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一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法

文檔序號:572229閱讀:635來源:國知局
專利名稱:一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法
CN
一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及脫氧腺苷三磷酸技術(shù)領(lǐng)域,具體地說,是一種通過生物技術(shù)合成脫氧
腺苷三磷酸的方法。背景技術(shù)
DNA分子是由四種脫氧核糖核苷酸分子結(jié)合成的兩條互補多聚核苷酸鏈。合成這 些多聚核苷酸的前體是四種脫氧核苷三磷酸,脫氧腺苷三磷酸作為四種原料之一參與核酸 分子的體內(nèi)或體外擴增。隨著生物技術(shù)工業(yè)的發(fā)展特別是DNA生物合成和聚合酶鏈式反應(yīng) 的推廣,市場上對DNA擴增所需要的脫氧核苷三磷酸的需求量將會明顯地持續(xù)升高。另外, 由于脫氧腺苷三磷酸在抗病毒抗腫瘤,治療心血管疾病等方面應(yīng)用的推廣,同樣也會對包 括本發(fā)明所闡述的產(chǎn)品_脫氧腺苷三磷酸的需求量的提高起到促進作用。
目前,商業(yè)化的脫氧腺苷三磷酸(dATP)產(chǎn)品主要是由化學(xué)合成法實現(xiàn)的 (Chambers et al. , 1957 ;Smith and Khorana, 1958);其中,dATP的合成方法包括使用脫氧 腺苷單磷酸(dAMP)的三正丁基銨鹽與正磷酸在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的存在下,在吡啶 或二甲基甲酰胺(DMF)水溶液中進行反應(yīng)。dAMP的轉(zhuǎn)化率為70%, dATP的收率在60%左 右;而且在轉(zhuǎn)化過程中不可避免地會生成脫氧腺苷二磷酸(dADP)和脫氧腺苷多磷酸等主 要副產(chǎn)物。因此在后續(xù)的分離中,需要色譜分離方法實現(xiàn)dATP與dAMP和dADP的分離。提 純過程還需要除去未反應(yīng)的DCC和正磷酸、二磷酸和多磷酸以及還原后的DCC、吡啶或DMF 溶劑。在化學(xué)轉(zhuǎn)化法所用溶劑屬于美國環(huán)境保護署列出的有毒化學(xué)品。
中國專利申請?zhí)?0100844中公開了一種通過酶催化和化學(xué)反應(yīng)聯(lián)合生產(chǎn)脫氧核 苷三磷酸的方法;該方法以天然DNA為起始原料,DNA經(jīng)酶解后,脫氧核苷單磷酸經(jīng)"脫氧核 苷單磷酸酶的催化"反應(yīng)和相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為包括脫氧腺苷三磷酸產(chǎn)品在內(nèi)的四種 脫氧核苷三磷酸;在該方法中,發(fā)明者沒有對這種"脫氧核苷單磷酸酶"進行具體描述;這 種酶的名字也沒有被NC-IUBMB(國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合命名委員會http:〃w麗. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收錄和接受,其中的化學(xué)法就是上文中所提到 的方法。 中國專利申請?zhí)?2134612公開了一種三磷酸脫氧核苷的生產(chǎn)方法;該方法是將 核苷酸還原酶EC1. 17. 4. 2和要轉(zhuǎn)化的底物ATP或CTP或GTP或TTP加入到反應(yīng)系統(tǒng)中, 使酶的濃度達0. 01 0. 16單位/ml,使底物濃度達到1 60mmol/L,并加入以維生素B12 為基礎(chǔ)的輔酶形式的輔酶,以及含巰基還原劑或NADH或蛋白質(zhì)還原劑,以緩沖液控制溶液 p朋 9,于25°C 4(TC反應(yīng);在該過程中必須使用維生素B-12作為輔酶,以NADH或蛋白 作為還原劑。工藝路線與本專利不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三 磷酸的方法。 3
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 —種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于,具體步驟為
(a)脫氧腺苷酸激酶的克隆,表達和純化; 脫氧腺苷酸激酶的克隆是指包含了釀酒酵母的培養(yǎng),基因組DNA的提取,利用 PCR技術(shù)從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的完整的脫氧腺苷單磷酸激酶的基因 ADK1,然后利用粘性末端連接法,進行重組質(zhì)粒pET-17b/ADKl的成功構(gòu)建,以及該質(zhì)粒順 利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中,并成功地進行高效表達; 脫氧腺苷酸激酶的表達和純化是指利用2 3mg/ml的細菌溶菌酶加表面活性 劑(如0.5^Tween20和0.5X的P450)或超聲波破碎細胞,然后使用蛋白分子量截留為 3, 500 14, OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶,或者通過色譜柱進行進一步的純化;
