專利名稱：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的方法學(xué)體系構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的方法學(xué)體系構(gòu)建。
背景技術(shù)：
近年來，干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)在心血管疾病治療中取得了突破性進(jìn)展，該技術(shù)又被稱為細(xì)胞心肌成形術(shù)(cellular cardiomyoplasty)，即通過移植干細(xì)胞或心肌細(xì)胞，或者動(dòng)員外周循環(huán)血干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞遷移到心肌受損部位來實(shí)現(xiàn)損傷心肌的修復(fù)。移植干細(xì)胞實(shí)施細(xì)胞心肌成形術(shù)是改善心肌梗死造成的血液動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)體液紊亂的一種可行的方法。各種前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明干細(xì)胞具有修復(fù)心肌細(xì)胞的能力，能改善梗死區(qū)的灌注和心功能[Schuster MD, Kocher AA, Seki Τ, Martens TP, Xiang G, Homma S, et al. Myocardial neovascularization bybone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am JPhysiol Heart CircPhysiol 2004 ；287 :H525-532. (Schuster MD, KocherAA，Seki T，Martens TP, Xiang G，Homma S等，骨髓成血管細(xì)胞引起的血管新生導(dǎo)致心肌細(xì)胞再生.美國生理雜志心臟和循環(huán)分冊2004 ；287 :H525-532.)]。在用于移植的的多種細(xì)胞類型中，尤以骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)成為關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)槠溆兄@取方便、 自體移植從而免除免疫排斥反應(yīng)、強(qiáng)大的體外增殖潛能和向三胚層組織類型的細(xì)胞分化能力等顯著的優(yōu)點(diǎn)，體外和在體移植實(shí)驗(yàn)均證實(shí)MSCs可以向心肌細(xì)胞分化[Tomita S,Li RK, Weisel RD,et al. Autologous transplantation of bone marrow cellsimproves damaged heart function. Circulation. 1999 ；100 :11247-56. CTomita S,Li RK,Weisel RD等，自體骨髓干細(xì)胞移植改善受損的心功能.循環(huán)，1999;100:11247-56.)]。然而也有一些資料顯示MSCs在體移植后不能橫向分化為心肌，即使是經(jīng)過5-氮胞苷的誘導(dǎo)后也不能分化為心肌細(xì)胞[Liu Y, Song J, Liu W, et al. Growth anddifferentiation of rat bone marrow stromal cells :does 5-azacytidinetrigger their cardiomyogenic differentiation ？ Cardiovasc. Res. 2003 ；58 :460-8. (Liu Y, Song J, Liu W，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化5-氮胞苷能啟動(dòng)其向心肌細(xì)胞分化嗎？心血管研究.2003 ；58 :460-8.)]。導(dǎo)致上述結(jié)果爭議的原因很多，其中最主要的是現(xiàn)有的誘導(dǎo)方法不足以提供確切的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。而本課題組前期研究在國際上首次發(fā)現(xiàn)，豬骨髓MSCs在體外培養(yǎng)到一定代數(shù)，即自發(fā)出現(xiàn)向心肌細(xì)胞分化的現(xiàn)象?；诖?，本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法及干預(yù)手段，選擇特定培養(yǎng)代數(shù)的豬骨髓MSCs，并給予特定濃度的5-氮胞苷進(jìn)行誘導(dǎo)，以探索構(gòu)建骨髓MSCs向心肌細(xì)胞橫向分化的新體系。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明表明特定濃度的5-氮胞苷可以誘導(dǎo)PlO代MSCs成心肌分化，且分化的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟，形態(tài)更典型，分化效率更高。2.本發(fā)明結(jié)果提示MSCs培養(yǎng)狀態(tài)下增殖潛能呈不均一性。3.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)豬骨髓來源的MSCs(10. 3士 1.8%)在PlO代時(shí)能自發(fā)分化為心肌樣細(xì)胞，即使在傳代到30代時(shí)仍保持這種自發(fā)分化能力。免疫組化、電鏡和RT-PCR均表明分化而成的是心肌樣細(xì)胞，而非骨骼肌細(xì)胞。這些自發(fā)分化的MSCs可能就是MSCs培養(yǎng)過程中的定型的亞群。