專利名稱：綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的 引物。
背景技術：
隨著世界經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，能源危機與環(huán)境污染日趨嚴重，因此采用可再生能源 替代現(xiàn)有能源成為未來的發(fā)展趨勢。其中“乙醇”因低碳、清潔而備受關注，特別是利用秸 稈等可再生纖維素資源，采用微生物降解技術將纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇是目前最有發(fā)展前景的 方法
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲及其編碼的氨基酸序列和用 于克隆該基因的引物，增加內(nèi)切葡聚糖酶的種類，拓寬了內(nèi)切葡聚糖酶的獲得途徑，為將來 通過基因改造技術提高纖維素降解率提供了物質(zhì)基礎。本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲的核苷酸序列如下所示 ATTTAAGGATCTAAGCCCCATCGATATGAAGTCCTGCGCCATTCTTGCAGCCCTTGGCTGTCTTGCCGGGAG
CGTTCTCGGCCATGGACAAGTCCAAAACTTCACGATCAATGGACAATACAATCAGGGTTTCATTCTCGATTACTACT ATCAGAAGCAGAATACTGGTCACTTCCCCAACGTTGCTGGCTGGTACGCCGAGGACCTAGACCTGGGCTTCATCTCC CCTGACCAATACACCACGCCCGACATTGTCTGTCACAAGAACGCGGCCCCAGGTGCCATTTCTGCCACTGCAGCGGC CGGCAGCAACATCGTCTTCCAATGGGGCCCTGGCGTCTGGCCTCACCCCTACGGTCCCATCGTTACCTACGTGGCTG AGTGCAGCGGATCGTGCACGACCGTGAACAAGAACAACCTGCGCTGGGTCAAGATTCAGGAGGCCGGCATCAACTAT AACACCCAAGTCTGGGCGCAGCAGGATCTGATCAACCAGGGCAACAAGTGGACTGTGAAGATCCCGTCGAGCCTCAG GCCCGGAAACTATGTCTTCCGCCATGAACTTCTTGCTGCCCATGGTGCCTCTAGTGCGAACGGCATGCAGAACTATC CTCAGTGCGTGAACATCGCCGTCACAGGCTCGGGCACGAAAGCGCTCCCTGCCGGAACTCCTGCAACTCAGCTCTAC AAGCCCACTGACCCTGGCATCTTGTTCAACCCTTACACAACAATCACGAGCTACACCATCCCTGGCCCAGCCCTGTG GCAAGGCTAGATCCAGG。本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲全長為782bp，在第26bp處有 起始密碼子ATG，在第775bp處有終止密碼子TAG，具有750bp完整的開放閱讀框。本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg _碼的氨基酸序列如下所示 MKSCAILAALGCLAGSVLGHGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGffYAEDLDLGFISPDQYT
TPDIVCHKNAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYVAECSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAGINYNTQVff AQQDLINQGNKWTVKIPSSLRPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIAVTGSGTKALPAGTPATQLYKPTDP GILFNPYTTITSYTIPGPALWQG。本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg _編碼249個氨基酸， 成熟蛋白的分子量為26. 80kDa，等電點pi為7. 62，N端的19個氨基酸為信號肽，是胞外酶， 屬于糖苷水解酶61家族。
本發(fā)明用于克隆綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲的引物為P3和P4 ；引物P3的 核苷酸序列為5 ‘ -TGCGAATTCATTTAAGGATCTAAGCCCC-3 ‘；引物P4的核苷酸序列為5 ‘ -CG CTCTAGACCTGGATCTAGCCTTGC-3‘。將本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因印欲與真核表達載體PYES2連接，構建成 pYES2-eg ΥΠ重組表達載體，再經(jīng)半乳糖誘導后表達，具有CMC (羧甲基纖維素)酶活性，說明 綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因欲具有表達功能，并可通過基因工程的手段提高微生物的 纖維素降解性能。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲的核苷酸序列如 SEQIDN0 1 所示。本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因欲全長為782bp，在第26bp處有起始密 碼子ATG，在第775bp處有終止密碼子TAG，具有750bp完整的開放閱讀框。本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因^·趿是以綠色木霉 Trichodermaviric/eAS3. 371 IcDNA為模板(可采用“綠色木霉AS3. 3711的葡聚糖內(nèi)切酶V 基因的克隆與表達”《高技術通訊》2004. 8中記載的方法獲得綠色木霉T. viridekU. 