專利名稱：一種枯草芽孢桿菌、其菌劑、以及其制劑在水果保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對采后水果的病菌有抑制作用的具有廣譜抗病原真菌活性的枯 草芽孢桿菌，及以所述枯草芽孢桿菌為活性菌的菌劑及其制備方法，及菌劑在水果保鮮領(lǐng) 域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國水果采后腐爛損失嚴重，造成了巨大經(jīng)濟損失，采后病原微生物的侵染是造 成采后腐爛損失的最主要原因，在水果保鮮領(lǐng)域，大量使用化學殺菌劑以防止水果腐敗，但 是在水果保鮮中大量使用化學殺菌劑給水果的食用安全造成了很大的影響，如何減少水果 保鮮中化學殺菌劑的使用成為公眾十分關(guān)注的食品安全問題?？莶菅挎邨U菌Bacillus subtilis是自然界中廣泛的一種非致病細菌，在土壤、 植物根際和植物體內(nèi)存在有大量的枯草芽孢桿菌，據(jù)文獻報道，這些菌株會對植物病原菌 起到抑制作用，或是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，有一些菌株對植物還有促生作用，就是常報道的 PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)。由于其具有廣譜抗菌活性、極強的抗逆 能力、存活時間長、而且對人畜無毒害作用等優(yōu)點，這就有利于制劑的加工，而且大規(guī)模生 產(chǎn)工藝簡單，成本較低，運輸也方便，因此，枯草芽孢桿菌越來越多的被引入植病生防領(lǐng)域， 是目前一種較為理想的具有生防功能的微生物。國內(nèi)研究現(xiàn)狀河南農(nóng)科院植保所孔建等從果園中分離到的枯草芽孢桿菌B-903對多種果蔬上 的病菌有抑制作用，如番茄早疫病菌、蘋果輪紋病菌等。用于植病生防研究的枯草芽孢桿菌 還包括防治蘋果和梨采后青霉病的枯草芽孢桿菌H110，防治西瓜枯萎病菌的Bn，防治桃和 油桃褐腐病的菌株B-912，防治蘋果霉心病的BL03和XM16等。國外研究現(xiàn)狀美國Agraquest公司用枯草芽孢桿菌QST713菌株開發(fā)出活菌制劑殺菌劑 Sernade，并于2000年通過美國環(huán)保局(EPA)的登記，QST713葉面施用能防治蔬菜、櫻桃、 葡萄、葫蘆和胡桃的細菌和真菌病害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對采后水果的病原菌有抑制作用的具有廣譜抗病原真 菌活性的枯草芽孢桿菌，以及以所述枯草芽孢桿菌為活性菌的菌劑，及菌劑的應(yīng)用。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌 Bacillus substilis J18，保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為 CGMCC No :3665。一種以枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18為活性菌制成的發(fā)酵液，其是由如 下步驟制成
(1)制備活化的菌液；
(2)種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將所述種子培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液按照接種量為 3%加入到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為25°C 30°C，通氣量為0. 3 0. 6m3/h，pH值為6. 8 7. 2，流加 食用豆油消泡，不流加調(diào)節(jié)PH值的酸堿性物質(zhì)。流加培養(yǎng)基葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水IOOOmL制成混合液滅菌 后一起流加；流加時間發(fā)酵8h開始流加；發(fā)酵周期34士2h，得發(fā)酵液。在發(fā)酵液中加入防腐劑、表面活性劑、紫外防護劑。每升發(fā)酵液中加入防腐劑為凱松2g，表面活性劑為吐溫-20 10g，紫外防護劑為 山梨醇5g。一種以枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18為活性菌制成的干粉劑，其制備方 法是，將發(fā)酵液離心后去上清液得濕菌體，濕菌體與等重量的氯化鈣混合均勻，烘干至粉末 狀，得到干粉菌劑。一種以枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18為活性菌制成的被膜劑，其制備方 法是，將發(fā)酵液離心后去上清液得濕菌體，與殼聚糖溶液復(fù)配制成被膜劑?？莶菅挎邨U菌Bacillus substilis J18在水果保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用。我們從梨果表面，梨樹葉片以及梨果園土壤中分離到一株對梨采后病原菌一黑斑 病有顯著拮抗效果的一株細菌，我們把它命名為J18?？莶菅挎邨U菌Bacillus substilis J18具有以下性質(zhì)在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，J18菌落乳白色，無光澤，近圓形，邊緣不整齊，菌落隆起，表 面粗糙有褶皺。