專利名稱：三苯基甲烷類染料脫色酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三苯基甲烷類染料脫色酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三苯基甲烷染料包括堿性、酸性、溶劑染料等，廣泛應(yīng)用于紡織印染、醫(yī)藥、生物染 色、造紙等領(lǐng)域。由于其生物毒性及致癌、致畸、致突變的三致性對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，引起 了廣泛的關(guān)注?？兹甘G是三苯基甲烷類染料中的一種代表，它是一種工業(yè)染料，又是一種 殺真菌劑，對(duì)魚類水霉病、原蟲病等的控制非常有效，因此，長期以來孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖 業(yè)中的使用極為普遍。生物方法是目前去除染料污染較為有效的方法，具有無毒、無殘留、無二次污染的 優(yōu)勢。將固定化脫色酶應(yīng)用于含染料廢水的脫色及循環(huán)利用時(shí)，無需添加供菌體生長的底 物，因而具有美好的應(yīng)用潛力。現(xiàn)在已有將固定化的偶氮還原酶應(yīng)用于含偶氮染料的印染 廢水處理的相關(guān)報(bào)道。目前，國內(nèi)外研究者已發(fā)現(xiàn)多種可降解三苯基甲烷類染料的脫色酶 及并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了研究。真菌中的木質(zhì)素酶系、真菌和分枝桿菌中的細(xì)胞色素P450 單加氧酶、檸檬酸桿菌中的三苯基甲烷類染料還原酶TMR、嗜水氣單胞菌中的三苯基甲烷 類染料脫色酶TpmD等脫色酶及各種脫色基因已成為研究熱點(diǎn)。真菌中的Phanerochaete chrysosporium能夠利用其木質(zhì)素過氧化物酶以逐步去甲基化的方式對(duì)三苯基甲烷染料結(jié) 晶紫進(jìn)行脫色與降解；Curminghamella elegans通過細(xì)胞中某種未知酶的作用以去甲基化 的方式對(duì)孔雀石綠進(jìn)行脫色與降解，且有P450系統(tǒng)的參與。而細(xì)菌中催化三苯基甲烷類染 料脫色的關(guān)鍵酶(或酶系)到目前為止仍不清楚。深入研究細(xì)菌中三苯基甲烷類染料脫色酶并探討其脫色的酶學(xué)特性和機(jī)制，可以 利用基因工程技術(shù)將脫色酶轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移到特定的載體中，進(jìn)行高效表達(dá)，從而為利用固定 化脫色酶處理工業(yè)廢水的工藝設(shè)計(jì)提供科學(xué)參考，在該領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高活力的三苯基甲烷類染料脫色酶。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供表達(dá)上述三苯基甲烷類染料脫色酶的基因。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述三苯基甲烷類染料脫色酶的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種三苯基甲烷類染料脫色酶(即二氫嘧啶酶TDE)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，它包含了 479個(gè)氨基酸。表達(dá)上述三苯基甲烷類染料脫色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，它 包含了 1440bp的堿基。上述三苯基甲烷類染料脫色酶的純化方法，其特征在于它包括如下步驟(1)硫酸銨沉淀
