專利名稱：：一種染色液及其染色方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于細(xì)胞活力檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液及使用該染色液鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法及該方法在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：養(yǎng)蠶業(yè)是我國(guó)的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，有著悠久的歷史，在滿足人民物質(zhì)生活需要的同時(shí)，也成為我國(guó)人民與睦鄰各國(guó)友好交往的紐帶，其中著名的絲綢之路便源自桑蠶生產(chǎn)?，F(xiàn)今養(yǎng)蠶業(yè)在豐富人民物質(zhì)生活、增加農(nóng)民收益的同時(shí)，也為國(guó)家創(chuàng)造了大量的外匯和財(cái)富。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，養(yǎng)蠶業(yè)卻受家蠶微粒子病的困擾。家蠶微粒子病是由家蠶微孢子蟲(Mwewa/)o/ntyds)引起的一種危害嚴(yán)重的傳染病，也是蠶業(yè)生產(chǎn)唯一被檢疫的對(duì)象。在19世紀(jì)中葉，家蠶微粒子病曾導(dǎo)致法國(guó)和意大利等國(guó)的養(yǎng)蠶業(yè)幾乎全部毀滅。我國(guó)政府大力推行科學(xué)養(yǎng)蠶技術(shù)，制訂了嚴(yán)格的蠶種生產(chǎn)監(jiān)管法規(guī)，然而由于蠶種生產(chǎn)的特殊性，蠶種場(chǎng)仍受到微粒子病的嚴(yán)重威脅，全國(guó)仍有約85%的蠶種場(chǎng)會(huì)發(fā)生該病，一旦發(fā)病率超過(guò)國(guó)家規(guī)定的監(jiān)管條例，所生產(chǎn)的蠶種便要遭燒毀、淘汰，有的蠶種場(chǎng)一年因此造成的損失數(shù)以百萬(wàn)元計(jì)，輕則造成企業(yè)嚴(yán)重虧損，重則沒(méi)有蠶種供應(yīng)蠶農(nóng)，造成面上養(yǎng)蠶生產(chǎn)的更大損失。尤其是近年來(lái)野外昆蟲微粒子病與家蠶的交叉感染引起的損失曰益嚴(yán)重，因此，對(duì)該病發(fā)病規(guī)律、防治方法和消毒藥物篩選的進(jìn)一步深入研究顯得非常重要。孢子為感染期蟲體，它是微孢子蟲生活史中的一個(gè)發(fā)育階段。孢子個(gè)體微小，即使在顯微鏡下觀察，也難以從形態(tài)上區(qū)分其死活。蠶發(fā)病需要一定的活孢子數(shù)量，不同蠶品種、不同發(fā)育齡期、不同飼料質(zhì)量和飼育環(huán)境，都對(duì)致病所需活孢子數(shù)量有影響，所以實(shí)際上無(wú)法確知導(dǎo)致蠶死亡所需的活孢子數(shù)量或具體比例?，F(xiàn)有的一種鑒別孢子活力的方法是用生物試驗(yàn)將經(jīng)處理的家蠶孢子添食2齡起蠶，桑葉喂養(yǎng)至一定時(shí)間后逐頭解剖顯微鏡檢查，最后統(tǒng)計(jì)患病率，以不發(fā)病區(qū)認(rèn)定為孢子死亡。此法需時(shí)長(zhǎng)(約10-20天)、工作量大、所需設(shè)備多、且中間因素影響大。現(xiàn)有技術(shù)中鑒別孢子活力的方法還有采用孢子發(fā)芽備別的方法，但由于孢子極絲細(xì)小(長(zhǎng)約120140nm,寬約0.1pm),即使用相差顯微鏡觀察，其效果也欠佳，如要觀察出準(zhǔn)確的活孢子數(shù)目或孢子的活力程度則更難則更難。而通常鑒別細(xì)胞活力的染色方法，如苔盼藍(lán)染色法、美蘭染色法等，由于孢子外壁的特殊結(jié)構(gòu)，如皮膜很厚等原因，染色效果均不理想。本發(fā)明就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足而提出的一種鑒別微孢子蟲的孢子活力的新方法。本發(fā)明所稱的孢子活力是指孢子的生存狀態(tài)，孢子有可能處于存活、死亡或正在死亡的狀態(tài)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液。本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供所述方法在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液包括如下組分0.05%-0.3%吖啶橙溶液3份；0.0067%-0.026%碘化丙咬溶液1份，所述吖咬橙溶液、碘化丙咬溶液是由0.38%NaCl溶液或雙蒸水配制而成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所述原蟲細(xì)胞為蠶微孢子蟲的孢子。本發(fā)明提供的使用所述染色液鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，包括如下步驟(1)取材提供原蟲細(xì)胞，備用；(2)配制染色液將0.05%-0.3%吖啶橙溶液和0.0067%-0.026%碘化丙咬溶液按3:1混合，過(guò)濾備用；(3)染色將原蟲細(xì)胞涂片陰干，用步驟(2)提供的染色液染色，雙蒸水緩慢沖洗，干燥；(4)鏡檢于490nm激發(fā)濾光片和510nm光柵濾光片菱光顯微鏡下觀察；(5)鑒別根據(jù)鏡檢結(jié)果的顏色變化鑒別原蟲細(xì)胞活力。