嘌呤進(jìn)行酶促反應(yīng)，獲得所述2'-脫氧 腺苷；所述腺嘌呤的直徑小于等于10 μ m ；各種能夠發(fā)酵培養(yǎng)瑞士乳桿菌的培養(yǎng)基均適用，如可用由下列重量份的物質(zhì)組成 的培養(yǎng)基葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、玉米麩質(zhì)粉10-25、檸檬酸胺1_2、磷酸氫二鉀1_2、 硫酸鈉5-10、硫酸錳0. 02-0. 4和水1000 ；所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-42°C，攪拌轉(zhuǎn)速為 120-160轉(zhuǎn)/分鐘，pH值為6. 0-7. 5，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)；
所述瑞士乳桿菌種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比可為10% -15% ；所述瑞士乳桿菌種子液是按照如下方法獲得將瑞士乳桿菌接種到斜面培養(yǎng)基 培養(yǎng)制成斜面菌種，將所述斜面菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得種子液；各種能夠培養(yǎng) 獲得種子液的斜面培養(yǎng)基均適用，如所述斜面培養(yǎng)基可為由下列重量份的物質(zhì)組成葡 萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、檸檬酸胺1_2、磷酸氫二鉀1_2、硫酸鈉5_10、硫 酸錳0. 02-0. 4，瓊脂15-20和水1000 ；所述瑞士乳桿菌接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為 30-42 0C，pH 值為 6. 5-8. 0，培養(yǎng) 24-48 小時(shí)；對(duì)菌體進(jìn)行破碎的目的是為了釋放菌體內(nèi)的核糖磷酸化酶，所述細(xì)胞破碎液按照 如下方法制備將所述粗菌體用檸檬酸緩沖液洗滌，然后用PH值為6. 0-7. 0磷酸緩沖液懸 浮，獲得細(xì)胞懸浮液，超聲破碎所述細(xì)胞懸浮液，獲得細(xì)胞破碎液；所述檸檬酸緩沖液的PH 值為6. 0-7. 0 ；所述磷酸緩沖液的pH值為6. 0 ；所述超聲條件為功率為300-400瓦，頻率為 3-5次/10秒，時(shí)間為5-15分鐘；所述細(xì)胞懸浮液中菌體的質(zhì)量百分含量為15% -35%;所 述酶促反應(yīng)的溫度為35-50°C本發(fā)明提供的分離純化2'-脫氧腺苷的方法，是將制得的生物轉(zhuǎn)化液離心除去 菌體，得到上清液，上清液經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂柱吸附，吸附完畢后，先用Na2COyK溶液洗 脫，再用有機(jī)溶劑的混合液洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮，得2 ‘-脫氧腺苷結(jié)晶，洗脫后的樹(shù)脂 用有機(jī)溶劑沖洗后重復(fù)使用。該方法將生物轉(zhuǎn)化液中的2'-脫氧腺苷與其它雜質(zhì)分離 和提取出來(lái)，產(chǎn)品純度達(dá)99%以上；而且提高了分離和提取速度，降低了成本、減少環(huán)境污 染，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為化學(xué)法合成2'-脫氧腺苷。圖2為生物轉(zhuǎn)化法合成2'-脫氧腺苷。圖3為實(shí)施例1步驟4)所得洗脫液的HPLC譜圖。圖4為實(shí)施例1制備所得重結(jié)晶后的2’ ~脫氧腺苷的HPLC譜圖。圖5為HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度所用標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例步驟4)和5)中HPLC的檢測(cè)條件均如下所示色相=Waters 600E高 效液相色譜儀系統(tǒng)，色譜柱迪馬Platisil ODS C18 5u，250mmx4. 6mm，流動(dòng)相由甲醇和水 以體積比30 70混合而得的混合液，吸收波長(zhǎng)254nm，流速0. 9ml/min ；柱溫30°C;進(jìn)樣 量10μ 1。