經(jīng)過革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和伴孢晶體染色，結(jié)果表明菌株J18 為革蘭氏染色陽性芽孢桿菌，芽孢中生，鞭毛周生，沒有伴孢晶體形成。J18的菌體大小為 0. 6X2. 7μπι。菌株J18的生理生化鑒定結(jié)果顯示其為好氧生長；接觸酶、明膠水解、淀粉水解、 硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、葡萄糖產(chǎn)酸和甘露醇產(chǎn)酸等反應(yīng)陽性；噴哚試驗、甲基紅反應(yīng)、 H2S產(chǎn)生試驗、酪氨酸水解等反應(yīng)為陰性；最高生長溫度55°C，能在10% NaCl及pH5. 7條 件下生長，以上特征符合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中關(guān)于枯草芽孢桿菌的描述。經(jīng)過進一步的分子生物學鑒定，J18的16S rDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行 同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌有99%的同源性。利用DNAMAN將測序結(jié)果與同源性 相近的菌株進行多重序列比較，并做進化樹分析，進一步確定其分類地位。根據(jù)細菌分類標 準，結(jié)合菌株J18形態(tài)特征、生理生化特征，將菌株J18鑒定為枯草芽孢桿菌。氯化鈣和具有良好的自發(fā)成膜性的殼聚糖處理采后水果不僅能保持梨果較高的 硬度和V。含量，降低梨果的呼吸強度和失水率，減少果實的底物消耗，，有效地抑制了果實 的衰老，提高梨的貯藏品質(zhì)。同時能高效抑制病原微生物的繁殖和生長，降低果實病害的發(fā) 生。因此采用氯化鈣和殼聚糖與拮抗菌J18發(fā)酵液復(fù)配的方式使用。本發(fā)明的有益效果是，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J18的發(fā)酵劑、干粉劑、 被膜劑對梨采后黑斑病有顯著的防治效果，同時對梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黃瓜鐮刀霉、棉花黃萎病、小麥赤霉病、玉米小斑病等都有顯著的防治效果，因此，枯草芽孢桿 菌J18是一株對水果和農(nóng)作物病害有廣譜抗性的拮抗菌。
具體實施例方式實施例1一種枯草芽孢桿菌，其特征在于其命名為枯草芽孢桿菌Bacillus substilisJIS, 在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏名稱為中國普通微生物菌種保藏管理中心， 保藏編號為CGMCC No :36650J18微生物發(fā)酵液的生產(chǎn)方法(1)種子活化將枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18菌株從保存的甘油菌轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C、150 250r/min培養(yǎng)18h。取培養(yǎng)好的菌懸液稀釋，均勻涂 布到LB固體平板培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培 養(yǎng)基試管中，300C、150 250r/min培養(yǎng)過夜，取5mL培養(yǎng)好的菌懸液轉(zhuǎn)接到裝有150mL LB 液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中置搖床30°C振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 250r/min。所述LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水1000mL。(2)種子培養(yǎng)將活化的菌懸液接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 250r/min，30°C搖 床培養(yǎng)16h。(3)發(fā)酵培養(yǎng)使用20L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵。裝料系數(shù)0.6，接種量為1%，發(fā) 酵溫度30°C，通氣量0. 3m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速150 250r/min，溶氧(DO)保持在75%，pH值為 6. 8 7. 2，流加食用豆油以消除氣泡，不流加調(diào)節(jié)pH值的酸堿性物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸銨20g， 7jC 1 OOOmL。流加培養(yǎng)基葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水IOOOmL制成混合液滅菌