當(dāng)步驟(1)提供的原蟲細(xì)胞是冷藏的，需置室溫下恢復(fù)常溫才可備用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中所述的吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0J8。/oNaCl溶液配制而成。優(yōu)選地，步驟(3)中所述的染色時(shí)間為5-20分鐘，優(yōu)選IO分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟()提供的原蟲細(xì)胞為蠶微孢子蟲的孢子。本發(fā)明提供的所述染色液在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用是根據(jù)所述方法獲得的鏡檢結(jié)果的顏色變化來(lái)鑒別蠶微孢子蟲的孢子的活力，以此來(lái)檢測(cè)家蠶是否帶有微粒子病。本發(fā)明一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液及其使用方法，對(duì)鑒別家蠶微孢子蟲孢子的活性，具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確、直觀的特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。鑒于家蠶微粒子病長(zhǎng)期嚴(yán)重威脅蠶種生產(chǎn)，采用本發(fā)明鑒別家蠶微孢子蟲的活力技術(shù)，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)有重大的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，對(duì)進(jìn)一步深入研究家蠶微粒子蟲的傳染規(guī)律、微粒子病的發(fā)病規(guī)律、微粒子病防治技術(shù)、微孢子蟲消毒和治療藥物篩選等有重要意義。本發(fā)明也為昆蟲學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)等其他原蟲研究領(lǐng)域提供很好的借鑒作用。圖1是經(jīng)清水處理的凝:孢子蟲孢子的熒光顯獨(dú)t鏡觀察圖。圖2是經(jīng)5mg/L二氧化氯溶液處理10分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖。圖3是經(jīng)5mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖。圖4是經(jīng)10mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的菱光顯微鏡觀察圖。圖5是經(jīng)15mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖。圖6是經(jīng)20mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖。圖7是經(jīng)25mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的萸光顯微鏡觀察圖。圖8是經(jīng)50mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖。圖9是經(jīng)500mg/L二氡化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的萸光顯微鏡觀察圖。圖10是經(jīng)IOO'C水蒸汽處理IO分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供的用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液包括吖。定橙溶液和碘化丙。定溶液兩種組分。其中吖啶橙為浸潤(rùn)性染料，可侵入活細(xì)胞休內(nèi)，并在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光；碘化丙啶為排斥性染料，不能進(jìn)入活細(xì)胞體內(nèi)，但可與死亡或者正在死亡的細(xì)胞的核酸結(jié)合，在焚光顯微鏡下發(fā)紅色熒光。故可以根據(jù)吖啶橙和碘化丙啶染色后原蟲細(xì)胞在熒光顯微鏡下顏色的變化來(lái)鑒別原蟲細(xì)胞的活力。使用本發(fā)明的技術(shù)方案時(shí)，焚光顯微鏡設(shè)置為激發(fā)光濾光片490nm,光4冊(cè)濾光片510nm。下面闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例一、染色液配制方法1.染料來(lái)源吖咬橙，碘化丙啶為Sigma公司分裝。2.配制方法用0.38%NaCl溶液配制成0.2%吖啶橙溶液和0.013%碘化丙啶溶液，吖啶橙溶液與石典化丙啶溶液按3:1比例混合，0.22pm混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，除去染料溶液中雜質(zhì)和細(xì)菌，備用。使用0.38%NaCl溶液配制所述染料能夠使染色后的涂片更便于觀察，鏡檢圖像效果更好。實(shí)施例二、染色液配制方法1.染料來(lái)源吖咬橙，*^丙啶為Sigma公司分裝。2.配制方法用雙蒸水配制成0.3%吖啶橙溶液和0.0067%碘化丙啶溶液，吖咬橙溶液與石^f匕丙啶溶液按3:l比例混合，0.22pm混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，除去染料溶液中雜質(zhì)和細(xì)菌，備用。