計(jì)算產(chǎn)品2' _脫氧腺苷純度時(shí)所用標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，回歸方程為y = 4E-08x，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9992，其中，χ代表吸光度值，單位為微伏X秒，y代表樣品含量， 單位為g/ml。實(shí)施例11)將3000毫升的生物轉(zhuǎn)化液，在4°C下離心，離心轉(zhuǎn)速為3500rpm，離心半徑為 200mm，離心15min以除去菌體，取上清液，得到預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液，將其置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?)將717型陰離子樹(shù)脂先用體積百分濃度為95%的乙醇水溶液充分浸泡24h，經(jīng)檢測(cè)無(wú)有機(jī)性物質(zhì)后用去離子水洗至無(wú)醇味，然后在lmol/L NaOH溶液中浸泡4h，去離子 水洗至中性，接著在lmol/L HCl水溶液中浸泡4h，去離子水洗至中性，得到預(yù)處理完畢的 717型陰離子型樹(shù)脂。3)將步驟2)預(yù)處理完畢的717型陰離子型樹(shù)脂12Kg填裝于內(nèi)徑10厘米、高150 厘米的玻璃層析柱內(nèi)，調(diào)節(jié)步驟1)預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液的PH值為8. 0后，將該生物轉(zhuǎn) 化液500ml加入到該層析柱內(nèi)，使其被樹(shù)脂吸附，得到分離純化2' _脫氧腺苷用層析柱。4)分別用6個(gè)柱體積的0. IM濃度的Na2CO3水溶液、3個(gè)柱體積的45 %體積分?jǐn)?shù) 的乙醇水溶液對(duì)步驟3)所得分離純化2'-脫氧腺苷用層析柱進(jìn)行洗脫各一次，收集乙醇 水溶液洗脫而得的洗脫液，該洗脫液的HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，經(jīng)計(jì)算該洗脫液中產(chǎn)品 純度為68. 7%，2'-脫氧腺苷的收率93.9%。5)由于上述步驟4)所得洗脫液中仍含有少量胸苷和堿基，減壓濃縮(真空度為 lOOPa，時(shí)間30分鐘。)洗脫液，向其中加入0. 5倍體積的無(wú)水乙醇，于冰箱中在4°C結(jié)晶，得 到2' _脫氧腺苷晶體粗品，HPLC檢測(cè)并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，該粗品的純度為88. 91%的 2'-脫氧腺苷晶體粗品，將該2'-脫氧腺苷晶體粗品用體積百分濃度為30%的乙醇水溶 液進(jìn)行重結(jié)晶，所用體積百分濃度為30%的乙醇水溶液的用量為該2'-脫氧腺苷晶體粗 品體積的2倍，得到2'-脫氧腺苷晶體，該HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，經(jīng)計(jì)算該2'-脫 氧腺苷晶體的純度為99. 1%，收率為72. 5%。該實(shí)施例中步驟1)中所用生物轉(zhuǎn)化液是按照如下方法制備而得(1)菌種斜面培養(yǎng)將瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus) CGMCC 1. 1877 (中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心)接種到斜面培養(yǎng)基，37°C、pH值6. 5，培養(yǎng)24小時(shí)制成斜面菌 種；斜面培養(yǎng)基由下列重量份的組分組成葡萄糖18份、蛋白胨18份、酵母膏8份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、硫酸鈉 9份、硫酸錳0. 02份，瓊脂20份和水1000份。(2)接種發(fā)酵將斜面菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按10% (體積百分 比)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中37°C，160轉(zhuǎn)/分鐘，pH值為6. 0，發(fā)酵36小 時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量份的組分組成葡萄糖20份、蛋白胨4份、玉米麩質(zhì)粉25份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、硫 酸鈉9份、硫酸錳0. 02份和水1000份。(3)制備生物轉(zhuǎn)化液a)發(fā)酵液在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘、離心20分鐘，收集濕菌體；b)檸檬酸緩沖液( 11值為6.5)洗滌步驟a)菌體，4°C離心10分鐘，收集濕菌體， 稱重，用磷酸緩沖液(pH值為6.0)重懸菌體，制成15% (濕菌體重量和緩沖液的體積比) 的細(xì)胞懸浮液；c)步驟b)的細(xì)胞懸浮液置于冰浴中，超聲波破碎10分鐘，超聲波功率為400瓦， 頻率為3次/10秒；
