專利名稱：一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氯霉素抗體領(lǐng)域，具體涉及一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氯霉素(CAP)是一種可引起人類再生障礙性貧血粒狀白細(xì)胞缺乏癥等嚴(yán)重疾病 的抗生素，自1994年起便被聯(lián)合國禁止使用，我國亦自2002年起明確規(guī)定動物源性食品 中氯霉素殘留不得檢出(王伊琴，包勇敢，胡烈山，等.ELISA在檢測動物組織氯霉素殘留 中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)通報(bào)，2006，22 (4) :26-29.)，但由于廉價(jià)高效，目前仍被廣泛非法 濫用于養(yǎng)殖業(yè)，給人民生命健康和我國動物源性食品相關(guān)產(chǎn)品的出口貿(mào)易帶來了較大的挑 戰(zhàn)。特異性抗體在食品有害殘留檢測中具有重要意義，高質(zhì)量的抗體是食品有害殘留樣品 的制備和檢測的關(guān)鍵試劑(周宏琛，閆秋成，田曉林，等.動物源性食品安全快速檢測與酶 聯(lián)免疫吸附方法的應(yīng)用[J].肉品衛(wèi)生，2005,25(11) :29-32.)。單克隆抗體(MAb)具有特 異性強(qiáng)和親和力高的優(yōu)點(diǎn)，但其現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)存在生產(chǎn)成本高、規(guī)模難于工業(yè)放大和質(zhì)控 等缺點(diǎn)。基因工程小分子抗體是單克隆抗體的理想替代產(chǎn)品，目前已有眾多獸藥和農(nóng)藥類 小分子半抗原的基因工程抗體的報(bào)道(YAU KY, LEEH，HALL J C. et al. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies[J]. Biotechnology Advances, 2003, 21 :599_637. >KRAMER K,HOCK B. Recombinant antibodies for environmental analysis[J]. Anal. Bioanal. Chem. 2003,377,417-426. > H00GENB00M H R. Selecting and screening recombinant antibody libraries[J]. Nature 2005,23, 1105-1116.)。單鏈抗體(scFv)是一種以柔性接頭連接抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的小分子 基因工程抗體，該類抗體既保留了母本抗體的親和力又便于基因工程手段生產(chǎn)，因此得到 了較廣泛的研究和應(yīng)用。但該類抗體的二個可變區(qū)之間由于缺乏母本抗體那樣的鏈間二 硫鍵，因此穩(wěn)定性較差。二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體(sdsFv)即是通過模擬天然抗體的結(jié)構(gòu) 而在單鏈抗體基礎(chǔ)上引入一對二硫鍵的構(gòu)建形式(NISHI K，ISHIUCHI M，M0RIMUNE K，et al. Molecular and immunochemical characteristics of monoclonal and recombinant antibodies selective for the triazine herbicide simetryn and application to environment analysis. J. Agric. Food Chem. 2005，53，5096-5104.)。我們曾報(bào)道了抗氯霉 素單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆(李黃金，趙林，陳偉，等.抗氯霉素抗體可變區(qū)基因的克 隆與序列分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36 (24) =4655-4658.) 0

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的用于檢測氯霉素殘留的單鏈抗體中存在的可變區(qū) 之間缺乏二硫鍵，穩(wěn)定性較差的問題，提供了一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。本發(fā)明另一目的在于提供經(jīng)過優(yōu)化的編碼上述抗氯霉素單鏈抗體的cDNA。本發(fā)明另一目的在于提供上述抗氯霉素單鏈抗體的構(gòu)建方法。
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本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述氯霉素單鏈抗體的試劑盒。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述氯霉素單鏈抗體的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。一種編碼權(quán)利要求1所述二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的cDNA，其特征在于其 核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的構(gòu)建方法是以抗氯霉素抗體可變區(qū)基 因?yàn)槟０?