專(zhuān)利名稱(chēng)：一種敲除分枝桿菌ksdD基因的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種敲除分枝桿菌ksdD基因的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程中分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分枝桿菌(Mycobacterium)能將植物甾醇轉(zhuǎn)化為藥物中間體4_烯-雄甾_3， 17-二酮(AD)和1，4_ 二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)，其中由ksdD基因編碼的3-甾 酮-Δ L脫氫酶(KSDD)是AD轉(zhuǎn)化為ADD的關(guān)鍵酶。雄甾-4-烯-3，17-二酮(androst-4-end-3，17_dione，AD)和雄甾_1，4_ 二烯-3， 17-二酮(androst-l，4-end-3，17-dione，ADD)是制備留體藥物的重要中間體，留體藥物 具有很強(qiáng)的抗感染、抗過(guò)敏、抗病毒和抗休克等藥理作 用。近年來(lái)，留體藥物在醫(yī)療領(lǐng)域的 應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，被廣泛用于治療風(fēng)濕病、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移 植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、老年性疾病等。傳統(tǒng)生產(chǎn)中AD(D)主要以薯 蕷皂素為原料利用化學(xué)方法合成，由于化學(xué)合成工藝路線繁長(zhǎng)、“三廢”污染嚴(yán)重，上世紀(jì)60 年代人們開(kāi)始采用微生物轉(zhuǎn)化廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)的留醇生產(chǎn)AD(D)。微生物法具有 成本低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此越來(lái)越受到人們的重視。國(guó)外對(duì)微生物法生產(chǎn)AD(D)的 研究起步較早，20世紀(jì)50年代，美國(guó)Up John公司首先利用側(cè)鏈上有雙鏈的大豆留醇為原 料生產(chǎn)出AD和ADD。20世紀(jì)70年代初，日本的研究學(xué)者有馬啟利用微生物降解膽固醇成 功生產(chǎn)了 ADD。2002年Dias等將從油脂脫臭蒸餾物中富集的植物留醇混合物用分枝桿菌 NRRLB-3805處理得到AD和ADD，且收率較高。國(guó)內(nèi)的研究起步較晚，但已經(jīng)取得了一定的 成績(jī)。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中由于AD和ADD性質(zhì)相近，分離純化十分困難，獲得單一的AD (D) 成本很高，因此獲得單產(chǎn)AD(D)菌株成為國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者追逐的目標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道表明植物 甾醇通過(guò)C17邊鏈降解后首先獲得AD，進(jìn)一步由3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KSDD)脫氫生成ADD。 近年來(lái)隨著一些微生物編碼KSDD的基因ksdD全序列的陸續(xù)公布，利用基因工程手段研究 KSDD酶學(xué)性質(zhì)以及AD合成ADD的代謝機(jī)理成為新的研究方向。本發(fā)明首先構(gòu)建了分枝桿菌ksdD基因敲除載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法實(shí)現(xiàn)了分枝桿 菌中ksdD基因的敲除。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的一株分枝桿菌，通過(guò)構(gòu)建ksdD基因敲除載 體等分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)其ksdD基因敲除，利用篩選培養(yǎng)基篩選得到一株ksdD基因的轉(zhuǎn) 化子，并對(duì)其KSDD酶活以及AD(D)的產(chǎn)量進(jìn)行研究。本發(fā)明的技術(shù)方案根據(jù)NCBI公布的M. neoaurum strain NWIBL-OlksdD基因全 序列設(shè)計(jì)引物 Fl、R1，上游引物 Fl (EcoR I ) 5' -accg gaattc gtgttctacatgactgcc，下 游引物 Rl (Hind III) 5' -accg aagctt tcaggcctttccagc。