d)向步驟c)的破碎液中加入底物2'-脫氧胸苷和腺嘌呤混合后40°C反應(yīng)24小 時(shí)，得到生物轉(zhuǎn)化液；每升破碎液中加入2'-脫氧胸苷50g和腺嘌呤30g，腺嘌呤為通過(guò)氣 流粉碎后的粉末，直徑小于IOym ；HPLC檢測(cè)(色譜柱=Diamonsil C18，5um，250x4. 6mm ；流動(dòng)相由甲醇和pH值為 6. O的磷酸緩沖鹽以體積比為30 70組成的混合液，該磷酸緩沖鹽是由0. 01mol/L的 磷酸一氫鉀水溶液和0. 01mol/L的磷酸二氫鉀水溶液組成；流速0. 9ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm)可知，2'-脫氧胸苷轉(zhuǎn)化為2'-脫氧腺苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)82%，每升生物轉(zhuǎn)化液中含 有2'-脫氧腺苷42g。實(shí)施例21)將3000毫升的生物轉(zhuǎn)化液，在4°C下離心，離心轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心半徑為 200mm，離心IOmin除去菌體，得到上清液，得到預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液，將其置于4°C冰
箱中保存?zhèn)溆谩?)將DlOl型大孔吸附樹(shù)脂先用體積百分濃度為95%的乙醇水溶液充分浸泡24h， 經(jīng)檢測(cè)無(wú)有機(jī)性物質(zhì)后用去離子水洗至無(wú)醇味，然后在lmol/L NaOH水溶液中浸泡4h，去 離子水洗至中性，接著在lmol/L HCl水溶液中浸泡4h，去離子水洗至中性，得到預(yù)處理完 畢的DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。3)將步驟2)預(yù)處理完畢的DlOl型大孔吸附樹(shù)脂裝填于層析柱中，再將pH值調(diào)至 5. 0的步驟1)所得預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液裝填于該層析柱中，得到分離純化2'-脫氧 腺苷用層析柱；4)分別用2個(gè)柱體積的0. 15M濃度的Na2CO3水溶液、4個(gè)柱體積的體積百分濃度 55%的乙醇水溶液對(duì)步驟3)所得分離純化2' _脫氧腺苷用層析柱進(jìn)行洗脫各一次，收集 乙醇水溶液洗脫而得的洗脫液，該洗脫液的HPLC檢測(cè)結(jié)果與圖3無(wú)實(shí)質(zhì)性差別，此處不再 熬述，經(jīng)計(jì)算該洗脫液中產(chǎn)品2'-脫氧腺苷的純度為70. 7%，收率為92. 6%。5)由于上述步驟4)所得洗脫液中仍含有少量胸苷和堿基，減壓濃縮(真空度為 10Pa，時(shí)間30分鐘。)洗脫液，向其中加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇，于冰箱中在4°C結(jié)晶，得 到2' _脫氧腺苷晶體粗品，HPLC檢測(cè)并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，該粗品的純度為89. 87%， 將該2'-脫氧腺苷晶體粗品用體積百分濃度為20%的乙醇水溶液進(jìn)行重結(jié)晶，所用體 積百分濃度為20%的乙醇水溶液的用量為該2'-脫氧腺苷晶體粗品體積的0. 4倍，該 HPLC檢測(cè)結(jié)果與圖4無(wú)實(shí)質(zhì)性差別，此處不再熬述，經(jīng)計(jì)算該2'-脫氧腺苷晶體的純度為 99. 3%，收率為 71. 2%。該實(shí)施例中所用生物轉(zhuǎn)化液是按照如下方法制備而得(1)將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus) CGMCC 1. 1877 (中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)接種到斜面培養(yǎng)基，40°C，pH值為6. 