(b)丙酮酸激酶的克隆,表達和純化; 丙酮酸激酶的克隆是指自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基因BYK,重組質(zhì)粒 pET-28a/byk的成功構(gòu)建,以及該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中,并成功地進行 高效表達; 丙酮酸激酶的表達和純化是指利用溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞,使 用蛋白分子截留量在3, 500 14, OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶,或者通過色譜 柱進行進一步的純化; (c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸,烯醇式丙酮酸和游離的脫氧腺苷酸激酶、丙酮酸激 酶從脫氧腺苷單磷酸合成脫氧腺苷三磷酸; 本步驟包括以脫氧腺苷單磷酸為原料進行的脫氧腺苷三磷酸的生物催化合成;該 過程由兩步耦合的磷酸化反應(yīng)經(jīng)生成中間產(chǎn)物脫氧腺苷二磷酸實現(xiàn),其中用到原料為可溶 性的脫氧腺苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶,如附圖1所示,在第一步中,使用脫氧腺苷三磷酸 為磷酸供體,而在第二步反應(yīng)中,磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸; 第一步反應(yīng)在可溶性脫氧腺苷單磷酸激酶的作用下一摩爾的脫氧腺苷單磷酸和 一摩爾的脫氧腺苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閮赡柕拿撗跸佘斩姿幔坏诙椒磻?yīng)中,兩摩爾的脫氧 腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下,伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化,脫 氧腺苷二磷酸同時轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷三磷酸; 另外,在兩步反應(yīng)中,總計一摩爾的脫氧腺苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸
以及兩摩爾的磷酸烯醇式丙酮酸被轉(zhuǎn)化為兩摩爾的脫氧腺苷三磷酸和兩摩爾的丙酮酸,而
生成的脫氧腺苷三磷酸再次被用做第一步反應(yīng)所需要的磷酸供體,因此本反應(yīng)體系的第一
步反應(yīng)中只需要添加極為微量的脫氧腺苷三磷酸即可滿足反應(yīng)所需。 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的積極效果是 (1)目前,傳統(tǒng)的化學(xué)法既破壞環(huán)境,又因為反應(yīng)過程、純化過程的低產(chǎn)率而不經(jīng) 濟。雖然產(chǎn)品相同,但本發(fā)明描述的酶促工藝與化學(xué)法工藝截然不同過程簡單,轉(zhuǎn)化率高, 環(huán)境友好,避免使用有毒和有腐蝕性的物質(zhì),如DCC、吡啶、DMF等。 (2)本發(fā)明采用兩種很容易確認的酶,脫氧腺苷單磷酸激酶(EC 2. 7. 4. 3)和丙酮 酸激酶(EC 2.7. 1.40),而且這兩種酶制劑可以利用工程菌自行生產(chǎn),表達量高,純化簡單, 生產(chǎn)成本較低。使用過程中,可根據(jù)需要對酶用量、酶純度等進行實時控制和調(diào)節(jié)。
(3)本發(fā)明使用兩種工程菌生產(chǎn)的激酶,包括脫氧腺苷單磷酸激酶(EC2. 7. 4. 3)和丙酮酸激酶(EC 2. 7. 1. 40),這兩種酶的催化反應(yīng)不需要額外地添加輔酶。而現(xiàn)有技術(shù)使 用一種酶核苷酸還原酶(EC 1. 17. 4. 2),需要維生素B12作為酶促反應(yīng)的輔酶,
(4)本發(fā)明不使用還原劑?,F(xiàn)有所述的方法必須使用含巰基還原劑,如二硫蘇糖醇 (DTT)或二硫赤蘚糖醇(DTE)或二氫硫辛酸或巰基乙醇,本發(fā)明中不需要添加任何還原劑, 成份更加簡潔; (5)本發(fā)明所建立的催化體系中,調(diào)節(jié)兩種酶制劑的用量可以保持反應(yīng)流的正向 進行,使脫氧腺苷單磷酸底物完全轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷三磷酸產(chǎn)物,產(chǎn)物的分離和純化將更加 簡單; (6)本發(fā)明的原材料為脫氧腺苷單磷酸這一單一化合物; (7)本發(fā)明的終產(chǎn)物是單獨封裝的脫氧腺苷三磷酸產(chǎn)物,然后可以按照需求進行 分裝或者和其它三種脫氧核苷三磷酸產(chǎn)品進行混合; (8)本發(fā)明中反應(yīng)在水相中進行,原料溶解度大,可以獲得高濃度的產(chǎn)品。

圖1脫氧腺苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶催化下由脫氧腺苷單磷酸生物合成脫氧 腺苷三磷酸; 圖2HPLC檢測90分鐘后脫氧腺苷單磷酸向脫氧腺苷三磷酸的全轉(zhuǎn)化圖。
具體實施方式
以下提供本發(fā)明一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法的具體實施方式
。