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)豬骨髓MSCs在Pl，P4和P8代時(shí)增殖較快，從PlO代開始減緩，并出現(xiàn)自發(fā)分化現(xiàn)象，也支持上述觀點(diǎn)。4.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷(10 μ Μ)能夠誘導(dǎo)Pl，Ρ4，Ρ8和PlO代MSCs成心肌分化，重要的是電鏡發(fā)現(xiàn)PlO代分化細(xì)胞有相對比較成熟的心肌樣結(jié)構(gòu)，如排列整齊的肌絲、 肌節(jié)、橫紋和閏盤，而在其他早期代數(shù)的分化細(xì)胞中只發(fā)現(xiàn)一些肌絲。這些超微結(jié)構(gòu)上的差異可能是由于Pio代MSCs包含有定型的細(xì)胞前體，這些定型前體已經(jīng)開始表達(dá)心肌表型，這樣在為期4周的誘導(dǎo)觀察期內(nèi)更加成熟，而早期代數(shù)的MSCs大多處于未定型的“干細(xì)胞”階段，5-氮胞苷只是啟動(dòng)了這些細(xì)胞的分化方向，因此在相同的觀察期內(nèi)并未達(dá)到相對成熟的階段。這些在超微結(jié)構(gòu)上的差異也被定量RT-PCR結(jié)果所證實(shí)。綜上所述，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)豬骨髓來源的MSCs在體外培養(yǎng)狀態(tài)下增殖到PlO代時(shí)有部分組分出現(xiàn)增速減緩、形態(tài)改變、自發(fā)成心肌分化現(xiàn)象；并且在5-氮胞苷誘導(dǎo)下PlO代 MSCs分化比率顯著高于早期各代細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)更趨成熟。
具體實(shí)施例方式材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10月齡的中華小型豬，體重(30kg±^g)，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均受到人道對待，符合美國國立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》。并且，所有實(shí)驗(yàn)方案均得到了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)阜外心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的認(rèn)可。豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定肌肉注射氯胺酮和地西泮對豬進(jìn)行麻醉，兩種藥物劑量分別為25mg/kg和Img/ kg。在無菌操作下對豬的左髂嵴處備皮、鋪單，用含12，500單位肝素的注射器抽取約50ml 骨髓。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在送回飼養(yǎng)間之前均肌肉注射丁丙諾啡0. 3mg止痛。MNCs的分離按以前報(bào)道方法略作修改。即抽取的骨髓用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋1倍，加入硅石膠態(tài)懸浮液(Percoll分離液，1. 077g/ml, Sigma公司)，在4°C條件下， 800g離心30分鐘分離出MNCs。以5X 105/cm2密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，置入37°C>5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常生長培養(yǎng)基為低糖Dulbecco，s Modified Eagle' s Medium (LG-DMEM, Gibco)、13% 胎牛血清(FBS, Gibco)。形態(tài)學(xué)觀察和增殖能力測定取第1，4，8，10 代 MSCs (passage 1，4，8，10，Pl，P4，P8，P10)按照 300 個(gè)細(xì)胞 / 孔密度接種于96孔培養(yǎng)板上，每代細(xì)胞取4孔樣品消化后以aiil PBS稀釋，在相差顯微鏡下以細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每24h進(jìn)行一次計(jì)數(shù)直至細(xì)胞停止增殖為止。計(jì)算平均活細(xì)胞數(shù)并繪制增殖曲線。細(xì)胞倍增時(shí)間(population doubling time, TD)按照下列公式計(jì)算TD=t(log 2)/(IogNt-IogNo)，t為培養(yǎng)時(shí)間，No和Nt分別為接種前后的細(xì)胞數(shù)。體外成心肌分化的誘導(dǎo)為檢測5-氮胞苷是否能誘導(dǎo)MSCs成心肌分化，選取Pl，P4，P8，PlO代MSCs，按照2 X 105/ml密度接種，接種后第二天向培養(yǎng)瓶中加入5-氮胞苷(10 μ Μ)，作用24h后洗去 5-氮胞苷，繼續(xù)傳代4周，觀察細(xì)胞形態(tài)變化并作進(jìn)一步檢測。 RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR從待檢細(xì)胞中以Trizol (Gibco)提取總RNA，合成cDNA。擴(kuò)增以下基因GATA4， α -MHC, MLC, phospholamban, connexin 43,月/L troponin I， α -sarcomeric actin, desmin，骨骼肌α-skeletal actin。選取GAPDH基因作為內(nèi)參。來源于同一頭豬的心肌細(xì)胞的總RNA同時(shí)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增以作為陽性對照，以水代替cDNA作為陰性對照。