專利名稱：小麥抗氧化相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及與小麥抗光抑制和光氧化相關(guān)的硫氧化還原因子蛋白及其編碼序列，包括該基因的克隆、表達(dá)模式及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)存在著大量的活性氧類物質(zhì)，這類物質(zhì)有兩種重要的作用。第一低含量的活性氧可以作為信號(hào)分子調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化等重要生理過程1 ；第二 大量的活性氧可以造成蛋白、DNA以及膜脂的損害進(jìn)而造成細(xì)胞的死亡2。生物在生命過程中往往很容易產(chǎn)生大量的活性氧，因此，清除過量的活性氧對(duì)生物體而言十分重要。Peroxiredoxin (PRX,過氧化物還原因子)作為一類廣泛存在的過氧化物酶可以參與各類活性氧的清除。在哺乳動(dòng)物中，根據(jù)PRX中保守半胱氨酸的數(shù)目和位置可以把PRX 分為 lCys-PRX，2Cys-PRX 和非典型 2Cys-PRX3 ；植物中則分為 ICys-PRX，2Cys_PRX，PRX Q和 II類PRX4。2Cys_PRX的C端Cys殘基參與清除活性氧的過程中可以依次被氧化成次磺酸形式、亞磺酸形式和磺酸形式。當(dāng)2Cys_PRX的C端Cys殘基成為亞磺酸形式的時(shí)候，需要 Sulfired0Xin(SRX，硫氧化還原因子)在鎂離子和ATP參與下幫助其恢復(fù)還原活性5，并且 SRX這種還原作用只特異地對(duì)2Cys-PRX進(jìn)行6’7。目前在動(dòng)物細(xì)胞中已經(jīng)分離結(jié)晶到人類的SRX與2Cys-PRX的復(fù)合體，它們形成四聚體之后又進(jìn)一步聚合成為十聚體形式存在8，并且SRX、2Cys-PRX、二價(jià)鎂離子、ATP形成一個(gè)四聚體幫助ATP攻擊2Cys_PRX的亞磺酸形式的C端Cys殘基開始第一步催化反應(yīng)9。植物中對(duì)SRX和2Cys_PRX的研究在擬南芥中進(jìn)行地較為深入7’1Q。擬南芥中 At2Cys-PRXA和At2Cys-PRX B兩個(gè)蛋白都存在于葉綠體當(dāng)中，SRX成熟蛋白也定位在葉綠體當(dāng)中，并且二者之間在存在特異的互相作用。植物的葉綠體是植物體內(nèi)最主要的活性氧產(chǎn)生源頭之一，葉綠體內(nèi)活性氧的積累可以造成光抑制和光漂白“。在擬南芥atsrx 缺失突變體中，葉綠體光合系統(tǒng)發(fā)生光抑制的程度大大增加，同時(shí)抗光漂白能力也很大程度的下降。體外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)AtSRX在二價(jià)鎂離子和ATP的參與下可以還原亞磺酸形式的 At2Cys-PRXA/B ；同時(shí)在各種引起活性氧爆發(fā)的脅迫條件下AtSRX的表達(dá)量都明顯增加。因此SRX在葉綠體的光合系統(tǒng)保護(hù)方面起著重要的作用12。六倍體普通小麥(小麥，亞基因組組分為AABBDD)是世界上最重要的糧食作物之一，由小麥面粉所制備的各類產(chǎn)品(如面包、饅頭、面條等)是廣大民眾的日常食品。隨著世界人口的大幅度增加和面食的廣泛推廣，小麥的需求量與日俱增。增加小麥的產(chǎn)量中核心的問題是改良小麥的光合作用，即培養(yǎng)高光效的、耐光脅迫性強(qiáng)的、抗逆性強(qiáng)的小麥品種 13O我們研究普通小麥小偃54 (XY54)中TaSRX及其編碼基因正是基于這個(gè)目的，深入揭示小麥耐光脅迫機(jī)制，通過轉(zhuǎn)基因獲得耐光脅迫性強(qiáng)和抗逆性強(qiáng)的高光效高產(chǎn)小麥。這對(duì)于普通小麥的遺傳改良有著極其重要的理論和實(shí)際意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過比對(duì)擬南芥和水稻等的SRX基因的EST序列，用同源克隆的方式從六倍體普通小麥小偃54(XY54)的基因組DNA中克隆到三個(gè)全長(zhǎng)的TaSRX的部分同源基因， 分別命名為TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D，并且克隆到了這三個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列。它們的全基因序列分別為1866bp、1972bp、2101bp ；全長(zhǎng)編碼框都是465bp ；都編碼154個(gè)氨基酸的蛋白。三個(gè)蛋白都含有植物中SRX特異的FSGCHR酶活中心氨基酸序列；都定位于葉綠體當(dāng)中，都可以和At2CPRXA/B相互作用。本發(fā)明旨在探索SRX同源基因在小麥中的功能，闡明TaSRX是否參與小麥葉綠體光合系統(tǒng)的保護(hù)，是否參與小麥抗光抑制和光氧化的過程， 是否在小麥中有功能分化，以及在不同遺傳背景下功能是否有強(qiáng)弱之分。首先，我們研究了 TaSRX基因在小麥不同器官中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式，并認(rèn)真分析了每個(gè)拷貝特異的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)它們主要表達(dá)在幼葉和旗葉；利用病毒介導(dǎo)的小麥內(nèi)源基因沉默技術(shù)研究對(duì)比六倍體普通小麥小偃54(XY54)和京411(J411)葉片光合系統(tǒng)在 SRX基因部分的情況下發(fā)生光抑制程度的變化，分析基因功能的同時(shí)比較基因功能在不同遺傳背景下的變化；利用病毒介導(dǎo)外源基因過表達(dá)技術(shù)在煙草葉片中分別過表達(dá)三個(gè)拷貝，分析三個(gè)拷貝的抗氧化功能強(qiáng)弱分化以及對(duì)煙草生物量有無影響。