實施例1 (a)脫氧腺苷單磷酸激酶的克隆,表達和純化 利用PCR技術(shù),以釀酒酵母基因組DNA為模板,擴增獲得包含起始密碼子和終 止密碼子在內(nèi)的完整的脫氧腺苷單磷酸激酶的基因ADKl,然后利用粘性末端連接法,插 入pET-17b的多克隆位點內(nèi),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-17b/ADKl,并將該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中,按照下述程序進行高效表達; 脫氧腺苷單磷酸激酶制劑制備的基本培養(yǎng)基組成為0. 5%的酵母提取物,1. 0%蛋 白胨和1. OX的氯化鈉,其余的液體為水,用5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7. 0, 12rC保溫20分鐘滅菌。滅菌后以lX接種量接種,37t:條件下,充分攪拌培養(yǎng)至0D600為 0. 5 0. 6,加入終濃度為0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG, 37"下攪拌誘導(dǎo)4小時。在4"下,10000g 離心5min收集細胞,用pH值為5 9的緩沖液洗滌,緩沖液為三羥甲基氨基甲烷_鹽酸, 葡萄糖和乙二胺四乙酸。離心收集洗滌后的細胞,用pH值為5 9的裂解緩沖液裂解細 胞,裂解液為三羥甲基氨基甲烷_鹽酸,氯化鉀,乙二胺四乙酸和溶菌酶,吐溫-20和P-40 以及PMSF,離心后獲得提取液,該提取液可以不經(jīng)純化直接使用,或者使用蛋白分子截留量 在3, 500 14, OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶,還可以通過色譜柱進行進一步的 純化; 表1由BL21 (DE3)細胞產(chǎn)生的生產(chǎn)脫氧腺苷二磷酸的酶脫氧腺苷單磷酸激酶的活 性樣品 提取液
葡聚糖凝膠G-100ttl片段 葡聚糖凝膠G-100tf2片段 其他片段組合
脫氧腺苷單磷酸激酶濃度反應(yīng)速度(mM脫氧總蛋白片段 (Bradford法) 腺苷二磷酸/min) (wt.%)
16.70 0.5278 1.69 0.4783 40.03
0.68 0.3993 38.69
21.38 (b)丙酮酸激酶的克隆,表達和純化 利用PCR技術(shù),以枯草桿菌基因組DNA為模板,擴增獲得包含起始密碼子和終止密 碼子在內(nèi)完整的丙酮酸激酶的基因BYK,然后利用粘性末端連接法,插入pET-28a的多克隆 位點內(nèi),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a/bykl ,并將該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中,按 照下述程序進行高效表達; 丙酮酸激酶制劑制備的基本培養(yǎng)基組成為0. 5 %的酵母提取物,1. 0 %蛋白胨和 1. 0%的氯化鈉,其余的液體為水,用5mo1/1的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7. 0, 12rC保溫20 分鐘滅菌。滅菌后以1%接種量接種,371:條件下,充分攪拌培養(yǎng)至0D600為0. 6 0. 9,加 入終濃度為0. 35mM的誘導(dǎo)劑IPTG,25t:下攪拌誘導(dǎo)6小時。在4"C下,10000g離心5min 收集細胞,用pH值為5 9的緩沖液洗滌,緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸,葡萄糖和乙 二胺四乙酸。離心收集洗滌后的細胞,用pH值為5 9的裂解緩沖液裂解細胞,裂解液為 三羥甲基氨基甲烷_鹽酸,氯化鉀,乙二胺四乙酸和溶菌酶,吐溫-20和P-40以及PMSF,離 心后獲得提取液,該提取液可以不經(jīng)純化直接使用,或者使用蛋白分子截留量在3, 500 14, OOODaltons的透析膜直接透析獲得粗酶,還可以通過色譜柱進行進一步的純化;
表2由BL21 (DE3)細胞產(chǎn)生的丙酮酸激酶的活性
樣品 提取液
葡聚糖凝膠G-IOO片段
其他片段組合
丙酮酸激酶濃度 (Bradford法) 17.70
1.69
反應(yīng)速度(mM脫氧總蛋白片段 腺苷二磷酸/min) (wt.%) 0.278
0.4783 64.03 35.38 (c)在可溶性脫氧腺苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶的作用下將脫氧腺苷單磷酸完全 轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷三磷酸 生產(chǎn)脫氧腺苷三磷酸的過程在3(TC下進行,緩沖液由pH8. 0的50mM Tris, lOOmM 的氯化鉀和5mM的氯化鎂組成。可溶性脫氧腺苷單磷酸激酶活力為2. 5U/ml,可溶性丙酮酸 激酶的活力為4. 0U/ml。脫氧腺苷單磷酸濃度為25mM,磷酸烯醇式丙酮酸的濃度為50mM,脫 氧腺苷三磷酸濃度為l.OmM。脫氧腺苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶皆由自主克隆相應(yīng)基因的 工程菌提取。反應(yīng)過程pH的控制通過滴加5mol/L的NaOH溶液實現(xiàn),脫氧腺苷三磷酸的生 成速率為0. 983mM/min,在大約45min內(nèi)90%的脫氧腺苷單磷酸轉(zhuǎn)化為了脫氧腺苷三磷酸。