后一起流加。流加時間發(fā)酵8h開始流加；發(fā)酵周期32h ；得到的發(fā)酵液芽孢濃度約為3 X 109cfu/mL。在每升發(fā)酵液中加入防腐劑凱松2g、表面活性劑吐溫-20 10g、紫外防護劑山梨 醇10g，得到發(fā)酵劑，這樣使較低濃度的發(fā)酵液最大限度發(fā)揮拮抗作用，從而節(jié)約成本，并且 有利于發(fā)酵液在外界環(huán)境中保持穩(wěn)定性。應(yīng)用時，發(fā)酵劑用水稀釋300 1000倍，噴施到果實上。干粉劑的制備方法將用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液12000r/min離心20min，棄上清，菌體加入無 菌水懸浮混勻，再12000r/min離心15min，棄上清得濕菌體。濕菌體稱重后，稱取等重量 的氯化鈣，氯化鈣緩慢加入濕菌體中，邊加邊攪拌，直至均勻，在真空干燥箱中于50°C烘干 30min至粉末狀，得到干粉菌劑。每克干粉菌劑有IX IO11個芽孢。應(yīng)用時，加水稀釋至5000 10000倍。(3)被膜劑將用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液12000r/min離心20min，棄上清，菌體加入無菌水懸浮混勻，再12000r/min離心15min，棄上清得濕菌體。濕菌體與濃度為的殼聚糖溶液(用醋酸調(diào)至PH6. 0)復(fù)配成濃度為1 X IO7CfuAiL的菌懸液，制成被膜劑。應(yīng)用時，被膜劑可噴施或浸果使用。能有效降低了拮抗菌的使用濃度，節(jié)約成本。實施例2J18微生物發(fā)酵液的生產(chǎn)方法(1)種子活化將枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18菌株從保存的甘油菌轉(zhuǎn) 接于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C、150 250r/min培養(yǎng)18h。取培養(yǎng)好的菌懸液稀釋，均勻涂 布到LB固體平板培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，用牙簽挑單菌落再次接種于LB液體培 養(yǎng)基試管中，30°C、150 250r/min培養(yǎng)過夜，取5mL培養(yǎng)好的菌懸液轉(zhuǎn)接到裝有150mL LB 液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中置搖床30°C振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 250r/min。所述LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水1000mL。(2)種子培養(yǎng)將活化的菌懸液接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 250r/min，30°C搖 床培養(yǎng)16h。(3)發(fā)酵培養(yǎng)使用20L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵。裝料系數(shù)0.6，接種量為3%，發(fā) 酵溫度25°C，通氣量0. 6m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速150 250r/min，溶氧(DO)保持在75%，pH值為 6. 8 7. 2，流加食用豆油以消除氣泡，不流加調(diào)節(jié)pH值的酸堿性物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨30g，酵母浸膏30g，硫酸銨20g， 7jC 1 OOOmL。流加培養(yǎng)基葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水IOOOmL制成混合液滅菌
后一起流加。流加時間發(fā)酵8h開始流加；發(fā)酵周期36h ；得到的發(fā)酵液芽孢濃度約為3 X 109cfu/mL。在每升發(fā)酵液中加入防腐劑凱松2g、表面活性劑吐溫-20 10g、紫外防護劑山梨 醇10g，得到發(fā)酵劑，這樣使較低濃度的發(fā)酵液最大限度發(fā)揮拮抗作用，從而節(jié)約成本，并且 有利于發(fā)酵液在外界環(huán)境中保持穩(wěn)定性。應(yīng)用時，發(fā)酵劑用水稀釋300 1000倍，噴施到果實上。干粉劑的制備方法將用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液12000r/min離心20min，棄上清，菌體加入無 菌水懸浮混勻，再12000r/min離心15min，棄上清得濕菌體。濕菌體稱重后，稱取等重量 的氯化鈣，氯化鈣緩慢加入濕菌體中，邊加邊攪拌，直至均勻，在真空干燥箱中于50°C烘干 30min至粉末狀，得到干粉菌劑。每克干粉菌劑有IX IO11個芽孢。應(yīng)用時，干粉劑加水稀釋至5000 10000倍。(3)被膜劑將用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液12000r/min離心20min，棄上清，菌體加入無 菌水懸浮混勻，再12000r/min離心15min，棄上清得濕菌體。濕菌體與濃度為的殼聚糖 溶液(用醋酸調(diào)至PH6.0)復(fù)配成濃度為IX IO7CfuAiL的菌懸液，制成被膜劑。應(yīng)用時，被膜劑可噴施或浸果使用。能有效降低了拮抗菌的使用濃度，節(jié)約成本。枯草芽孢桿菌Bacillus substilis J18對梨采后黑斑病的防效