3711 總RNA，再采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按Invitrogen的M-MLVReveraseTranscriptase說明書步驟 操作獲得cDNA)，通過PCR擴增獲得的。為了 PCR擴增獲得本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚 糖酶基因 eg W,設計上游引物 P3 (5' -TGCGAATTCATTTAAGGATCTAAGCCCC-3 ‘)和下游弓| 物P4(5 ‘ - CGCTCTAGACCTGGATCTAGCCTTGC-3 ‘)，并在上游引物P3的5 ‘端加上酶切位點 feoTPI及保護堿基，在下游引物P4的5'端加上酶切位點損al及保護堿基。PCR擴增反應 條件為95°C預變性10min，94°C變性30s、58°C退火30s、72°C延伸90s、共30個循環(huán)，72°C延 伸7min，4°C保存；再進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性重組子。選擇PCR陽性重組子， 采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定，選擇酶切鑒定正確的轉(zhuǎn)化子，進行測序。綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲在釀酒酵母INVScl中表達
一、真核表達載體構建根據(jù)PYES2穿梭載體(由山東大學鮑曉明老師惠贈)的多 克隆位點序列用^I和損a I酶切，回收酶切片段，使綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因 eg趿和pYES2穿梭載體于16 °C連接8h，構建表達載體pYES2_eg ΥΠ，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌 EscherichiacoinmYm感受態(tài)細胞；在含有氨芐青霉素、X-gal (半乳糖苷)和IPTG (異丙 基- β -D-硫代半乳糖苷)的LB篩選平板上進行藍白斑篩選，對陽性白斑菌落進行PCR鑒 定，并提取質(zhì)粒進行酶切鑒定以鑒定陽性重組子。二、釀酒酵母轉(zhuǎn)化與篩選提取陽性克隆質(zhì)粒，然后采用LiAc/SS-DNA/PEG方法轉(zhuǎn) 化到真核表達宿主釀酒酵母INVScl感受態(tài)細胞中；然后涂布于SC-U-G(尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型 葡萄糖)選擇性平板培養(yǎng)基在30°C條件下培養(yǎng)2 3d，挑選SC-U-G選擇性培養(yǎng)基上生長的 轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于體積為5mL的SC-U-G液體培養(yǎng)基中在28 30°C、200 250r/min的 條件下培養(yǎng)至0D600=0. 6 1. 0 (培養(yǎng)時間約為2 3d)；再收集釀酒酵母菌體提取質(zhì)粒， 然后以其為模板，進行PCR鑒定，確定陽性轉(zhuǎn)化子。
三、酵母陽性重組子誘導表達選擇步驟二得到的陽性重組子按SC-U-β (尿嘧啶 營養(yǎng)缺陷型β -半乳糖)誘導培養(yǎng)基10%的體積比接種菌液(OD=O. 8)，菌液經(jīng)2500r/min、 4°C離心5min收集菌體，再用體積為ImL的SC-U- β培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)入含2% β -D-半乳糖的 SC-U-β誘導培養(yǎng)基中在28 30°C、180 200r/min的條件下培養(yǎng)進行誘導表達。四、粗酶液制備經(jīng)步驟三誘導表達的培養(yǎng)液在2500r/min、4°C條件下離心5min， 加入(NH4)2SO4至飽和度80%，然后4°C鹽析過夜，再12000r/min、4°C離心lOmin，棄去上清 液，用檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液溶解，酶液裝入透析袋浸入檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液中4°C 過夜除去鹽分，即為綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG ΥΠ粗酶液。五、CMC酶活測定采用DNS (3，5_ 二硝基水楊酸)法測定CMC酶活。酶活單位用 國際單位(U)表示，即在實驗條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μ mol葡萄糖為1個酶活單位，標準曲線 方程為:Y=7. 8152Χ-0. 3749，其中X為葡萄糖量？ g，Y為OD值，直線相關系數(shù)R2=O. 9992， 本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG ΥΠ的酶活為0. 0468U/mL。本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細胞和質(zhì)粒等均容易購得，若無特殊 要求則濃度為產(chǎn)品標注濃度，操作步驟可參見試劑盒使用操作手冊。SC-U-G (尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型葡萄糖)選擇性平板培養(yǎng)基由SC-U基本培養(yǎng)基和 占SC-U基本培養(yǎng)基質(zhì)量2%的葡萄糖(過濾除菌)制成。SC-υ-β (尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型 β -半乳糖)誘導培養(yǎng)基由SC-U基本培養(yǎng)基和占SC-U基本培養(yǎng)基質(zhì)量2%的β -D-半 乳糖(過濾除菌)制成。其中SC-U基本培養(yǎng)基中含有0. lg/L的A液、0. 05g/L的B液、 6. 7g/L 的 yeastnitrogenbase 和 20g/L 的瓊脂；IL 的 A 液中腺嘌呤(Adenine)、精氨 酸(Arginine)、半胱氨酸(Lysteine)、亮氨酸(Leueine)、蘇氨酸(Threonine)和色氨酸 (Tryptophan)各 2. 