以分枝桿菌染色體 DNA 為模 板，以Fl、Rl為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出ksdD全序列，將PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體16°C連接過(guò)夜，熱擊轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109，使用氨芐青霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶 切鑒定和序列分析。根據(jù)載體pET28a的卡那霉素抗性基因序列，設(shè)計(jì)引物F2、R2，上游引 物F2(Xho I ) 5' -accg ctcgag gtatctcagttcggtgtag,下游弓|物 R2 (Xho I ) 5' accg ctcgag ggtggcacttttcggggaaatg。以質(zhì)粒pET28a為模板，F(xiàn)2、R2為引物，PCR擴(kuò)增卡那抗性 基因(Km)。將質(zhì)粒T-ksdD與基因Km分別用Xho I酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4DNA Ligase 16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，使用氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，并 對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，其中重組質(zhì)粒即為基因敲除載體T-ksdD: :Km。 分枝桿菌電轉(zhuǎn)化方法分枝桿菌細(xì)胞壁含有大量的脂類(lèi)，影響電轉(zhuǎn)化效率，所以需 在培養(yǎng)基中添加一定量氨芐青霉素以抑制細(xì)胞壁的生長(zhǎng)。由于分枝桿菌生長(zhǎng)時(shí)間緩慢，一 般搖瓶培養(yǎng)2-3d才能到達(dá)對(duì)數(shù)期，制備感受態(tài)時(shí)需取0D600 = 0. 6-0. 8的菌體。電轉(zhuǎn)化前 需用10%甘油將菌體洗兩次，8000r/min離心，最后將菌體重懸于200 μ L 10%甘油中。電 轉(zhuǎn)化條件分別為，電壓2. OKV,電轉(zhuǎn)化時(shí)間5ms。在研究中發(fā)現(xiàn)15 μ g/mL的卡那霉素是菌株 的最小抑菌濃度，所以以15 μ g/mL卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。酶活測(cè)定方法取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液IOOmL,用2mL含0. IgAD的二甲基亞砜誘 導(dǎo)。4°C，8000r/min離心5min收集菌體，用50mL pH 7. 2的PBS緩沖液洗滌二次，重懸于2 倍體積的該緩沖液中。冰浴中50%功率超聲破碎，工作Is間歇3s，工作時(shí)間7min。14000r/ min離心30min獲得上清液，取0. 5mL上清液，加入含0. Img PMS、2mg細(xì)胞色素C、0. 02mL含 10mg/mLAD的乙醇、0. 05mol/L pH 7. 2的PBS緩沖液，總反應(yīng)體系達(dá)3mL。30°C反應(yīng)lOmin， 檢測(cè)550nm波長(zhǎng)下吸光值變化情況。將一分鐘內(nèi)還原Iymol細(xì)胞色素C所需的酶量定義 為一個(gè)酶活單位U。所述培養(yǎng)基組成LB培養(yǎng)基(％):蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1. O ；種子培養(yǎng)基 (% )蛋白胨1. 0，酵母粉0. 3，牛肉膏0. 3，甘油1. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基(％ )大豆甾醇1. 0，葡 萄糖 1. 0，(NH4)2HPO4 0. 35，K2PO4O. 05，MgSO4O. 05，MnCl25X 1(T4，Tween800. 4，用 10% NaOH 調(diào)節(jié)pH至7. O。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)手段構(gòu)建基因敲除載體，將本實(shí)驗(yàn)室 保藏的一株能夠轉(zhuǎn)化留醇為AD(D)的菌株ksdD基因敲除，使其轉(zhuǎn)化AD能力降低，AD產(chǎn)量 得到了積累。該研究證實(shí)了 ksdD基因編碼的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KSDD)是AD轉(zhuǎn)化ADD 的關(guān)鍵酶，為進(jìn)一步研究KSDD酶學(xué)性質(zhì)及闡明AD合成ADD的代謝機(jī)理奠定基礎(chǔ)。


圖1分枝桿菌ksdD基因敲除載體T-ksdD Km的構(gòu)建；圖2KsdD全序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 :DL2000DNA Marker2 =KsdD 基因 PCR 產(chǎn)物；圖3卡那抗性基因Km PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 :Km 基因 PCR 產(chǎn)物2 :DL2000DNAMarker ；圖4T_ksdD: :Km基因敲除載體驗(yàn)證1 λ /Hind III DNA marker 2 :T_ksdD: :Km 質(zhì)粒 EcoR I /Hind III雙酶切3 :2000bp DNA ladder 4 :T_ksdD: :Km 質(zhì)粒 Xho I 單酶切；圖5KsdD基因缺失轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