(la)將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體，超聲破碎后離心取上清液；(Ib)將步驟(Ia)得到的上清液進(jìn)行硫酸銨沉淀，即在磁力攪拌器上不斷攪拌條 件下，緩慢加入硫酸銨固體至一定飽和度，繼續(xù)攪拌30min，離心收集在40 50%的硫酸銨 飽和濃度段得到的蛋白沉淀，將得到蛋白沉淀重溶于PH 8.0、20mM Tris-HCl中，再透析去 除蛋白溶液中的硫酸銨；(2)陰離子交換(2a)DEAE陰離子交換柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，將步驟(Ib)透析后得 到的蛋白溶液過DEAE陰離子交換柱，用pH 8.0、20mM Tris-HCl沖洗直至蛋白檢測器在A28tl 處為 0. 05，流速為 1. Oml · rnirT1 ；(2b)將DEAE陰離子交換柱用0 0.5M NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為 1.0ml · rnirT1，收集濃縮0.23 0.26M NaCl洗脫范圍內(nèi)得到的蛋白溶液，重溶于pH 8.0、 20mMTris-HCl中，再透析除去蛋白溶液中的NaCl ；(3)凝膠過濾層析(3a)凝膠過濾層析柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，將步驟(2b)透析后得到 的蛋白溶液過凝膠過濾層析柱，流速為0. 5ml · mirT1，蛋白檢測器在A28tl處有蛋白吸收峰的 位置，以2ml為單位收集蛋白溶液，以孔雀石綠為底物，測定所收集各蛋白溶液的酶活，根 據(jù)酶活強(qiáng)弱，收集得到具有脫色活性的過柱后蛋白溶液；(3b)將步驟(3a)中得到的具有脫色活性的蛋白溶液各取15 20 μ 1分別進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，根據(jù)電泳譜帶結(jié)果，選擇電泳圖譜簡單(即電泳條帶較 單一)對(duì)應(yīng)的具有脫色活性的蛋白溶液，合并，超濾濃縮。 上述三苯基甲烷類染料脫色酶在去除三苯甲烷染料中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明的三苯基甲烷類染料脫色酶對(duì)三苯基甲烷類染料具有高效的脫 色活性，具有巨大的應(yīng)用前景。三苯基甲烷類染料作為一種廣泛使用的染料，具有“三致” 效應(yīng)，對(duì)人們的日常生活構(gòu)成較大負(fù)面影響。盡管現(xiàn)在對(duì)染料廢水脫色有各種物理、化學(xué)方 法，但由于其存在的種種潛在危害，人們對(duì)采用生物方法處理染料廢水越來越關(guān)注。近年 來，已發(fā)現(xiàn)多種白腐真菌、霉菌、酵母菌等具有三苯基甲烷類染料脫色活性，國內(nèi)外對(duì)三苯 基甲烷類染料脫色酶研究集中于真菌的木質(zhì)素酶系、細(xì)胞色素Ρ450單加氧酶等。自上世紀(jì) 80年代,Glenn等發(fā)現(xiàn)白腐真菌黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium對(duì)一些聚合 染料具有脫色降解作用以來，白腐真菌對(duì)染料的脫色降解已逐漸成為研究熱點(diǎn)。但是國內(nèi) 外對(duì)細(xì)菌染料脫色酶的研究還很少，因此，我們所發(fā)現(xiàn)的三苯基甲烷類染料脫色酶將為染 料脫色提供一種新的途徑。Pseudomonas putida KT2440所產(chǎn)生的二氫嘧啶酶，對(duì)三苯基甲 烷類染料_孔雀石綠具有很強(qiáng)的脫色活性，為今后大量生產(chǎn)該脫色酶提供了有利條件。通 過選擇合適的載體質(zhì)粒，可以使該基因在某些環(huán)境保護(hù)用菌種中表達(dá)，為構(gòu)建多功能降解 菌提供理想的材料，改善脫色菌株的性能和脫色能力，降低生產(chǎn)和使用成本。


圖1為通過DEAE陰離子交換柱分離，在0. 23 0. 26M NaCl洗脫范圍內(nèi)得到具有 脫色活性的洗脫峰。
圖2為通過凝膠過濾層析柱分離，蛋白檢測器實(shí)時(shí)檢測過柱后溶液在A28tl處的蛋 白吸收峰。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例中，蛋 白脫色活性的檢測方法如下酶活測定在45°C條件下進(jìn)行，在20mM Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液中建立酶活常數(shù) 測定體系800 μ 1，體系中含適量分離純化得到的TDE酶、20 μ M底物、0. ImM NADH0加入適 量酶后，立即在分光光度計(jì)上檢測底物在初始Imin內(nèi)，相應(yīng)最大吸收波長處OD值的下降。 以不含脫色酶的反應(yīng)混合液為對(duì)照。以每分鐘催化1. 0 μ mol底物染料所需要的酶量為1個(gè)酶活單位⑶。