專利名稱：用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法，具體地說，通過用間氯過氧苯甲酸對含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩和表面乙烯基 功能化的介孔分子篩的環(huán)氧化，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的環(huán)氧基官能團(tuán)，然后使 生物酶以共價(jià)結(jié)合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。
背景技術(shù)：
將游離酶直接用于催化過程存在許多不足，如在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和有機(jī)溶劑中不 穩(wěn)定，容易喪失催化活性；游離酶回收困難，經(jīng)濟(jì)上不合理，還造成產(chǎn)物難以分離提純，嚴(yán)重 影響產(chǎn)品質(zhì)量；生產(chǎn)過程難以實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，只能一次性間歇操作等。固定化酶克服了游 離酶的上述不足，不僅保持了游離酶特有的催化特性，還提高了操作穩(wěn)定性，生產(chǎn)過程易于 實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，反應(yīng)完成后易于與產(chǎn)物分離且可以重復(fù)使用，所得的產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本 低。因此，酶的固定化一直是催化化學(xué)、生物化學(xué)和材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。固定化酶的常用制備方法可以分為四種包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價(jià)結(jié)合法。 包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型兩類，可獲得較高的酶活力回收，但必須巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件，制 得的固定化酶不適用于大分子底物，一般用于制備固定化細(xì)胞。交聯(lián)法是指先將酶吸附于 不溶性載體上，然后使用雙官能團(tuán)或多功能團(tuán)交聯(lián)劑使酶分子之間進(jìn)行交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，可得到酶蛋白單位濃度較高的固定化酶，但存在著反應(yīng)條件劇烈、酶活損失等不足。吸 附法包括物理吸附和離子吸附法，具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化較少等優(yōu) 點(diǎn)，但由于酶與載體之間是以離子鍵、范德華力和氫鍵等較弱的作用力相連接，酶容易流 失。共價(jià)結(jié)合法是借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能性基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)制 備固定化酶的方法，因酶與載體之間以共價(jià)鍵相結(jié)合，呈現(xiàn)良好的操作穩(wěn)定性，是目前工業(yè) 上廣泛使用的酶固定化方法。由上述固定化酶的制備方法可知，要想得到性能優(yōu)異的固定化酶，載體必須滿足 以下要求載體表面具有可與酶分子發(fā)生相互作用的功能性基團(tuán)，或可以通過表面改性進(jìn) 行功能化；載體表面的功能性基團(tuán)數(shù)量及其分布適當(dāng)，而且容易接近；載體必須是多孔物 質(zhì)，具有較高的比表面積；載體具有較大的孔徑，以降低酶催化反應(yīng)過程中存在的擴(kuò)散阻 力；載體具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性。生物酶固定化載體可分為兩類無機(jī)載體和有機(jī)載體。與廣泛使用的有機(jī)載體相 比較，無機(jī)載體具有更高的機(jī)械強(qiáng)度和較好的化學(xué)穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)容易控制，其 突出優(yōu)勢是負(fù)載的酶經(jīng)焙燒等簡單處理就可以除去，載體可以重復(fù)使用，這就大大降低了 固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的后處理問題，減輕了對環(huán)境的壓力。