5g ；IL 的 B 液中天冬氨酸(Asparticacid)、組氨酸(Histidine)、異亮氨 酸(Isoleucine)、蛋氨酸(Methionine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、脯氨酸(Proline)、絲 氨酸(Serine)、纈氨酸(Valine)和酪氨酸(Tyrosine)各 1. 25g。釀酒酵母INVSCl記載于“釀酒酵母INVSCl對油菜菌核病菌抑制作用的研究”(《生 物學雜志》2010年01期)等文獻中，而且是常用生物材料，可以購買獲得。本實施方式步驟一中對陽性白斑菌落進行PCR鑒定使用通用弓丨物RV-M和M13-47。 PCR反應條件為95°C預變性IOmin ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，共30個循 環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。然后進行濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，若電泳顯示出與 目的DNA (782bp)大小的條帶，則證明質(zhì)粒重組正確，是陽性重組子。本實施方式步驟五中CMC酶活的測定取0. 5mL粗酶液加入1. 5mL、1%CMC溶液中 在50°C下水浴30min，加入3mL的DNS試劑，沸水浴IOmin后立即用流動水冷卻，然后定容 至25mL，Ih內(nèi)在530nm紫外光下比色。經(jīng)實驗證明由本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因印欲所翻譯成的綠色木霉 內(nèi)切葡聚糖酶EG VIK氨基酸序列如SEQIDN0 2所示；成熟蛋白的分子量為26. 80kDa，等電 點Pl為7. 62。)反應的最適pH值為5.0，最適反應溫度為50°C，熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為75°C下穩(wěn)定 性良好，轉(zhuǎn)化子在誘導36h具有最高的酶活性；金屬Ba2+、Mg2+、K+和Zn2+(濃度為0. 75mmol/ L)增強了綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG ΥΠ活性分別為19. 03%,37. 52%,29. 04%和21. 66% ；Cu2+、 Ca2+、Ag+、Fe2+、Al3+、Co2+和Mn2+離子(濃度為0. 75mmol/L)對綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG W 活性具有抑制作用，綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG ΥΠ活性分別降低為73. 51%,74. 78%,86. 95%、41. 05%,53. 91%,35. 77% 和 79. 69%。Na+和 Fe3+離子(濃度為 0. 75mmol/L)對綠色木霉內(nèi)切 葡聚糖酶EG ΥΠ的酶活沒有明顯的激活和抑制作用。本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基 因抓豐富了纖維素酶的種類，拓寬了內(nèi)切葡聚糖酶的獲得途徑，并為將來通過基因改 造技術提高纖維素降解率奠定了物質(zhì)基礎。
具體實施方式
二 本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg _碼的氨基酸序 列如SEQIDN0 2所示。本實施方式綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因印W所編碼249個氨基酸，成熟蛋白的分 子量為26. 80kDa，等電點pi為7. 62，N端的19個氨基酸為信號肽，是胞外酶，屬于糖苷水 解酶61家族。
具體實施方式
三本實施方式用于克隆綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲的引物 為 P3 和 P4 ；引物 P3 的核苷酸序列為 5 ‘ -TGCGAATTCATTTAAGGATCTAAGCCCC-3 ‘；引物 P4 的核苷酸序列為 5' -CGCTCTAGACCTGGATCTAGCCTTGC-3‘。本實施方式若采用Pl (5‘ -TGCGAATTCATGAAGTCCTGCGCCATTCTT-3‘)和 P2(5'-CGCTCTAGACTAGCCTTGCCACAGGG-3‘)作為引物，以綠色木霉 T. virideAS3. 371 IcDNA 為模板 也同樣可以獲得含有綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因欲完整編碼區(qū)的基因序列。序列表
<110>哈爾濱工業(yè)大學
<120>綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因^·欲及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的
引物
<160>6
<210>1
<211>782
<212>DNA
<213> 綠色木霉(Trichodermaviride )
<220> <221>CDS
<222>(26). . · (775) <220>
<223>綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg W <400>1
atttaaggatctaagccccatcgatatg aag tcc tgc gcc att ctt gca gcc ctt 55 MetLysSerCysAlaIIeLeuAlaAlaLeu 1510
ggc tgt ctt gcc ggg agcgtt ctc ggc cat gga caa gtc caa aac ttc 103 GlyCysLeuAlaGlySerValLeuGlyHisGlyGlnValGlnAsnPhe
152025
&cg ate a,at gga caa tacaat cag ggt ttc att ctc gat tac tac tat 151 ThrlleAsnGlyGlnTyrAsnGlnGlyPheIleLeuAspTyrTyrTyr