實(shí)施例1:蛋白的純化。1、硫酸銨沉淀(la) 30°C條件下，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) KT2440于LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)36小時(shí)，15000\8離心5!1^11收集菌體，菌體用201111 Tris-HCl(pH 8.0)洗滌一次后再 離心，然后將菌體重懸于20mM Tris-HCKpH 8. 0)，冰上超聲破碎后，20000 X g高速離心 30min，取上清液。(Ib)將步驟(Ia)得到的上清液在磁力攪拌器上溫和攪拌，同時(shí)加入固體硫酸銨 至不同飽和濃度段沉淀蛋白質(zhì)(該過程控制在5 IOmin內(nèi)完成)，加至各相應(yīng)濃度后攪拌 30min，20000Xg高速離心30min，將離心后所得的蛋白沉淀重溶于適量20mMTris_HCl (pH 8. 0)中，同時(shí)測定不同硫酸銨濃度段相應(yīng)沉淀蛋白的脫色活性，取具有較高脫色活性的硫 酸銨濃度段(40 50%飽和硫酸銨濃度段)的蛋白質(zhì)，將該濃度段離心后得到的蛋白質(zhì)沉 淀重溶于適量20mM Tris-HCKpH 8.0)中，再透析除去蛋白溶液中高濃度的硫酸銨。2、陰離子交換(2a) DEAE陰離子交換柱(DEAE Sefinose FF，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司銷售公司，2. 5cmX20cm)用20mM Tris-HCl (pH 8.0)平衡后，將步驟(Ib)透析后得到的 蛋白溶液過DEAE陰離子交換柱，根據(jù)不同蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)不同初步分離蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)溶 液進(jìn)柱后，用20mM Tris-HCKpH 8.0)沖洗直至蛋白檢測儀(HD-4電腦核酸蛋白檢測儀，上 海滬西分析儀器廠)在A28tl處為0. 05，，控制流速為1.0ml 'HiirT1t5(2b)將DEAE陰離子交換柱用0 0. 5M NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，控制流速為 1. Oml · mirT1，實(shí)時(shí)測定蛋白檢測儀280nm處各洗脫峰相應(yīng)的酶活，在0. 23 0. 26M NaCl 洗脫范圍內(nèi)得到具有脫色活性的洗脫峰(圖1)，收集濃縮該洗脫峰內(nèi)的蛋白樣品，重溶于 適量20mM Tris-HCKpH 8.0)中，再透析除去蛋白溶液中高濃度NaCl。3、凝膠過濾層析(3a)凝膠過濾層析柱(S印hacryl S-200HR，GE Healthcare，1. 5cmX 100cm)用 20mM Tris-HCKpH 8.0)平衡后，將步驟(2b)透析后得到的蛋白溶液過凝膠過濾層析柱， 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)一步分離純化蛋白質(zhì)，控制流速為0. 5ml mirT1，用蛋白檢測器實(shí) 時(shí)檢測過柱后溶液在A28tl處的吸收情況，在顯示有蛋白吸收峰的位置(圖2)，以2ml為單位收集蛋白溶液，分別測定所收集的各蛋白溶液的酶活，得到具有脫色活性的過柱后蛋白溶 液。(3b)將步驟(3a)中得到的具有較高酶活的蛋白樣品各取15 20 yl分別經(jīng) SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色及相應(yīng)脫色處理后，根據(jù)電泳條帶結(jié)果，選擇蛋白溶液較 純(即電泳譜帶單一)的具有脫色活性的蛋白溶液合并，超濾濃縮，-20°C凍存。實(shí)施例2 氨基酸序列測定。將實(shí)施例1最終制備得到的單一蛋白條帶經(jīng)Edman化學(xué)降解法進(jìn)行N末端測序， 得到該脫色酶的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。實(shí)施例3 酶活常數(shù)測定。孔雀綠、燦爛綠、結(jié)晶紫及堿性品紅的最大吸收波長分別為617nm、630nm、590nm 和 545nm。為測定該脫色酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，各底物染料的終濃度(S)設(shè)為5.0 20 yM，通過 計(jì)算各底物終濃度條件下酶活反應(yīng)的初速度(V)，由最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作