新型介 孔分子篩具有較大連續(xù)可調(diào)的孔徑、高的比表面積、較大的吸附容量和孔道內(nèi)富含弱酸性 羥基，可以使體積較大的酶分子固定于分子篩介孔中和反應(yīng)產(chǎn)物及時擴(kuò)散出孔道，保持固 定化酶適宜的微環(huán)境，因而制得的固定化酶具有較高的催化活性，同時固定化酶的使用溫 度較低，可以避免介孔分子篩普遍存在的水熱穩(wěn)定性差的問題，因此，介孔分子篩是一類很有發(fā)展前途的酶固定化新型無機(jī)載體。固定化酶的性能與介孔分子篩的結(jié)構(gòu)(晶型、孔徑、孔容和比表面積)密切相關(guān)。 介孔分子篩的孔徑是影響固定化酶活性的關(guān)鍵因素，當(dāng)介孔分子篩的孔徑大于生物酶的分 子尺寸時，在酶的固定化過程中，酶分子就容易進(jìn)入介孔分子篩孔道內(nèi)與表面的功能性基 團(tuán)相結(jié)合，充分利用介孔分子篩的孔容，得到的固定化酶具有較高活性。介孔分子篩的晶 型、孔容和比表面積對固定化酶活性都有較大影響。由于生物酶分子與介孔分子篩表面弱 酸性羥基之間通常是以較弱的氫鍵作用力相結(jié)合，在使用過程中一部分酶會發(fā)生脫落，操 作穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，如何在基本保持固定化酶活性的前提下，提高固定化酶的操作 穩(wěn)定性，仍需要做進(jìn)一步的研究。固定化青霉素酰化酶(EC 3.5. 1. 11，酶分子尺寸70AX50AX55A)是半合成 β -內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶，它既能催化青霉素及其擴(kuò)環(huán)酸水解去側(cè)鏈，生產(chǎn)半 合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基-3-脫乙酰氧 基頭孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-ΑΡΑ和7-ADCA與側(cè)鏈縮合，生產(chǎn)多種半合成β -內(nèi)酰胺 類抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 禾口 Cefadroxil 等)。我國人口眾多，對半合成內(nèi)酰胺類抗生素的需求很大，用固定化青霉素?；?酶工藝生產(chǎn)半合成青霉素是一條低成本的綠色生產(chǎn)工藝，已被列為我國今后生物醫(yī)藥發(fā)展 的六大重點(diǎn)方向之一。由于基因工程的迅猛發(fā)展，重組青霉素酰化酶已能高效表達(dá)和大量 生產(chǎn)，中科院上海生命科學(xué)院用DNA操作技術(shù)獲得了高產(chǎn)的青霉素?；富蚬こ叹辏?大大降低了游離酶的生產(chǎn)成本。但我國目前工業(yè)上所用載體全部依賴進(jìn)口，固定化酶的生 產(chǎn)成本還太高。因此，性能優(yōu)異的固定化載體的合成技術(shù)已成為我國青霉素?；腹潭ɑ?技術(shù)發(fā)展的技術(shù)瓶頸，發(fā)展具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的固定化載體合成路線，從根本上擺脫 我國長期依賴進(jìn)口載體生產(chǎn)固定化酶的被動局面，開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的半合成內(nèi)酰 胺類抗生素酶法工藝，以滿足日益增長的國內(nèi)需求和增強(qiáng)產(chǎn)品的國際競爭力，從而為我國 固定化酶技術(shù)的進(jìn)步和抗生素產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。中國專利CN1320688A公開了一種用于青霉素?；腹潭ɑ慕榭撞牧?。該介孔 材料的最大孔徑為3. 3nm,固定化酶的最高酶活為511U/g，但由于該介孔材料的孔徑比青 霉素?；傅姆肿映叽缧〉枚?，而且通過利用載體表面的弱酸性羥基與酶分子之間的較弱 氫鍵作用力實(shí)現(xiàn)酶的固定化，因此，得到的固定化酶性能較差。中國專利CN1935994A公開了一種有機(jī)基團(tuán)功能化介孔分子篩酶固定化載體及其 制備方法。通過用3-含氧縮水甘油基丙基三甲氧基硅烷或Y-氨丙基三乙氧基硅烷和戊 二醛對介孔分子篩表面的功能化修飾，引入環(huán)氧基或醛基等有機(jī)官能團(tuán)(占載體總質(zhì)量的 2 9% )，然后在溫和條件下以共價(jià)結(jié)合方式固定生物酶分子，獲得的固定化青霉素?；?酶具有高的催化活性和使用穩(wěn)定性，固定化酶的表觀活性為1000 2000IU/g，重復(fù)使用10 次后，固定化酶保留90%以上的初始表觀活性。但由于上述兩種方法引入的有機(jī)官能團(tuán)的 鏈長比較長，經(jīng)過表面功能化后，介孔分子篩的孔徑、比表面積及孔容均明顯變小，大大降 低了固定化酶的活性。 中國專利CN1580233A公開了一種用于酶固定化的介孔反應(yīng)器及其制備方法。