實(shí)施例三、染色液配制方法1.染料來(lái)源吖啶橙，碘化丙啶為Sigma公司分裝。2.配制方法用雙蒸水配制成0.05%吖咬橙溶液和0.026%硤化丙咬溶液，吖咬橙溶液與碘化丙啶溶液按3:1比例混合，0.22pm混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾，除去染料溶液中雜質(zhì)和細(xì)菌，備用。實(shí)施例四、使用所述染色液鑒別家蠶微孢子蟲的活力按下述步驟鑒別家蠶微孢子蟲的活力1.取才才分別以濃度為5mg/L，10mg/L,15mg/L,20mg/L,25mg/L，50mg/L,500mg/L的二氧化氯處理家蠶微孢子蟲孢子30分鐘，再以濃度為5mg/L的二氧化氯處理家蠶微孢子蟲孢于10分鐘，以清水處理做陰性對(duì)照，以IOO'C水蒸汽處理IO分鐘做陽(yáng)性對(duì)照。2.染色將處理孢子液涂片陰干(如冰箱冷藏的孢子，要置室溫下恢復(fù)常溫后再操作)，用實(shí)施例一制備的染色液染色I(xiàn)O分鐘，雙蒸水緩慢沖洗，干燥。3.鏡檢于490nm激發(fā)濾光片和510nm光柵濾光片熒光顯微鏡下觀察。4.鑒別鏡檢結(jié)果見(jiàn)附圖1-10:圖1是經(jīng)清水處理的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，清水處理的活孢子為翠綠色；圖2是經(jīng)5mg/L二氧^f匕氯溶液處理10分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖，孢子綠中帶黃；圖3是經(jīng)5mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子黃色加深，翠綠色孢子顯著減少；圖4是經(jīng)10mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的焚光顯微鏡觀察圖，大部分孢子成為黃色，只有少數(shù)為翠綠色；圖5是經(jīng)15mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子幾乎為黃色，只有極個(gè)別孢子綠中帶黃；圖6是經(jīng)20mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子幾乎為黃色，只有極個(gè)別孢子綠中帶黃；圖7是經(jīng)25mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子為橙黃色；圖8是經(jīng)50mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯凝:鏡觀察圖，孢子為橙黃色；圖9是經(jīng)500mg/L二氧化氯溶液處理30分鐘的微孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子為橙紅色；圖10是經(jīng)IO(TC水蒸汽處理10分鐘的孩i孢子蟲孢子的熒光顯微鏡觀察圖，孢子為橙紅色；用熒光顯微鏡觀察經(jīng)不同方式處理的孢子的形態(tài)，15mg/L以上濃度的二氧化氯處理和IO(TC水蒸汽處理的死"I包子為橙紅色，清水處理的活孢子為翠綠色，活孢子和死孢子之間不同活性的孢子呈現(xiàn)過(guò)渡型的顏色，由綠黃色—黃綠色—黃色—橙紅色，通過(guò)涂片的顏色可以判斷孢子的生存狀態(tài)，即是處于生存或死亡或正在死亡的狀態(tài)。為驗(yàn)證本發(fā)明鑒別的效果，以生物試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。生物試驗(yàn)的方法為分別將經(jīng)不同濃度二氧化氯處理的家蠶微孢子蟲以及相同濃度時(shí)不同處理時(shí)間的家蠶微孢子蟲添食家蠶，以清水處理做陰性對(duì)照，以100。C水蒸汽處理IO分鐘做陽(yáng)性對(duì)照，桑葉喂養(yǎng)至一定時(shí)間后逐頭解剖顯微鏡檢查，最后統(tǒng)計(jì)患病率，以不發(fā)病區(qū)認(rèn)定為孢子死亡。生物試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表l:用清水處理過(guò)的孢子可導(dǎo)致家蠶實(shí)際發(fā)病83.3%、校正發(fā)病率為100%;15mg/L及其以上濃度的二氧化氯處理30分鐘，其實(shí)際發(fā)病率和校正發(fā)病率均為0;5mg/L二氧化氯處理IO分鐘，校正發(fā)病率為13.2%;5mg/L二氧化氯處理30分鐘，校正發(fā)病率8.0%;10mg/L二氧化氯處理30分鐘，校正發(fā)病率5.2%。此結(jié)果與本發(fā)明染色方法家別的結(jié)果完全吻合，充分表明本發(fā)明對(duì)鑒別家蠶微孢子蟲的活性，具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確、直觀的特點(diǎn)，而且可以鑒別不同死亡時(shí)期的孢子。表l生物試驗(yàn)的發(fā)病率和校正發(fā)病率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在本發(fā)明的實(shí)施例四中，當(dāng)以葉足蟲類的溶組織內(nèi)阿米巴為二氧化氯的處理對(duì)象，然后進(jìn)行染色、4免檢，也可獲得相同的4竟檢結(jié)果，通過(guò)鏡;^結(jié)果的涂片顏色判斷出溶組織內(nèi)阿米巴的生存狀態(tài)，以此來(lái)判斷溶組織內(nèi)阿米巴的活力。