以實施例1所制的發(fā)酵液，采收后的梨果上噴施J18發(fā)酵液，常溫下放置30天梨果的發(fā)病率僅為16. 44% ；噴施干粉制備的藥液后，常溫下放置30天梨果的發(fā)病率為 13. 75%;以接種無菌水為對照，梨果的發(fā)病率達到89. 75%;J18與成膜性良好、具有很好保 鮮效果的殼聚糖復(fù)配，常溫下30天后發(fā)病率僅為6. 37%，以無任何處理的梨果為對照，常 溫下30天后梨果的發(fā)病率為90. 38%。同時，濃度為IXlO8CfuAiL的J18菌懸液還有對梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯 萎病、黃瓜鐮刀霉、棉花黃萎病、小麥赤霉病、玉米小斑病有顯著的防治效果。其中對梨輪 紋病的防效為81. 45%，對葡萄灰霉病的防效為75.9%，對西瓜枯萎病的防效為74. 77%, 對黃瓜鐮刀霉的防效為81. 92%，對棉花黃萎病的防效為70. 29%，對小麥赤霉病的防效為 74. 27%，對玉米小斑病的防效為79. 1%。
權(quán)利要求
一種枯草芽孢桿菌，其特征在于其命名為枯草芽孢桿菌Bacillus substilisJ18，在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No3665。
2.一種以權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌為活性菌制成的發(fā)酵液，其特征在于其是由 如下步驟制成(1)制備活化的菌液；(2)種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將所述種子培養(yǎng)得到的種子培養(yǎng)液按照接種量為 3%加入到發(fā)酵 培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為25°C 30°C，通氣量為0. 3 0. 6m3/h,pH值為6. 8 7. 2，流加食用 豆油消泡，不流加調(diào)節(jié)PH值的酸堿性物質(zhì)。流加培養(yǎng)基葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水1000mL制成混合液滅菌后一 起流加；流加時間發(fā)酵8h開始流加；發(fā)酵周期34士2h，得發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵液，其特征在于所述發(fā)酵液中加入防腐劑、表面活性劑、 紫外防護劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵液，其特征在于所述每升發(fā)酵液中加入防腐劑凱松2g， 表面活性劑吐溫-20 10g，紫外防護劑山梨醇5g。
5.一種以權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌為活性菌制成的干粉劑，其特征在于其制備 方法是，將權(quán)利要求2所述的發(fā)酵液離心后去上清液得濕菌體，濕菌體與等重量的氯化鈣 混合均勻，烘干至粉末狀，得到干粉菌劑。
6.一種以權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌為活性菌制成的被膜劑，其特征在于其制備 方法是，將與權(quán)利要求2所述的發(fā)酵液離心后去上清液得濕菌體，與殼聚糖溶液復(fù)配制成 被膜劑。
7.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在水果保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用在水果保鮮領(lǐng)域中的枯草芽孢桿菌，及以此為活性物質(zhì)的菌劑，本發(fā)明涉及的枯草芽孢桿菌命名為Bacillussubstilis J18，現(xiàn)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No3665，菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后，制成發(fā)酵劑，發(fā)酵劑分別與氯化鈣和殼聚糖溶液混合制成干粉劑和被膜劑，其對梨采后黑斑病同時對梨輪紋病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有顯著的防治效果，枯草芽孢桿菌J18是一株對水果和農(nóng)作物病害有廣譜抗性的拮抗菌。
文檔編號C12N1/20GK101870959SQ201010197538
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者關(guān)軍鋒, 宋水山, 宋聰, 張霞, 趙芊, 邱健, 馬宏, 黃媛媛 申請人:河北省科學院生物研究所;河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所