這 種介孔反應(yīng)器通過介孔材料表面的羥基基團(tuán)與酶分子羧基氧原子相互作用，將酶分子固定 在介孔材料孔道內(nèi)，再利用接枝技術(shù)將硅烷偶聯(lián)劑接枝在介孔材料的孔口處，最后利用聚合硅烷偶聯(lián)劑末端的雙鍵聚合，在孔口處形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過這種方法制備的介孔反應(yīng)器可以有效地將載體的孔口縮小，在抑制酶分子流失的同時還不會對底物和產(chǎn)物造成傳質(zhì)阻 力，因而得到具有高催化活性和高操作穩(wěn)定性的固定化酶。介孔材料選用SBA-15、MCM-41、 MCM-48和FSM中的一種，酶選用豬胰脂肪酶、辣根過氧化物酶、球蛋白酶、胰島素中的一種。 但該方法在制備固定化酶過程中使用了大量有機(jī)溶劑，容易使游離酶喪失催化活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種可提高固定化酶 的活性和操作穩(wěn)定性的用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，該方法是 用間氯過氧苯甲酸對含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩和表面乙烯基功能化的 介孔分子篩的環(huán)氧化，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的環(huán)氧基官能團(tuán)。所述的方法具體包括如下步驟將乙烯基介孔分子篩加入到間氯過氧苯甲酸 (m-CPBA)的二氯甲烷溶液中，在30 50°C持續(xù)攪拌回流48 96小時后，過濾，將濾餅用 二氯甲烷充分洗滌三次，所得固體粉末在50 100°C真空干燥12 24小時，即得到環(huán)氧基 介孔分子篩。所述的間氯過氧苯甲酸和乙烯基介孔分子篩的質(zhì)量比為1 3 1，所述的二氯甲 烷的體積和乙烯基介孔分子篩的質(zhì)量比為50 150 1。所述的環(huán)氧基介孔分子篩可用于青霉素酰化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰 蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素?；傅墓潭ɑ?。用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，由乙烯基介孔分子篩的合成 和表面環(huán)氧基功能化2個過程組成，其中乙烯基介孔分子篩的合成包括如下步驟直接共聚法合成在室溫條件下，將5. 68g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, Mav = 5800)和11. 36g Na2SO4溶于160mL 1. Omo 1/L的HCl溶液中；待完全溶解之后，將溶液升溫 至35°C并持續(xù)攪拌數(shù)小時，緩慢滴加53. 2mmol的不同組成的正硅酸乙酯(TEOS)和乙烯基 三乙氧基硅烷(TEVS)的混合物，并在35°C條件下持續(xù)攪拌20小時，其中TEVS的摩爾百分 比為5 20%;將溶液轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱晶化釜中，并置于100°C的烘箱中晶 化24小時，然后將溶液冷卻至室溫后過濾得到的固體，在100°C烘箱中干燥過夜；將l.Og 未除模板劑的介孔分子篩置于圓底燒瓶中，加入50ml濃度為60%的硫酸，加熱到95°C并持 續(xù)攪拌24小時；過濾并用去離子水洗滌至中性，將濾餅回收后加入50mi無水乙醇，在室溫 條件下持續(xù)攪拌12小時后過濾，重復(fù)三次，然后在50°C真空烘箱中干燥24小時，得到含有 乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩。后嫁接法合成在室溫下將2. Og Pluronic P123 (EO20PO70EO20, Mav = 5800)溶于 75mLl. 6mol/L的HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0. 023g氟化銨和1. 5 3. 5g 1,3, 5_三甲苯，然后將溶液升溫至35°C并持續(xù)攪拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C 下持續(xù)攪拌20小時；將溶液轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱晶化釜中，于100°C水熱晶化 24小時；待溶液冷卻至室溫后過濾得到白色固體，在100°C的烘箱中干燥過夜，然后在馬弗 爐中程序升溫至500°C焙燒4小時得到介孔分子篩；將介孔分子篩和乙烯基三乙氧基硅烷加入到甲苯溶液中，在100 120°C加熱回流5 15小時，其中乙烯基三乙氧基硅烷和介孔 分子篩的質(zhì)量比為0.5 1.5 1，甲苯的體積和介孔分子篩的質(zhì)量比為20 70 1;將 介孔分子篩過濾、用乙醇洗滌三次后，在50°C真空烘箱中干燥24小時，得到表面乙烯基功 能化的介孔分子篩。