本發(fā)明對(duì)鑒別家蠶微孢子蟲孢子的活性，具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確、直觀的特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。鑒于家蠶孩i粒子病長(zhǎng)期嚴(yán)重威脅蠶種生產(chǎn)，采用本發(fā)明鑒別家蠶微孢子蟲的活力技術(shù)，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)有重大的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，對(duì)進(jìn)一步深入研究家蠶微粒子蟲的傳染規(guī)律、微粒子病的發(fā)病規(guī)律、微粒子病防治技術(shù)、微孢子蟲消毒和治療藥物篩選等有重要意義。本發(fā)明也為昆蟲學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)等其他原蟲研究領(lǐng)域提供很好的借鑒作用。權(quán)利要求1.一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液，包括如下組分0.05％-0.3％吖啶橙溶液3份，0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液1份。2.如權(quán)利要求1所述的用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液，其特征在于所述吖咬橙溶液濃度為0.2%,所述s^f乜丙啶溶液濃度為0.013%。3.如權(quán)利要求1或2所述的用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液，其特征在于所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38。/。NaCl溶液配制而成。4.如權(quán)利要求1或2所述的用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液，其特征在于所述原蟲細(xì)胞為家蠶微孢子蟲的孢子。5.—種鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，包括如下步驟(1)取材提供原蟲細(xì)胞，備用；(2)配制染色液將0.05%-0.3%吖啶橙溶液和0.0067%-0.026%碘化丙啶溶液按3:1混合，過(guò)濾備用；(3)染色將原蟲絢胞涂片陰干，用步驟(2)提供的染色液染色，雙蒸水緩慢沖洗，干燥；(4)鏡檢于490nm激發(fā)濾光片和510nm光柵濾光片突光顯微鏡下觀察；(5)筌別根據(jù)鏡檢結(jié)果的顏色變化鑒別原蟲細(xì)胞活力。6.如權(quán)利要求5所述的鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，其特征在于步驟(2)中所述吖咬橙溶液濃度為0.2%,所述珙化丙啶溶液濃度為0.013%。7.如權(quán)利要求5所述的筌別原蟲細(xì)胞活力的方法，其特征在于步驟(2)中所述吖咬橙溶液、碘化丙夂溶液是由0.38%NaCl溶液配制而成。8.如權(quán)利要求5所述的鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，其特征在于步驟(3)中所述的染色時(shí)間為IO分鐘。9.如權(quán)利要求5所述的鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，其特征在于步驟(1)提供的原蟲細(xì)月包為家蠶孩i孢子蟲的；包子。10.如權(quán)利要求9所述的鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法在筌別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于細(xì)胞活力檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于鑒別原蟲細(xì)胞活力的染色液及一種鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法及該方法在鑒別家蠶微孢子蟲活力中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的染色液包括如下組分0.05％-0.3％吖啶橙3份；0.0067％-0.026％碘化丙啶1份，所述吖啶橙、碘化丙啶是由0.38％NaCl溶液配制而成。本發(fā)明提供的鑒別原蟲細(xì)胞活力的方法，包括取材、配制染色液、染色、鏡檢以及根據(jù)鏡檢結(jié)果的顏色變化鑒別原蟲細(xì)胞活力。本發(fā)明對(duì)鑒別家蠶微孢子蟲孢子的活性，具有快捷、靈敏、準(zhǔn)確、直觀的特點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101225428SQ20071002644公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2007年1月19日優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日發(fā)明者廖富蘋,林健榮,王正勇申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)