，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別加入一個半胱氨酸定點(diǎn)突變，以 重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體基因，將該基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá) 系統(tǒng)中，表達(dá)的蛋白即為二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。一種試劑盒，該試劑盒中包含二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。單鏈抗體(scFv)是目前得到廣泛應(yīng)用的基因工程抗體類型，該類抗體是以 (Gly4Ser)JMf Vh和\片段連接起來而形成的單鏈小分子抗體。眾多的研究結(jié)果表明， scFv類小分子抗體擁有與母本單抗相似、甚至更高的親和力。二硫鍵穩(wěn)定的單鏈抗體 (sdsFv)是為了提高scFv的穩(wěn)定而在V1^P Vl間引入一對二硫鍵的改良型。目前在sdsFv 中的二硫鍵位置主要是Vh44和Vutltl，分別位于Vh的FR2區(qū)和\的FR4，均為非抗原識結(jié)合， 所以此處引入二硫鍵對抗體的親和力影響不大。我們通過以KABAT數(shù)據(jù)庫比對單抗V區(qū)氨 基酸保守序列進(jìn)行推斷，得出先前克隆的抗氯霉素抗體V基因的突變位點(diǎn)為Vh49和Vu2tl,并 以此為基礎(chǔ)構(gòu)建sdsFVCAP。與scFV 類抗體一樣，sdsFv 也有 VH-linker_VL 和 Vflinker-V11 二種構(gòu)建形式。有 研究表明，以前種形式構(gòu)建的sdsFv親和力高于后者形式的，但表達(dá)水平遠(yuǎn)低于后者的。在 本發(fā)明中所構(gòu)建的sdsFV。^基因不能獨(dú)立表達(dá)，但當(dāng)融合于Trx的3’端時(shí)可高效表達(dá)，表 明該基因的5’端序列影響轉(zhuǎn)錄或翻譯。當(dāng)通過同義突變將該基因的5’端30bp內(nèi)的GC含 量從60%降低到30%時(shí)即實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表明5’端序列GC含量過高是sdsFV ^基因 低表達(dá)的關(guān)鍵原因，至于是否為所有VH-linker-\類構(gòu)建的低表達(dá)原因尚需進(jìn)一步研究。大腸桿菌高效表達(dá)產(chǎn)物一般為不溶的包涵體蛋白，包涵體蛋白的復(fù)性是關(guān)鍵工藝 之一。sdsFV。AP_2基因表達(dá)產(chǎn)物也為包涵體蛋白，當(dāng)我們對該產(chǎn)物變性后采用常規(guī)的稀釋復(fù) 性法進(jìn)行復(fù)性操作時(shí)發(fā)現(xiàn)絕大部分目的蛋白被聚沉了，這可能與在VirIinker-VJ旬引入了 二硫鍵有關(guān)。當(dāng)采用環(huán)糊精分子伴侶系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)性時(shí)即解決了沉淀問題，所獲復(fù)性產(chǎn) 物的與母本抗體的親和力基本一致，表明SdsFVfflp蛋白得到了較好的復(fù)性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明以抗氯霉素抗體可變區(qū)基因?yàn)槟０?，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可 變區(qū)分別加入一個半胱氨酸定點(diǎn)突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈 抗體基因，將該基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)出二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。 由于引入了一對二硫鍵的構(gòu)建形式，使抗體的穩(wěn)定性提高，從而可以取代單克隆抗體用于 氯霉素殘留的檢測。同時(shí)，通過降低5’端序列中的GC含量對目的基因進(jìn)行優(yōu)化，解決了天 然V基因組裝產(chǎn)物在大腸桿菌系統(tǒng)中的低水平表達(dá)問題。


圖1為抗氯霉素抗體V區(qū)半胱氨酸突變位點(diǎn)；圖2 為重疊延伸 PCR 組裝 SdSFvc^1，其中，1 為 ScFvcap ； 2 為 VH_CAP_Linker ； 3 為 Linker-VL_CAP ；M 為 IOObp DNA ladder ；圖3為^評^^“基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)；其中，1為未誘導(dǎo)的含有 pET2Ia-ScFvc^1的宿主細(xì)胞；2為誘導(dǎo)的含有pETZla-scFv^^的宿主細(xì)胞；3為未誘導(dǎo) 的含有pETSZa-scFv^H的宿主細(xì)胞；4為誘導(dǎo)的含有pETSZa-scFv。^的宿主細(xì)胞；M為 marker ；圖4為8(1評\ _2基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，其中，1為宿主細(xì)胞；2為未 誘導(dǎo)的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主細(xì)胞；3為未誘導(dǎo)的含有pETSZa-scFv。^的宿主細(xì)胞； 4為誘導(dǎo)的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主細(xì)胞；5為誘導(dǎo)的含有pETSZa-scFv^H的宿主細(xì) 胞；M 為 marker ；圖5為sdsFV。