Ml λ /Hind III DNA marker M2 :DL2000DNA marker1 原始菌株ksdD基因PCR產(chǎn)物2 =KsdD缺失轉(zhuǎn)化子KsdD: :Km基因PCR產(chǎn)物3 原始菌株Km基因PCR產(chǎn)物4 =KsdD缺失轉(zhuǎn)化子Km基因PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :ksdD基因敲除載體T-ksdD: :Km的構(gòu)建載體的構(gòu)建示意圖如圖1所示，根據(jù)NCBI公布的M.neoaurum strainNWIBL-OlksdD基因全序列設(shè)計(jì)引物Fl、Rl0以分枝桿菌染色體DNA為模板，以F1、 Rl為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出ksdD全序列，見(jiàn)圖2。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體16°C連接過(guò) 夜，熱擊轉(zhuǎn)化E. coli JM109，使用氨芐青霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切 鑒定和序列分析。根據(jù)載體pET28a的卡那霉素抗性基因序列，設(shè)計(jì)引物F2、R2。以質(zhì)粒pET28a為模 板，F(xiàn)2、R2為引物，PCR擴(kuò)增卡那抗性基因(Km)，見(jiàn)圖3。將質(zhì)粒T_ksdD與基因Km分別用 Xho I酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4DNALigaSe 16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109，使用氨芐 青霉素和卡那霉素雙抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，其中重組質(zhì)粒即為基 因敲除載體T-ksdD: :Km。實(shí)施例2 :ksdD基因敲除載體T-ksdD: :Km的驗(yàn)證載體的構(gòu)建示意圖如圖1所示，以分枝桿菌染色體DNA為模板，分別以F1、R1為引 物，通過(guò)PCR擴(kuò)增ksdD基因全序列。將目的基因與pMD18-T載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒T_ksdD。 以質(zhì)粒pET28a為模板，F(xiàn)2、R2為引物，PCR擴(kuò)增卡那抗性基因(Km)。將擴(kuò)增出的大小約為 1.4kb卡那霉素抗性基因Km在Xho I位點(diǎn)插入質(zhì)粒T-ksdD。重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I酶切釋放 4. 4kb和1. 4kb大小片段，分別對(duì)應(yīng)基因片段Km和質(zhì)粒T-ksdD大小，見(jiàn)圖4。重組質(zhì)粒經(jīng) EcoR I和Hind III酶切釋放3. Ikb和2. 7kb片段，分別對(duì)應(yīng)基因片段ksdD: :Km和T載體大 小，見(jiàn)圖4。以上結(jié)果說(shuō)明卡那霉素抗性基因已成功插入T-ksdD質(zhì)粒中。實(shí)施例3 分枝桿菌電轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子鑒定通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將基因元件ksdD: :Km導(dǎo)入分枝桿菌，在卡那抗性平板上篩選陽(yáng) 性轉(zhuǎn)化子。首先對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型驗(yàn)證，在卡那霉素抗性平板上，原始菌株無(wú)法生長(zhǎng)， 而轉(zhuǎn)化子則生長(zhǎng)良好。其次對(duì)其進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以Fl、Rl為引物，轉(zhuǎn)化子染色體為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到對(duì)應(yīng)ksdD: :Km大小的3. Ikb片段，而原始菌株只能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)基因ksdD 大小的1. 7kb片段；同時(shí)以F2、R2為引物，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出大小1. 