用上述方法制備的環(huán)氧基介孔分子篩，可用于青霉素?；?、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄 糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素?；傅墓潭?化。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法的顯著優(yōu)點(diǎn)在于， 用間氯過氧苯甲酸對含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩和表面乙烯基功能化的 介孔分子篩的環(huán)氧化，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的環(huán)氧基官能團(tuán)，盡量減少表面功 能化過程對于介孔分子篩的孔徑、比表面積和孔容的影響，不需要進(jìn)一步活化就可以直接 使生物酶以共價(jià)結(jié)合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。本發(fā)明所述的環(huán)氧基介孔分子篩的顯著優(yōu)點(diǎn)之一在于，該環(huán)氧基介孔分子篩的孔 徑比青霉素?；傅姆肿映叽绱蟮枚啵欣诟嗟拿阜肿舆M(jìn)入介孔分子篩孔道內(nèi)被固定 化，提高固定化酶的活性。本發(fā)明所述的環(huán)氧基介孔分子篩的顯著優(yōu)點(diǎn)之二在于，該環(huán)氧基介孔分子篩通過 表面的環(huán)氧基與酶分子中氨基之間形成的共價(jià)鍵來實(shí)現(xiàn)酶的固定化，提高固定化酶的操作 穩(wěn)定性。


圖1為用乙烯基三甲氧基硅烷和m-CPBA對介孔分子篩表面的環(huán)氧基功能化及酶 的固定化示意圖；圖2為用m-CPBA對含有乙烯基的介孔分子篩表面的環(huán)氧基功能化及酶的固定化 示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。在以下實(shí)施例中，采用以下方法對進(jìn)行青霉素酰化酶的固定化，以及測定固定化 酶的活性和操作穩(wěn)定性青霉素酰化酶的固定化稱取0. 05g載體與6. OmL經(jīng)pH = 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液 稀釋的青霉素?；溉芤?VbuffCT/Venzyme = 4 1)混合，放入30°C的水浴搖床中固定化24 小時后進(jìn)行離心分離，所得固體用pH = 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液多次洗滌后進(jìn)行活性測定。固定化酶的活性測定(青霉素G鉀鹽水解制備6-APA)在37°C的溫度下，將上述 固定化酶與50mL 4襯％的青霉素G鉀鹽水溶液(用0. Imol/LpH = 7.8磷酸鹽緩沖溶液稀 釋)均勻混合，然后用濃度為0. lmol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7. 8， 記錄10分鐘內(nèi)NaOH的消耗量。然后用以下公式來計(jì)算固定化酶的活性A(IU/g) = VNaOHXCNaOHX103/(mXt)其中A代表固定化酶的活性;VNa0H代表NaOH消耗量(ml) ；Cn30h代表NaOH濃度 (mol/L) ；m代表載體干重(g) ；t代表測試所用時間(min)。
固定化酶的操作穩(wěn)定性測定將已使用過的固定化酶溶液進(jìn)行離心分離，然后將 固定化酶轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中，采用上述活性測定方法測定使用過的固定化酶的活性。經(jīng)過10 次循環(huán)使用后，固定化酶的活性與初始活性的百分比越高，則說明固定化酶的操作穩(wěn)定性 越好。實(shí)施例1 用乙烯基三甲氧基硅烷和m-CPBA對介孔分子篩表面的環(huán)氧基功能化及酶的固定 化示意圖如圖1所示，在室溫條件下，將5. 68g Pluronic P123 (EO20PO70EO20,Mav = 5800)和 11. 36gNa2S04溶于160mL 1. Omol/L的HCl溶液中；待完全溶解之后，將溶液升溫至35°C并 持續(xù)攪拌數(shù)小時，緩慢滴加53. 2mmol的正硅酸乙酯(TEOS)和乙烯基三乙氧基硅烷(TEVS) 的混合物(TEVS的摩爾百分比為5% )，并在35°C條件下持續(xù)攪拌20小時；將溶液轉(zhuǎn)入帶 有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱晶化釜中，并置于100°C的烘箱中晶化24小時，然后將溶液冷卻 至室溫后過濾得到的固體，在100°C烘箱中干燥過夜；將l.Og未除模板劑的介孔分子篩置 于圓底燒瓶中，加入50ml濃度為60%的硫酸，加熱到95°C并持續(xù)攪拌24小時；過濾并用去 離子水洗滌至中性，將濾餅回收后加入50ml無水乙醇，在室溫條件下持續(xù)攪拌12小時后過 濾，重復(fù)三次，然后在50°C真空烘箱中干燥24小時，得到含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的 介孔分子篩。