圖法求得TDE酶活常數(shù)(如表1所示)。表 1 從所得到的該三苯基甲烷類染料脫色酶對(duì)以上四種染料(孔雀石綠、燦爛綠、結(jié) 晶紫、堿性品紅)的Km數(shù)值，可以推斷出，該脫色酶對(duì)這四種三苯基甲烷類染料均有脫色活 性，其中對(duì)孔雀石綠的脫色活性最強(qiáng)，其后依次為燦爛綠、堿性品紅、結(jié)晶紫。
權(quán)利要求
一種三苯基甲烷類染料脫色酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.表達(dá)權(quán)利要求1所述的三苯基甲烷類染料脫色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。
3.權(quán)利要求1所述的三苯基甲烷類染料脫色酶的純化方法，其特征在于它包括如下步驟(1)硫酸銨沉淀(Ia)將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌 體，超聲破碎后離心取上清液；(Ib)向步驟(Ia)得到的上清液中加入硫酸銨固體，同時(shí)在磁力攪拌器上不斷攪拌，然 后離心，收集40 50%飽和硫酸銨濃度段的蛋白沉淀，將得到的蛋白沉淀重溶于pH 8. O、 20mM Tris-HCl中，再透析去除蛋白溶液中的硫酸銨；(2)陰離子交換(2a)DEAE陰離子交換柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，將步驟(Ib)透析后得到的 蛋白溶液過DEAE陰離子交換柱，用pH 8.0、20mM Tris-HCl沖洗直至蛋白檢測儀在A28tl處 為 0. 05，流速為 1. Oml · mirT1 ；(2b)將DEAE陰離子交換柱用O 0. 5M NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1. Oml -min"1, 收集濃縮在0. 23 0. 26M NaCl洗脫范圍內(nèi)得到的蛋白溶液，重溶于pH 8. 0、20mM Tris-HCl中，再透析除去蛋白溶液中的NaCl ；(3)凝膠過濾層析(3a)凝膠過濾層析柱用pH 8.0、20mM Tris-HCl平衡后，將步驟(2b)透析后得到的蛋 白溶液過凝膠過濾層析柱，流速為0. 5ml ^irT1,蛋白檢測儀在A28tl處有蛋白吸收峰的位置， 以2mL為單位收集蛋白溶液，以孔雀石綠為底物，分別測定所收集各蛋白溶液的酶活，得到 具有脫色活性的過柱后蛋白溶液；(3b)將步驟(3a)中得到的具有脫色活性的蛋白溶液各取15 20 μ 1分別進(jìn)行電泳， 根據(jù)電泳譜帶結(jié)果，選擇電泳譜帶單一的相對(duì)應(yīng)的具有脫色活性的蛋白溶液，合并，超濾濃 縮。
4.權(quán)利要求1所述的三苯基甲烷類染料脫色酶在去除三苯甲烷染料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三苯基甲烷類染料脫色酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還公開了表達(dá)上述三苯基甲烷類染料脫色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，該基因來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida KT2440)的三苯基甲烷染料脫色酶基因。本發(fā)明還公開了上述三苯基甲烷類染料脫色酶的純化方法，以及上述三苯基甲烷類染料脫色酶在去除三苯基甲烷類染料中的應(yīng)用。本發(fā)明的三苯基甲烷類染料脫色酶對(duì)三苯基甲烷類染料具有高效的脫色活性，具有巨大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/78GK101870968SQ201010175228
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者張瓊, 李麗觀, 杜宏偉, 楊柳燕, 武俊, 王曉琳, 肖 琳, 胥蘇海, 蔣麗娟 申請(qǐng)人:南京大學(xué)