我們建立起一套獨(dú)特的分析小麥重要基因功能分析的辦法首先是先得到基因， 可以明確而有針對(duì)性地對(duì)該基因開展研究；其次是利用病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默和過表達(dá)技術(shù)分析基因功能和分化，而無需進(jìn)行圖位克隆。本發(fā)明揭示了小麥TaSRX基因的抗氧化功能，保護(hù)光合系統(tǒng)免除光抑制和光氧化的功能及其分化；證實(shí)了該基因在不同的遺傳背景下發(fā)揮作用的程度不同；同時(shí)該基因的表達(dá)可以增加植物的生物量。這些表明TaSRX基因可被用于培養(yǎng)高光效耐逆小麥的分子改良，前景廣闊。具體內(nèi)容如下1. 一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。2. 一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID N0. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。3. 一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列；編碼序列表中SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。4.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-A，其選自以上1中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-A所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID NO. 4的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與 SEQ ID NO. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。5.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-B，其選自以上2中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-B所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID NO. 5的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與 SEQ ID NO. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。6.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-D，其選自以上3中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-D所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與 SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。7.含有以上1-3中任一項(xiàng)所述基因的表達(dá)載體。8.以上7中所述的表達(dá)載體，其中所述載體是雙元農(nóng)桿菌載體。9.含有以上7或8中所述的表達(dá)載體的細(xì)胞系。10.以上1-3中任一項(xiàng)所述的基因在調(diào)節(jié)植物抗氧化功能或在保護(hù)光合系統(tǒng)免除光抑制和光氧化功能中的應(yīng)用。11.以上10中所述的應(yīng)用，其中所述植物是小麥，優(yōu)選是六倍體普通小麥，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。12. 一種分析小麥基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介導(dǎo)的內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)或外源基因過表達(dá)系統(tǒng)分析基因功能和分化。13.以上12中所述的方法，其中所述小麥?zhǔn)橇扼w普通小麥，如小偃54 (XY54)、京 411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。14.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介導(dǎo)的內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)是大麥條紋花葉病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介導(dǎo)的小麥內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)。15.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)系統(tǒng)是豌豆早褐病毒(PEBV)介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)系統(tǒng)。