將0. 5g上述乙烯基介孔分子篩，加入到50mL間氯過氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中 (濃度為1. 0g/50mL)，在35°C持續(xù)攪拌回流72小時后，過濾，將濾餅用二氯甲烷充分洗滌三 次，所得固體粉末在50°C真空干燥24小時，即得到環(huán)氧基介孔分子篩。將上述環(huán)氧基介孔 分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為3611U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用 后，固定化酶保留了 77%的初始活性。實(shí)施例2將實(shí)施例1中TEVS的摩爾百分比由5%改為10%，其他條件與實(shí)施例1相同，得 到環(huán)氧基介孔分子篩，用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為2262U/g，經(jīng)過 10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 80%的初始活性。實(shí)施例3將實(shí)施例1中TEVS的摩爾百分比由5%改為15%，其他條件與實(shí)施例1相同，得 到環(huán)氧基介孔分子篩，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為1563U/g，經(jīng)過 10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 66%的初始活性。實(shí)施例4將實(shí)施例1中TEVS的摩爾百分比由5%改為20%，其他條件與實(shí)施例1相同，得 到環(huán)氧基介孔分子篩，用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固定化酶活性為1308U/g，經(jīng)過 10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 64%的初始活性。實(shí)施例5在室溫下將2. Og Pluronic P123 (EO2ciPO7ciEO2ci，Mav = 5800)溶于 75mL 1.6mol/L 的 HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0.023g氟化銨和1.5g 1，3，5-三甲苯，然后將溶液升 溫至35°C并持續(xù)攪拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C下持續(xù)攪拌20小時；將溶 液轉(zhuǎn)入帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱晶化釜中，于100°C水熱晶化24小時；待溶液冷卻至室 溫后過濾得到白色固體，在100°C的烘箱中干燥過夜，然后在馬弗爐中程序升溫至500°C焙燒4小時得到介孔分子篩；將1. Og介孔分子篩和1. 08g乙烯基三乙氧基硅烷加入到55mL甲苯溶液中，在110°C加熱回流10小時；將介孔分子篩過濾、用乙醇洗滌三次后，在50°C真 空烘箱中干燥24小時，得到表面乙烯基功能化的介孔分子篩。用m-CPBA對含有乙烯基的介孔分子篩表面的環(huán)氧基功能化及酶的固定化示意圖 如圖2所示，將0. 5g上述乙烯基介孔分子篩，加入到50mL間氯過氧苯甲酸的二氯甲烷溶液 中(濃度為1.0g/50mL)，在35°C持續(xù)攪拌回流75小時后，過濾，將濾餅用二氯甲烷充分洗 滌三次，所得固體粉末在50°C真空干燥24小時，即得到環(huán)氧基介孔分子篩。將上述環(huán)氧基 介孔分子篩用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8383U/g，經(jīng)過10次循環(huán) 使用后，固定化酶保留了 69%的初始活性。實(shí)施例6將實(shí)施例5中1，3，5-三甲苯的質(zhì)量由1.5g改為2. 5g，其他條件與實(shí)施例1相同， 得到環(huán)氧基介孔分子篩，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8416U/g，經(jīng) 過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 90%的初始活性。實(shí)施例7將實(shí)施例5中1，3，5-三甲苯的質(zhì)量由1.5g改為3. 