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 每個(gè)循環(huán)結(jié)束熒光光譜測量STOR Green強(qiáng)度，循環(huán)完成后在75V _95°C溫度范圍和連續(xù)熒光監(jiān)測基礎(chǔ)上分析溶解曲線，所有反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次以確保結(jié)果的可重復(fù)性。透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞以37°C預(yù)熱的PBS洗2次，加0. 2%戊二醛固定30min后以PBS 洗2次，以細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行離心，SOOrpmX 6min，棄上清，PBS洗1次， 轉(zhuǎn)至EP管中，加入等體積的10%瓊脂糖混勻，離心棄上清，以5%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂包埋，60-nm超薄切片(Sorvall MTB2 ultramicrotome)，切片以醋酸鈾檸檬酸鉛雙染，75KV 透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)(Nihon Denshi)。免疫組化MSCs達(dá)到80%融合時(shí)棄培養(yǎng)基，檢測以下抗體⑶34(1 50，Santa Cruz)， CD 45(1 50, Santa Cruz), CD 90(1 50, Santa Cruz), SH2(1 50, Santa Cruz), α -sarcomeric actin ( α -橫紋肌肌動(dòng)蛋白，1 100，DAK0)，α-MHC ( α -肌球蛋白重鏈， 1 100，DAK0)， cardiac troponin T (^^1/11) & Τ, cTn-T, 1 50, Sigma)，connexin 43(連接蛋白43，Cx43，l 50, Sigma).為確定成心肌細(xì)胞分化比率，以cTn_T陽性作為成心肌分化細(xì)胞，每份樣品取2張玻片，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)視野GOOX)，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和 cTn-T陽性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析連續(xù)變量以means士SD表示，各組樣品分化比率差別以X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P < 0. 05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性標(biāo)志。結(jié)果1.豬骨髓來源的MSCs體外培養(yǎng)的特性形態(tài)學(xué)觀察豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種后3天開始有部分細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣貼壁、變長，逐漸形成小克隆，7-10天后，貼壁細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)呈現(xiàn)為相對均一的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，免疫組化表型鑒定可見> 95%貼壁細(xì)胞為⑶90、SH2陽性，而⑶34、⑶45陰性。MSCs增殖模式原代培養(yǎng)后3-7天，大多貼壁細(xì)胞形成克隆，開始進(jìn)入對數(shù)生長期直至平臺(tái)期。 P1、P4和P8代MSCs增殖速率相似，15天觀察期內(nèi)未見顯著性差異(P = 0. 908)，倍增時(shí)間(PD)約為48h。自接種后第3天起，PlO代MSCs增殖速率則相對變慢(P < 0. 05), PD約為 72h，PlO以上代數(shù)的MSCs增殖速率和PlO相似。2.不同代數(shù)MSCs在正常生長和誘導(dǎo)條件下成心肌分化潛能形態(tài)學(xué)和增殖能力變化在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，P1、P4和P8代MSCs形態(tài)相似，但是自PlO代開始有部分細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為多核、胞漿延長、和鄰近細(xì)胞形成連接，轉(zhuǎn)變?yōu)榭寺?、球樣或者肌管樣形態(tài)。5-氮胞苷誘導(dǎo)后1周，P1、P4和P8代MSCs均表現(xiàn)為較長的胞漿形態(tài)和多核化， 4周后更多細(xì)胞相互連接形成不規(guī)則的管樣結(jié)構(gòu)，而PlO代MSCs則形成相對規(guī)則的肌管樣結(jié)構(gòu)。RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCRRT-PCR結(jié)果表明Pl、P4和P8代MSCs在正常培養(yǎng)狀態(tài)下沒有心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和功能基因的表達(dá)，而Pio代MSCs則有心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和功能基因cormexin 43、desmin、phospholabman、α -MHC和MLC的表達(dá)，未觀察到骨骼肌actin基因的表達(dá)。5-氮胞苷誘導(dǎo)后4周，所有代數(shù)的MSCs均有上述基因的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，GATA4和MLC在PlO代誘導(dǎo)MSCs的表達(dá)豐度顯著高于P4代誘導(dǎo)細(xì)胞(P = 0.018，P < 0. 0001, η = 3)，骨骼肌actin基因在所有檢測樣品中均未見表達(dá)。