303540
cag aag cag aat act ggtcac ttc ccc aac gtt get ggc tgg tacgcc 199 GlnLysGlnAsnThrGlyHisPheProAsnValAlaGlyTrpTyrAla
455055
gag gac cta gac ctg ggcttc ate tcc cct gac caa tac acc acg ccc247 GluAspLeuAspLeuGlyPheIIeSerProAspGlnTyrThrThrPro
606570
gac att gtc tgt cac aagaac gcg gcc cca ggt gcc att tct gcc act 295 AspIleValCysHisLysAsnAlaAlaProGlyAlalleSerAlaThr 75808590gca gcg gcc ggc age aac ate gtc ttc caa tgg ggc cct ggc gtc tgg 343 AlaAlaAlaGlySerAsnlleValPheGlnTrpGlyProGlyValTrp
95100105
cct cac ccc tac ggt cccatc gtt acc tac gtg get gag tgc age gga 391 ProHisProTyrGlyProIleValThrTyrValAlaGluCysSerGly
110115120
tcg tgc acg acc gtg aacaag aac aac ctg cgc tgg gtc aag att cag439 SerCysThrThrValAsnLysAsnAsnLeuArgTrpValLysIIeGln 125130135
gag gcc ggc ate aac tataac acc caa gtc tgg gcg cag cag gat ctg487 GluAlaGlyIIeAsnTyrAsnThrGlnvalTrpAlaGlnGlnAspLeu
140145150
ate aac cag ggc aac aagtgg act gtg aag ate ccg tcg age ctc agg535 IIeAsnGlnGlyAsnLysTrpThrValLysIIeProSerSerLeuArg 155160165170
ccc gga aac tat gtc ttccgc cat gaa ctt ctt get gcc cat ggt gcc 583 ProGlyAsnTyrValPheArgHisGluLeuLeuAlaAlaHisGlyAla
175180185
tct agt gcg aac ggc atgcag aac tat cct cag tgc gtg aac ate gcc 631 SerSerAlaAsnGlyMetGlnAsnTyrProGlnCysValAsnIIeAla
190195200
gtc aca ggc tcg ggc acgaaa gcg ctc cct gcc gga act cct gca act679 ValThrGlySerGlyThrLysAlaLeuProAlaGlyThrProAlaThr 205210215
cag ctc tac aag ccc act gac cct ggc ate ttg ttc aac cct tac aca 727 GlnLeuTyrLysProThrAspProGlyIIeLeuPheAsnProTyrThr
220225230
aca ate acg age tac acc ate cct ggc cca gcc ctg tgg caa ggc tag775 ThrIIeThrSerTyrThrIleProGlyProAlaLeuTrpGlnGly 235240245
atccagg782
<210>2
<211>249
<212>PRT
〈213〉M^y^M (Trichoderma viride ) 〈220〉
〈223〉綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG ΥΠ氨基酸序列<400>2
MetLysSerCysAlaIIeLeuAlaAlaLeuGlyCysLeuAlaGlySer 151015
ValLeuGlyHisGlyGlnValGlnAsnPheThrlleAsnGlyGlnTyr
202530
AsnGlnGlyPheIIeLeuAspTyrTyrTyrGlnLysGlnAsnThrGly 354045
HisPheProAsnValAlaGlyTrpTyrAlaGluAspLeuAspLeuGly 505560
PheI1eSerProAspGlnTyrThrThrProAspI1eValCysHisLys
65707580
AsnAlaAlaProGlyAlalleSerAlaThrAlaAlaAlaGlySerAsn
859095
IleValPheGlnTrpGlyProGlyValTrpProHisProTyrGlyPro
100105110
IleValThrTyrValAlaGluCysSerGlySerCysThrThrValAsn
115120125
LysAsnAsnLeuArgTrpValLysIIeGlnGluAlaGlyIIeAsnTyr 130135140
AsnThrGlnValTrpAlaGlnGlnAspLeuIIeAsnGlnGlyAsnLys 145150155160
TrpThrValLysIleProSerSerLeuArgProGlyAsnTyrValPhe
165170175
ArgHisGluLeuLeuAlaAlaHisGlyAlaSerSerAlaAsnGlyMet
180185190
GlnAsnTyrProGlnCysValAsnlIeAlaValThrGlySerGlyThr
195200205
LysAlaLeuProAlaGlyThrProAlaThrGlnLeuTyrLysProThr 210215220
AspProGlyIIeLeuPheAsnProTyrThrThrIIeThrSerTyrThr
225230235240
IleProGlyProAlaLeuTrpGlnGly
245
210>3 <211>28 <212>DNA <213>人工序列<220>