5g，其他條件與實(shí)施例1相同， 得到環(huán)氧基介孔分子篩，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8016U/g，經(jīng) 過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 84%的初始活性。實(shí)施例8乙烯基介孔分子篩的制備方法同實(shí)施例5，將0. 5g上述乙烯基介孔分子篩，加入 到25mL間氯過氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中(濃度為1. 0g/50mL)，在30°C持續(xù)攪拌回流96 小時后，過濾，將濾餅用二氯甲烷充分洗滌三次，所得固體粉末在50°C真空干燥24小時，即 得到環(huán)氧基介孔分子篩。將上述環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ?，得到的固 定化酶活性為8543U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 66%的初始活性。實(shí)施例9乙烯基介孔分子篩的制備方法同實(shí)施例5，將0. 5g上述乙烯基介孔分子篩，加入 到75mL間氯過氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中(濃度為1. 0g/50mL)，在40°C持續(xù)攪拌回流72 小時后，過濾，將濾餅用二氯甲烷充分洗滌三次，所得固體粉末在100°C真空干燥12小時， 即得到環(huán)氧基介孔分子篩。將上述環(huán)氧基介孔分子篩用于青霉素?；傅墓潭ɑ玫降?固定化酶活性為8026U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了 80%的初始活性。
權(quán)利要求
一種用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征在于，該方法是用間氯過氧苯甲酸對含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩和表面乙烯基功能化的介孔分子篩的環(huán)氧化，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的環(huán)氧基官能團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征 在于，所述的方法具體包括如下步驟將乙烯基介孔分子篩加入到間氯過氧苯甲酸的二氯 甲烷溶液中，在30 50°C持續(xù)攪拌回流48 96小時后，過濾，將濾餅用二氯甲烷充分洗滌 三次，所得固體粉末在50 100°C真空干燥12 24小時，即得到環(huán)氧基介孔分子篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征 在于，所述的間氯過氧苯甲酸和乙烯基介孔分子篩的質(zhì)量比為1 3 1，所述的二氯甲烷 的體積和乙烯基介孔分子篩的質(zhì)量比為50 150 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩的制備方法，其特征 在于，所述的環(huán)氧基介孔分子篩可用于青霉素?；浮⑵咸烟钱悩?gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋 白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素酰化酶的固定化。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于生物酶固定化的環(huán)氧基介孔分子篩及其制備方法。本發(fā)明用間氯過氧苯甲酸對含有乙烯基的立方相Ia3d結(jié)構(gòu)的介孔分子篩和表面乙烯基功能化的介孔分子篩的環(huán)氧化，在介孔分子篩表面引入鏈長較短的環(huán)氧基官能團(tuán)，盡量減少表面功能化過程對于介孔分子篩的孔徑、比表面積和孔容的影響，不需要進(jìn)一步活化就可以直接使生物酶以共價(jià)結(jié)合方式固定在介孔分子篩表面，提高固定化酶的性能。將上述環(huán)氧基介孔分子篩可用于青霉素?；浮⑵咸烟钱悩?gòu)酶、葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特別適用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性為8416U/g，經(jīng)過10次循環(huán)使用后，固定化酶保留了90％的初始活性。
文檔編號C12N11/14GK101864410SQ20101014822
公開日2010年10月20日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者盧冠忠, 楊波, 王筠松, 王通海, 詹望成, 郭楊龍, 郭耘, 陳棟, 高振源 申請人:華東理工大學(xué)