5，培養(yǎng)24小時(shí)制成 斜面菌種；斜面培養(yǎng)基由下列重量份的組分組成葡萄糖15份、蛋白胨18份、酵母膏6份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、硫酸鈉 8份、硫酸錳0. 02份，瓊脂20份和水1000份。(2)接種發(fā)酵將斜面菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按20% (體積百分 比)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中37°C，140轉(zhuǎn)/分鐘，pH值為6. 5，發(fā)酵36小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基由下列重量份的組分組成葡萄糖15份、蛋白胨5份、玉米麩質(zhì)粉20份、檸檬酸胺2份、磷酸氫二鉀2份、硫 酸鈉9份、硫酸錳0. 02份水1000份。(3)制備生物轉(zhuǎn)化液a)發(fā)酵液在4°C、10000轉(zhuǎn)/分 鐘、離心10分鐘，收集濕菌體；b)檸檬酸緩沖液(pH值為6.0)洗滌步驟a)菌體，4°C離心10分鐘，收集濕菌體， 稱重，用磷酸緩沖液(pH值為6.0)重懸菌體，制成15% (濕菌體重量和緩沖液的體積比) 的細(xì)胞懸浮液；c)步驟b)的細(xì)胞懸浮液置于冰浴中，超聲波破碎10分鐘，超聲波功率為340瓦， 頻率為4次/10秒；d)向步驟c)的破碎液中加入底物2'-脫氧胸苷和腺嘌呤混合后50°C反應(yīng)24小 時(shí)，得到生物轉(zhuǎn)化液；每升破碎液中加入2'-脫氧胸苷50g和腺嘌呤30g，腺嘌呤為通過(guò)氣 流粉碎后的粉末，直徑小于IOym ；HPLC檢測(cè)(色譜柱=Diamonsil C18，5um，250x4. 6mm ；流動(dòng)相由甲醇和pH值為 6. 0的磷酸緩沖鹽以體積比為30 70組成的混合液，該磷酸緩沖鹽是由0. 01mol/L的 磷酸一氫鉀水溶液和0. 01mol/L的磷酸二氫鉀水溶液組成；流速0. 9ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm)2'-脫氧胸苷轉(zhuǎn)化為2' _脫氧腺苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)80 %，每升生物轉(zhuǎn)化液中含有 2'-脫氧腺苷41g。
權(quán)利要求
一種分離純化2′ 脫氧腺苷的方法，包括如下步驟1)將生物轉(zhuǎn)化液離心，取上清液，置于0 25℃冰箱中保存，得到預(yù)處理完畢的所述生物轉(zhuǎn)化液；2)將pH值調(diào)節(jié)至5 8的所述預(yù)處理完畢的生物轉(zhuǎn)化液上樣于所述層析柱中，依次用碳酸鈉水溶液和乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集用所述乙醇水溶液洗脫得到的洗脫液；所述層析柱中的介質(zhì)為離子交換樹(shù)脂或大孔吸附樹(shù)脂；3)將所述步驟2)得到的洗脫液中加入無(wú)水乙醇，于0 25℃結(jié)晶后得到2′ 脫氧腺苷晶體粗品，將所述2′ 脫氧腺苷晶體粗品用乙醇水溶液進(jìn)行重結(jié)晶，得到所述2′ 脫氧腺苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)離心步驟中，溫度為0-25°C， 優(yōu)選4°C，時(shí)間為10-60分鐘，優(yōu)選20分鐘，轉(zhuǎn)速為3000-8000rpm，優(yōu)選4000rpm，離心半徑 為 150-400mm，優(yōu)選 200mm ；所述生物轉(zhuǎn)化液是按照如下方法制備而得以2' _脫氧胸苷為核糖基供體，腺嘌呤為 堿基供體，通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的核糖磷酸化酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到所述生物轉(zhuǎn)化液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，制備所述生物轉(zhuǎn)化液步 驟中，所述微生物為瑞士乳桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述離子交換樹(shù) 脂為陰離子樹(shù)脂；所述陰離子交換樹(shù)脂為717型陰離子樹(shù)脂、D201型陰離子樹(shù)脂或D290型 