<223>綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg趿PCR擴增用上游引物P3 <400>3
tgcgaattcatttaaggatctaagcccc28
<210>4 <211>26 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg趿PCR擴增用下游引物P4 <400>4
cgctctagacctggatctagccttgc26
<210>5 <211>30 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>可用于綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因欲完整編碼區(qū)基因序列擴增的上游引物
Pl
<400>5
tgcgaattcatgaagtcctgcgccattctt30
<210>6 <211>26 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>可用于綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因欲完整編碼區(qū)基因序列擴增的下游引物
P2
<400>6
cgctctagactagccttgccacaggg2權利要求
綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ，其特征在于綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ的核苷酸序列如下所示ATTTAAGGATCTAAGCCCCATCGATATGAAGTCCTGCGCCATTCTTGCAGCCCTTGGCTGTCTTGCCGGGAGCGTTCTCGGCCATGGACAAGTCCAAAACTTCACGATCAATGGACAATACAATCAGGGTTTCATTCTCGATTACTACTATCAGAAGCAGAATACTGGTCACTTCCCCAACGTTGCTGGCTGGTACGCCGAGGACCTAGACCTGGGCTTCATCTCCCCTGACCAATACACCACGCCCGACATTGTCTGTCACAAGAACGCGGCCCCAGGTGCCATTTCTGCCACTGCAGCGGCCGGCAGCAACATCGTCTTCCAATGGGGCCCTGGCGTCTGGCCTCACCCCTACGGTCCCATCGTTACCTACGTGGCTGAGTGCAGCGGATCGTGCACGACCGTGAACAAGAACAACCTGCGCTGGGTCAAGATTCAGGAGGCCGGCATCAACTATAACACCCAAGTCTGGGCGCAGCAGGATCTGATCAACCAGGGCAACAAGTGGACTGTGAAGATCCCGTCGAGCCTCAGGCCCGGAAACTATGTCTTCCGCCATGAACTTCTTGCTGCCCATGGTGCCTCTAGTGCGAACGGCATGCAGAACTATCCTCAGTGCGTGAACATCGCCGTCACAGGCTCGGGCACGAAAGCGCTCCCTGCCGGAACTCCTGCAACTCAGCTCTACAAGCCCACTGACCCTGGCATCTTGTTCAACCCTTACACAACAATCACGAGCTACACCATCCCTGGCCCAGCCCTGTGGCAAGGCTAGATCCAGG。
2.綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲編碼的氨基酸序列，其特征在于綠色木霉內(nèi)切葡 聚糖酶基因eg _碼的氨基酸序列如下所示MKSCAILAALGCLAGSVLGHGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGWYAEDLDLGFISPDQYT TPDIVCHKNAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYVAECSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAGINYNTQVff AQQDLINQGNKWTVKIPSSLRPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIAVTGSGTKALPAGTPATQLYKPTDP GILFNPYTTITSYTIPGPALWQG。
3.用于克隆綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因^ 趿的引物，其特征在于用于克隆綠色木霉 內(nèi)切葡聚糖酶基因eg欲的引物為P3和P4 ；引物P3的核苷酸序列為5' -TGCGAATTCATTTA AGGATCTAAGCCCC-3 ‘；引物 P4 的核苷酸序列為 5 ‘ -CGCTCTAGACCTGGATCTAGCCTTGC-3 ‘。
全文摘要
綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的引物，它涉及涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的引物。它提供了綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ及其編碼的氨基酸序列和用于克隆該基因的引物，為將來通過基因改造技術提高纖維素降解率提供了物質(zhì)基礎。綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。用于克隆的引物為P3和P4。將本發(fā)明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ與真核表達載體pYES2連接，構建成pYES2-egⅦ重組表達載體，再經(jīng)半乳糖誘導后表達，具有CMC酶活性，說明綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅦ具有表達功能。
文檔編號C12N9/42GK101831453SQ20101017394
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權日2010年5月17日
發(fā)明者劉志華, 宋金柱, 楊謙, 陳秀玲, 黃曉梅 申請人:哈爾濱工業(yè)大學