AP_2基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化，其中，1為總蛋白；2為超聲破碎宿主細(xì)胞 得到的上清；3為超聲破碎宿主細(xì)胞得到的沉淀；4為純化的包被蛋白；5為復(fù)性的SCFvcap。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的構(gòu)建1.材料與方法1. 1 材料抗CAP Mab 粗制品、含抗 CAP 的 VH(FJ477893)和 VL(FJ477894)基因的質(zhì)粒 1 18-11-￥11與？1 18-11-\、氯霉素-卵清蛋白偶聯(lián)物(CAP-OVA)、大腸桿菌DH5 α等均由本 室制備或保存。大腸桿菌BL21 (DE3)、表達(dá)載體pET21a和pET32a均為N0VAGEN公司產(chǎn)品， PMD18-T、Taq 酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA lader, TaKaRa MutanBEST Kit 等均 購自大連寶生物工程有限公司，DNA回收試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司，HisTrap FF 柱(Iml)、HiTrap Protein G 柱(Iml)、HRP-anti_His6 tag 禾口 HRP-goat-anti-mouse IgG 均為GE公司產(chǎn)品，BCA試劑盒為廣州美津生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。1.2引物設(shè)計(jì)與合成V基因定點(diǎn)突變用引物VH-ml的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，VH_m2的核苷 酸序列如SEQ ID NO 5所示，Vfml的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，VL_m2的核苷酸序 列如SEQ ID NO 7所示。sdsFvCAP組裝用引物A(VH5，)的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所 示，B(VH3，-linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，C(Linker_VL5，)的核苷酸序列如 SEQ ID NO 10所示，D(Vl3')的核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示，E的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示。所有引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。1.3V基因定點(diǎn)突變采用TaKaRa MutanBEST Kit按廠家說明進(jìn)行。Vh突變模板為pMD 18_T_VH，引物 為 VH-ml 和 VH-m2 ;VL 突變模板為 PMD18-T_Vl，引物為 Vfml 和 Vl-iii2。1. 4sdsFVCAP基因組裝與克隆
以上述突變Vh和VJ3CR產(chǎn)物為模板，以引物A與B擴(kuò)增VH-linker，以引物C與D 擴(kuò)增 linker-VL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為 94°C 5min，94°C 30s, 55 °C 30s, 72°C 30s，共 25 個循環(huán)， 72°C 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物以(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離后用DNA回收試劑盒按照廠家說明 書進(jìn)行目的片段回收。回收片段經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行下述二步擴(kuò)增反應(yīng)第一步，Va-Iinker 和Iinker-VL進(jìn)行重疊延伸，反應(yīng)條件為94°C 5min，94°C lmin，72°C 1.5min，共5個循環(huán)； 第二步，以引物A和D或E和D配對進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C 5min,94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1. 5min，共 25 個循環(huán)，72°C 7min。A-D 引物對擴(kuò)增產(chǎn)物以 NdeI-HindIII 雙 酶切后按常規(guī)方法[8]克隆于表達(dá)載體pET21a的相同位點(diǎn)，得表達(dá)載體pET21a-SdSFVfflP ； E-D引物對擴(kuò)增產(chǎn)物以Nc0I-HindIII雙酶切后克隆于pET32a的相同位點(diǎn)，得融合表達(dá)載 體pET32a-SdSFV。AP。所有表達(dá)載體的構(gòu)建均以大腸桿菌DH5 α為宿主菌，所獲表達(dá)載體委 托深圳華大基因有限公司進(jìn)行目的基因表達(dá)盒序列分析。經(jīng)序列分析確證后的表達(dá)載體質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，得sdsFveAP工程菌。1. 5sdsFVCAP基因表達(dá)誘導(dǎo)SCFvcap工程菌接種于含50 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按 1% (V/V)比例轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2. 