6在大約95min內(nèi)脫氧腺苷單磷酸就可以完全轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷三磷酸,如附圖2所示。需要 特別說明的是本反應(yīng)中酶的用量、底物濃度和其它試劑的用量以及反應(yīng)器的大小可根據(jù)過 程要求,如產(chǎn)量和生產(chǎn)率而改變。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應(yīng)當指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于,具體步驟為(a)脫氧腺苷酸激酶的克隆,表達和純化;(b)丙酮酸激酶的克隆,表達和純化;(c)用激動劑脫氧腺苷三磷酸,磷酸烯醇式丙酮酸和游離的脫氧腺苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧腺苷單磷酸合成脫氧腺苷三磷酸;包括以脫氧腺苷單磷酸為原料進行的脫氧腺苷三磷酸的生物催化合成;該過程由兩步耦合的磷酸化反應(yīng)經(jīng)生成中間產(chǎn)物脫氧腺苷二磷酸實現(xiàn),其中用到原料為可溶性的脫氧腺苷單磷酸激酶和丙酮酸激酶,在第一步中,使用脫氧腺苷三磷酸為磷酸供體,而在第二步反應(yīng)中,磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(a)中,所述的脫氧腺苷酸激酶的克隆是指包含了釀酒酵母的培養(yǎng),基因組 DNA的提取,利用PCR技術(shù)從中獲得包含起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的完整的脫氧腺苷 單磷酸激酶的基因ADK1,然后利用粘性末端連接法,進行重組質(zhì)粒pET-17b/ADKl的成功構(gòu) 建,以及該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中,并成功地進行高效表達。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(a)中,所述的脫氧腺苷酸激酶的表達和純化是指利用2 3mg/ml的細 菌溶菌酶加表面活性劑或超聲波破碎細胞,然后使用蛋白分子量截留為3, 500 14, 000 Daltons的透析膜直接透析獲得粗酶,或者通過色譜柱進行進一步的純化。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(b)中,所述的丙酮酸激酶的克隆是指自枯草桿菌中獲得丙酮酸激酶的基 因BYK,重組質(zhì)粒pET-28a/byk的成功構(gòu)建,以及該質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株 中,并成功地進行高效表達。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(b)中,所述的丙酮酸激酶的表達和純化是指利用溶菌酶加表面活性劑或 超聲波破碎細胞,使用蛋白分子截留量在3, 500 14, 000Daltons的透析膜直接透析獲得 粗酶,或者通過色譜柱進行進一步的純化。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(c)中,所述的第一步反應(yīng)是指在可溶性脫氧腺苷單磷酸激酶的作用下一 摩爾的脫氧腺苷單磷酸和一摩爾的脫氧腺苷三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閮赡柕拿撗跸佘斩姿帷?br> 7. 如權(quán)利要求1所述的一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,其特征在于, 在所述的步驟(c)中,所述的第二步反應(yīng)是指兩摩爾的脫氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸 激酶的作用下,伴隨著磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化,脫氧腺苷二磷酸同時轉(zhuǎn)化為脫 氧腺苷三磷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過生物技術(shù)合成脫氧腺苷三磷酸的方法,具體步驟為脫氧腺苷酸激酶的克隆,表達和純化;丙酮酸激酶的克隆,表達和純化;用脫氧腺苷三磷酸,烯醇式丙酮酸和游離的脫氧腺苷酸激酶、丙酮酸激酶從脫氧腺苷單磷酸合成脫氧腺苷三磷酸;包括以脫氧腺苷單磷酸為原料進行的脫氧腺苷三磷酸的生物催化合成;該過程由兩步耦合的磷酸化反應(yīng)經(jīng)生成中間產(chǎn)物脫氧腺苷二磷酸實現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)點表達量高,純化簡單,生產(chǎn)成本較低;產(chǎn)物的分離和純化將更加簡單;可溶解很多的溶質(zhì),從而可以滿足不同的使用要求。
文檔編號C12R1/865GK101705272SQ20091003599
公開日2010年5月12日 申請日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日 公開號200910035993.發(fā)明者俞宏峰, 朱月珍, 段梅莉, 辛秀娟, 陸雅臣, 鮑杰 申請人:江蘇華榮生物科技有限公司
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