4kb的Km基因片段， 而原始菌株無(wú)法擴(kuò)增出該片段(見(jiàn)圖5)，證明基因元件ksdD: :Km已經(jīng)成功整合在分枝桿菌 染色體上即基因ksdD已經(jīng)缺失。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)化子KSDD酶活測(cè)定與留醇轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取0. 5mL轉(zhuǎn)化子細(xì)胞破碎液上清用于酶活檢測(cè)，以未加底物AD的反應(yīng)體系作為空 白，同時(shí)以原始菌株作為對(duì)照。經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的比酶活為15.6mu/mg，而原始菌株比酶活為 105. 4mu/mg，轉(zhuǎn)化子與原始菌株相比，其KSDD酶活性下降了 85%。在研究轉(zhuǎn)化子對(duì)留醇的 轉(zhuǎn)化情況時(shí)，以原始菌株作為對(duì)照。發(fā)酵72h后，對(duì)照組AD產(chǎn)量達(dá)最高，為0. 167g/L，而轉(zhuǎn) 化子到98h后AD產(chǎn)量才達(dá)最高值0. 336g/L。發(fā)酵168h后，ADD產(chǎn)量都達(dá)到最高值，此時(shí)對(duì) 照組中ADD產(chǎn)量為1.095g/L，轉(zhuǎn)化子中ADD產(chǎn)量為0.709g/L。兩者相比較，轉(zhuǎn)化子AD產(chǎn)量提高了 1倍，而AD D產(chǎn)量下降了 35.2%。
權(quán)利要求
構(gòu)建了分枝桿菌ksdD基因敲除載體T-ksdD::Km，其特征是以能夠轉(zhuǎn)化甾醇產(chǎn)生AD(D)的分枝桿菌染色體為模板PCR擴(kuò)增出ksdD基因，連接PMD18-T載體后獲得T-ksdD質(zhì)粒，將以PET28a質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出的卡那抗性基因Km插入ksdD基因中問(wèn)獲得基因敲除質(zhì)粒T-ksdD::Km。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中構(gòu)建的重組敲除質(zhì)粒T-ksdD::Km利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化分枝桿 菌。分枝桿菌細(xì)胞壁含有大量的脂類(lèi)，影響電轉(zhuǎn)化效率，所以需在培養(yǎng)基中添加一定量氨芐 青霉素以抑制細(xì)胞壁的生長(zhǎng)。其特征是需用10%甘油將菌體洗兩次，8000r/min離心，最后 將菌體重懸于200yL 10%甘油中。電轉(zhuǎn)化條件分別為，電壓2. 0KV，電轉(zhuǎn)化時(shí)間5ms。以 15 μ g/mL卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
一種敲除分枝桿菌ksdD基因的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程中分子生物學(xué)領(lǐng)域。分枝桿菌(Mycobacterium)能將植物甾醇轉(zhuǎn)化為藥物中間體4-烯-雄甾-3，17-二酮(AD)和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)，其中由ksdD基因編碼的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KSDD)是AD轉(zhuǎn)化為ADD的關(guān)鍵酶。本發(fā)明以本實(shí)驗(yàn)室保藏的一株分枝桿菌為出發(fā)菌株，首先擴(kuò)增出長(zhǎng)度約1.7kb編碼KSDD的ksdD基因全序列，在基因內(nèi)部插入一段來(lái)源于質(zhì)粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km)，將得到的基因元件ksdD::Km電轉(zhuǎn)化分枝桿菌，通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得穩(wěn)定遺傳的ksdD基因缺失重組轉(zhuǎn)化子。經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的比酶活為15.6mu/mg，而原始菌株比酶活為105.4mu/mg，轉(zhuǎn)化子與原始菌株相比，其KSDD酶活性下降了85％。在研究轉(zhuǎn)化子對(duì)甾醇的轉(zhuǎn)化情況時(shí)，以原始菌株作為對(duì)照。兩者相比較，轉(zhuǎn)化子AD產(chǎn)量提高了1倍，而ADD產(chǎn)量下降了35.2％。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101864441SQ20101017634
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者夏海鋒, 田靈芝, 韓冷, 饒志明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)