5h，加入IPTG至終濃度lmmol/L進(jìn)行表達(dá) 誘導(dǎo),共誘導(dǎo)4h。6000r/min離心5min收集菌體。1. 6sdsFVCAP包涵體蛋白分離純化經(jīng)表達(dá)誘導(dǎo)所獲菌體按10% (W/V)懸浮于含500mmol/L NaCl的20mmol/L磷 酸鈉緩沖液(PH7. 5)，于冰浴中以300瓦輸出功率間歇式超聲破碎lOmin，12000r/min離 心IOmin0所獲沉淀分別用含2% (V/V)TritonX100、500mmol/LNaCl和不同濃度尿素的 20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)洗滌，最后所獲離心沉淀按濕重的1 % (W/V)懸浮 于變性緩沖液(含8mol/L尿素、1 % (V/V) β -巰基乙醇和500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH8. 0)，37°C水浴 3h, 12000r/min 離心 lOmin，所獲上清以 HisTrap FF 柱 參照廠家說明進(jìn)一步純化，其中平衡緩沖液為含20mmol/L咪唑的變性緩沖液，洗脫緩沖液 為含300mmol/L咪唑的變性緩沖液。1. 7scFVCAP包涵體蛋白的復(fù)性變性的目的蛋白參照β-環(huán)糊精人工伴侶系統(tǒng)[9]以含18mmol/Li3-環(huán)糊精的 20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)進(jìn)行稀釋復(fù)性，稀釋后的蛋白質(zhì)溶液中SDS的終濃度控 制為2mmol/L，β -環(huán)糊精的終濃度為8mmol/L。稀釋液在室溫下磁力攪拌過夜。以0. 45 μ m 纖維素膜過濾法去除可見沉淀，以S印hadex G25(GE公司產(chǎn)品)柱按30% (V/V)上樣體積 將上述復(fù)性產(chǎn)物的緩沖液置換為20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 5)。1. 8蛋白質(zhì)SDS-PAGE與凝膠掃描分析參照常規(guī)方法進(jìn)行各種樣品的SDS-PAGE。菌體培養(yǎng)物或純化過程中的蛋白樣品以 2倍上樣緩沖液煮沸5min，還原電泳上樣緩沖液不含β-巰基乙醇。電泳所獲凝膠以“天能 牌”凝膠密度掃描儀按廠家說明進(jìn)行拍照和表達(dá)水平或蛋白質(zhì)純度分析。1.9蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA試劑盒參照廠家說明進(jìn)行，以小牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。1. 10抗體親和力常數(shù)測定參照Batty等非競爭性ELISA法[1°]進(jìn)行，以sdsFVfflP樣品和母本單抗4D10平
6行分析，酶標(biāo)二抗分別為HRP-anti-His6 tag和HRP-goat-anti-mouse IgG。為使母本單 抗與待測SdsFv。AP樣品純度基本一致，將抗CAP Mab粗制品(經(jīng)辛酸硫酸銨法制備)以 HiTrap Protein G柱按照廠家說明書進(jìn)行純化，其中柱平衡緩沖液為20mmol/L磷酸鈉緩沖 液(PH7. 4)，洗脫緩沖液為lOOmmol/L的甘氨酸-HCl (pH2. 7)，目的峰樣收集于預(yù)置中和緩 沖液lmol/L Tris-HCl (ρΗ9· 0)。親和力常數(shù)測定時(shí)以1 μ g/ml、2 μ g/ml和4 μ g/ml等三個 不同濃度的CAP-OVA(抗原)包被酶標(biāo)板，供試抗體經(jīng)濃度測定后倍比稀釋。以抗體的摩爾 濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)、以O(shè)D45tl值為縱坐標(biāo)作圖，找出其ODmax值，并求出OD450 = 1/2 ODfflax 時(shí)相對應(yīng)的抗體濃度[Ab] 1/2，按公式Ka= (n-l)/[2(n[Ab]1/2' -[Ab]1/2)]分別求出二種抗 原濃度之間的Ka值，其中η為抗原高低濃度之比，[Ab]1/2'為較低濃度抗原對應(yīng)的[Ab]1/2。 所得三個Ka值的算術(shù)平均值即為抗體的親和常數(shù)，單位為摩爾濃度的倒數(shù)，即L/mol。2結(jié)果與分析2. IV基因突變與組裝參照文獻(xiàn)報(bào)道的半胱氨酸引入位點(diǎn)分別對抗氯霉素抗體Vh和\基因進(jìn)行定點(diǎn)突 變，突變V基因經(jīng)測序確證后采用重疊延伸PCR法組裝成VH-linker-\型sdsFVeAP，其中的 linker序列為(Gly4Ser)3。突變的氨基酸殘基位點(diǎn)如圖1所示，Vh的突變位點(diǎn)為第2框架 區(qū)的第49位氨基酸，與Kabat數(shù)據(jù)庫Vh的保守序列第44位氨基酸殘基相對應(yīng)；\的突變位 點(diǎn)為第4框架區(qū)的第120位氨基酸，與\的保守序列第100位氨基酸殘基相對應(yīng)。SdsFVfflp 基因組裝結(jié)果如圖2所示，經(jīng)重疊延伸PCR所得sdsFVCAP基因片段與理論大小一致，大小約 為790bp，經(jīng)序列分析與設(shè)計(jì)序列一致，定名為sdsFV。^ (GenBank ID ⑶258050)。專利中， 單純基因序列的表示有一個專門的序列表格式，不可以放到說明書附圖中。2. 