陰離子樹(shù)脂，優(yōu)選717型陰離子樹(shù)脂；所述大孔吸附樹(shù)脂為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂、DM18型大孔吸附樹(shù)脂、HPD722型大孔吸附 樹(shù)脂或AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，優(yōu)選DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述層析柱中的 介質(zhì)在使用前進(jìn)行如下預(yù)處理將所述層析柱中的介質(zhì)先用乙醇水溶液浸泡后，用去離子 水洗滌后用氫氧化鈉水溶液浸泡，再用去離子水洗滌至中性后用鹽酸水溶液浸泡，最后用 去離子水洗滌至中性；所述乙醇水溶液的體積百分濃度為75-99%，優(yōu)選95%，所述氫氧化 鈉水溶液的濃度為0. 5-2mol/L，優(yōu)選lmol/L，所述鹽酸水溶液的濃度為0. 5-2mol/L，優(yōu)選 lmol/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用乙醇水溶液浸泡步驟中，時(shí)間為 12-36小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)；所述用氫氧化鈉水溶液浸泡步驟中，時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu)選4小 時(shí)；所述用鹽酸水溶液浸泡步驟中，時(shí)間為2-8小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述碳酸鈉水 溶液的濃度為0. 05M-0. 2M，優(yōu)選0. 1M，所述乙醇水溶液的體積百分濃度為30-75 %，優(yōu)選 45%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述用碳酸鈉水 溶液進(jìn)行洗脫步驟中，所述碳酸鈉水溶液的用量為所述分離純化2'-脫氧腺苷用層析柱 的柱體積的2-10倍，優(yōu)選4倍，洗脫次數(shù)為1次；所述用乙醇水溶液進(jìn)行洗脫步驟中，所述乙醇水溶液的用量為所述分離純化2'-脫 氧腺苷用層析柱的柱體積的1-5倍，優(yōu)選3倍，洗脫次數(shù)為1次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)所述加入無(wú)水乙醇步驟中，無(wú)水乙醇的用量為所述步驟2)得到的洗脫液體積的0. 2-2倍，優(yōu)選0. 5倍；所述2'-脫氧腺苷晶體粗品用乙醇水溶液進(jìn)行重結(jié)晶步驟中，所述乙醇水溶液的體 積百分濃度為45%，所述乙醇水溶液的用量為所述2'-脫氧腺苷晶體粗品體積的0. 2-2 倍，優(yōu)選0.4倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述生物轉(zhuǎn)化液 是按照包括如下步驟的方法制備而得將瑞士乳桿菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌 體，將所述菌體破碎，制成細(xì)胞破碎液，向所述細(xì)胞破碎液中加入2 ‘-脫氧胸苷和腺嘌呤 進(jìn)行酶促反應(yīng)，獲得所述2'-脫氧腺苷；所述腺嘌呤的直徑小于等于10 μ m。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從生物轉(zhuǎn)化液中分離純化2′-脫氧腺苷的方法。該方法，是將制得的生物轉(zhuǎn)化液離心除去菌體，得到上清液，上清液經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂柱吸附，吸附完畢后，先用Na2CO3水溶液洗脫，再用有機(jī)溶劑的混合液洗脫，用乙醇結(jié)晶后得到2′-脫氧腺苷。該方法將生物轉(zhuǎn)化液中的2′-脫氧腺苷與其它雜質(zhì)分離和提取出來(lái)，產(chǎn)品純度達(dá)99％以上；而且提高了分離和提取速度，降低了成本、減少環(huán)境污染，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P19/40GK101962397SQ20101026310
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者張文權(quán), 張榮慶, 王洪鐘, 謝麗萍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)