免疫組化分析在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，PU P4和P8代MSCs未檢測到心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)， 而在PlO代MSCs則有10. 3士 1.8%的細(xì)胞表達(dá)以下心肌特異蛋白α-sarcomeric actin、 α -cardiac MHC> cardiac troponin TfPconnexin 43。5-氮胞苷誘導(dǎo)后4周，P1、P4、P8和PlO代MSCs均表達(dá)上述心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白， P1、P4 和 P8 代 MSCs 分化比率相似(18. 31 士8. 2% vsl7. 62士 11. 9% vs 16. 52士5.0%， respectively, P > 0. 05)，但均顯著低于 PlO 代 MSCs 分化比率 52士4. 2 %，P = 0. 0001)。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡顯示在正常生長狀態(tài)下，P1、P4和P8代MSCs未見任何肌細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，而PlO 代MSCs有部分細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則肌絲，但是未見心肌特異性的橫紋、肌節(jié)和閏盤等結(jié)構(gòu)。 5-氮胞苷誘導(dǎo)后4周P1、P4和P8代MSCs顯示有較多不規(guī)則肌絲、散亂肌節(jié)和橫紋，而PlO 代MSCs則見豐富的肌絲、規(guī)則的肌節(jié)和橫紋，并可見閏盤樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論本研究結(jié)果表明特定濃度的5-氮胞苷可以誘導(dǎo)PlO代MSCs成心肌分化，且分化的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟，形態(tài)更典型，分化效率更高。在光鏡下觀察，MSCs似乎是相當(dāng)均一的成纖維樣細(xì)胞，然而我們發(fā)現(xiàn)MSCs在PlO 代時(shí)有一小部分開始呈現(xiàn)特化的細(xì)胞形態(tài)，不再表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞的形態(tài)，提示MSCs培養(yǎng)狀態(tài)下增殖潛能的不均一性。我們結(jié)果也顯示MSCs體外培養(yǎng)時(shí)具有不同層級的增殖潛能。我們首次發(fā)現(xiàn)豬骨髓來源的MSCs(10. 3士 1.8% )在PlO代時(shí)能自發(fā)分化為心肌樣細(xì)胞，即使在傳代到30代時(shí)仍保持這種自發(fā)分化能力。免疫組化、電鏡和RT-PCR均表明分化而成的是心肌樣細(xì)胞，而非骨骼肌細(xì)胞。這些自發(fā)分化的MSCs可能就是MSCs培養(yǎng)過程中的定型的亞群。我們發(fā)現(xiàn)豬骨髓MSCs在Pl，P4和P8代時(shí)增殖較快，從PlO代開始減緩，并出現(xiàn)自發(fā)分化現(xiàn)象，也支持上述觀點(diǎn)。 我們研究發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷(10 μ Μ)能夠誘導(dǎo)Ρ1，Ρ4，Ρ8和PlO代MSCs成心肌分化， 重要的是電鏡發(fā)現(xiàn)Pio代分化細(xì)胞有相對比較成熟的心肌樣結(jié)構(gòu)，如排列整齊的肌絲、肌節(jié)、橫紋和閏盤，而在其他早期代數(shù)的分化細(xì)胞中只發(fā)現(xiàn)一些肌絲。這些超微結(jié)構(gòu)上的差異可能是由于PlO代MSCs包含有定型的細(xì)胞前體，這些定型前體已經(jīng)開始表達(dá)心肌表型，這樣在為期4周的誘導(dǎo)觀察期內(nèi)更加成熟，而早期代數(shù)的MSCs大多處于未定型的“干細(xì)胞”階段，5-氮胞苷只是啟動(dòng)了這些細(xì)胞的分化方向，因此在相同的觀察期內(nèi)并未達(dá)到相對成熟的階段。這些在超微結(jié)構(gòu)上的差異也被定量RT-PCR結(jié)果所證實(shí)。 綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)豬骨髓來源的MSCs在體外培養(yǎng)狀態(tài)下增殖到PlO代時(shí)有部分組分出現(xiàn)增速減緩、形態(tài)改變、自發(fā)成心肌分化現(xiàn)象；并且在5-氮胞苷誘導(dǎo)下PlO代 MSCs分化比率顯著高于早期各代細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)更趨成熟。
權(quán)利要求
1.豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的方法學(xué)體系構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞類型為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述種屬為豬。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分化方向?yàn)樾募〖?xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的方法學(xué)體系的構(gòu)建。
文檔編號C12N5/0775GK102373177SQ201010259168
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者楊躍進(jìn), 錢海燕 申請人:楊躍進(jìn), 錢海燕