2sdsFVCAP-l基因克隆與表達(dá)上述sdsFVcn基因組裝產(chǎn)物克隆于表達(dá)載體pET21a和pET32a，以便在宿主菌大 腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行獨(dú)立表達(dá)或融合表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，在強(qiáng) 啟動子T7驅(qū)動下，SCIsFVqum基因不能有效單獨(dú)表達(dá)，但當(dāng)其5’端融合于硫氧環(huán)蛋白(Trx) 基因之后時(shí)即可高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為45KD，與理論值一致。通過PCR引物對SCIsFVqum基因5’端進(jìn)行同義突變，以便優(yōu)化目的基因。將 30bp序列內(nèi)所有密碼子中的第3位堿基G或C全部置換成A或T，得到同義突變型基因 sdsFVCAP_2 (GenBank ID :GU258050)。所獲 sdsFVCAP_2 基因 5，端 30bp 序列內(nèi)的 GC 含量由 60% 降至36 %，克隆于表達(dá)載體pET21a后獨(dú)立表達(dá)時(shí)即可高效表達(dá)(圖4)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為 28KD，與理論值一致，表達(dá)水平與融合表達(dá)相似，達(dá)到30%以上。2. 3sdsFVCAP-2基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化與分析sdsFVCAP_2基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，sdsFVeAP_2基因表 達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體蛋白存在，因?yàn)槟康拇笮〉牡鞍字饕霈F(xiàn)在菌體超聲破碎沉淀中。包 涵體經(jīng)含2mol/L尿素的緩沖溶液簡單洗滌后純度達(dá)到90%以上，但所獲包涵體蛋白經(jīng)變 性后以HisTrap預(yù)裝柱進(jìn)行基于His標(biāo)簽的親和層析純化并未見純度顯著提高。包涵體蛋 白可完全被8mol/L尿素溶液裂解，變性蛋白采用常規(guī)的稀釋復(fù)性法復(fù)性時(shí)絕大部分目的 蛋白被聚沉，但采用環(huán)糊精分子伴侶系統(tǒng)復(fù)性未見顯著沉淀。所獲復(fù)性溶液與純度相 近(90%)的母本抗體所進(jìn)行的平行分析結(jié)果表明，SdSFvau^f氯霉素的親和力與母本抗體 4D10的相似，二者的親和力常數(shù)分別為7. OX 10_9L/mOl和4. 5X 10_9L/mOl。
權(quán)利要求
一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO1所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的cDNA，其特征在于其核 苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權(quán)利要求1所述二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體的構(gòu)建方法，其特征在于是以抗氯 霉素抗體可變區(qū)基因?yàn)槟０?，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別加入一個半胱 氨酸定點(diǎn)突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體基因，再通過引物 突變PCR在目的基因的5’端30bp序列內(nèi)引入同義突變，以降低該序列內(nèi)的GC含量，將該 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)的蛋白即為二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。
4.一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包含權(quán)利要求1所述二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素 單鏈抗體。
5.權(quán)利要求1所述二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體在殘留氯霉素的檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明抗氯霉素單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明以抗氯霉素抗體可變區(qū)基因?yàn)槟０?，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別加入一個半胱氨酸定點(diǎn)突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體基因，通過引物突變PCR在基因的5’端30bp序列內(nèi)引入同義突變后，將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)的蛋白即為二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體。本發(fā)明抗氯霉素單鏈抗體通過模擬天然抗體的結(jié)構(gòu)，在單鏈抗體的基礎(chǔ)上引入一對二硫鍵的構(gòu)建形式，可以提高抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明二硫鍵穩(wěn)定的抗氯霉素單鏈抗體可以取代單克隆抗體用于氯霉素殘留檢測。
文檔編號C12N15/70GK101935350SQ20101023695
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者唐偉, 李黃金, 柴偉佳, 趙林, 陳偉 申請人:廣東藥學(xué)院