圖1 :TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D全長(zhǎng)基因序列和擬南芥AtSRX、水稻OsSRX的結(jié)構(gòu)比對(duì)。箭頭所指的第2個(gè)內(nèi)含子是物種之間長(zhǎng)度相對(duì)變化最大的內(nèi)含子。圖2 =TaSRX-A(圖中以A表示)、TaSRX-B(圖中以B表示)、TaSRX-D(圖中以D表示)完整編碼框cDNA的比對(duì)。箭頭所指的是cDNA第178位的堿基，TaSRX-A中為A，TaSRX-D 中為T。圖3 =DNAstar軟件預(yù)測(cè)的TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D蛋白氨基酸序列與其它物種SRX蛋白全序列的比對(duì)。方框和箭頭指示所有SRX蛋白都含有的酶活中心“FSGCHR”。圖4 六倍體小麥中TaSRX基因的拷貝數(shù)鑒定。用帶有熒光標(biāo)記的跨第二個(gè)內(nèi)含子的保守引物擴(kuò)增六倍體小麥及其亞基因組供體材料基因組DNA，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)電泳分析。圖5 :TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位。圖5_1是轉(zhuǎn)基因載體示意圖；圖 5-2是對(duì)表達(dá)TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥(互補(bǔ)atsrx突變體7的株系) 的葉片進(jìn)行Confocal活體觀察的結(jié)果，第1列是GFP熒光，第2列是葉綠素?zé)晒猓?列是前兩列熒光的疊加。從上到下依次是野生型擬南芥(Columbia，WT)、GFP互補(bǔ)atsrx擬南芥株系和TaSRX-A/B/D-GFP互補(bǔ)atsrx擬南芥株系的結(jié)果。圖6 六倍體普通小麥小偃54不同器官中TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)，分別是用跨第二個(gè)內(nèi)含子的保守引物和TaSRX-A、TaSRX-B、 TaSRX-D的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。圖7 六倍體普通小麥小偃54(XY54)和京411 (J411)中病毒介導(dǎo)的TaSRX基因沉默效果以及光合生理指標(biāo)，圖中WT代表未接種病毒的小麥，GFP代表接種了帶有GFP標(biāo)簽病毒的小麥，Srx代表接種了帶有SRX基因片段病毒的小麥。圖7-1 實(shí)時(shí)PCR分析小偃54 和京411中BSMV介導(dǎo)的TaSRX基因沉默效果，同樣分別用圖6中的4對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增；圖 7-2 小偃54和京411葉片在強(qiáng)光和強(qiáng)光低溫脅迫條件下Fv/Fm的變化，F(xiàn)v/Fm是指植物葉片光合系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率；圖7-3 小偃54和京411葉片在強(qiáng)光和強(qiáng)光低溫脅迫條件下NPQ的變化(非光化學(xué)耗散)；圖7-4 小偃54和京411強(qiáng)光低溫脅迫條件下凈光合速率(Pn)的變化。圖8 煙草中病毒介導(dǎo)的TaSRX基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。圖8-1 煙草中PEBV介導(dǎo)的TaSRX 基因過表達(dá)狀況；圖8-2 煙草地上部分生物量的測(cè)量；圖8-3 煙草葉片對(duì)Paraquat造成的光氧化的耐受程度；圖8-4 =Paraquat處理前后煙草葉片的葉綠素相對(duì)含量；圖8_5 Paraquat處理前后煙草葉片的過氧化氫的相對(duì)含量；圖8_6 煙草葉片在強(qiáng)光和強(qiáng)光低溫脅迫條件下Fv/Fm的變化；圖8-7 煙草葉片在強(qiáng)光和強(qiáng)光低溫脅迫條件下NPQ的變化。圖9 載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中9-1是pJIT163-TaSRX_GFP中間載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖 9-2是pCAMBIA-1300載體結(jié)構(gòu)示意圖。序列說明SEQ ID NO. 1SEQ ID NO. 2SEQ ID NO. 3SEQ ID NO. 4SEQ ID NO. 5SEQ ID NO. 6SEQ ID NO. 7SEQ ID NO. 8SEQ ID NO. 9
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，下述實(shí)施例僅是用于舉例說明的目的，并非限制本發(fā)明。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所界定。實(shí)施例1 =TaSRX基因的同源克隆以及基因結(jié)構(gòu)分析
= TaSRX-A基因的全長(zhǎng)序列； = TaSRX-B基因的全長(zhǎng)序列； = TaSRX-D基因的全長(zhǎng)序列； = TaSRX-A的蛋白序列； = TaSRX-B的蛋白序列； = TaSRX-D的蛋白序列； = TaSRX-A基因的編碼序列； = TaSRX-B基因的編碼序列；和 = TaSRX-D基因的編碼序列。
通過NCBI-Blastn搜索到SRX基因所有的EST序列，通過比對(duì)拼接得到三類在六倍體小麥(亞基因組組分為AABBDD)中發(fā)現(xiàn)的SRX基因全長(zhǎng)EST序列。在ATG和TGA處設(shè)計(jì)保守引物同時(shí)克隆這3個(gè)拷貝，依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，T-A連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)，37°C培養(yǎng)，菌落PCR鑒定得到陽性克隆，陽性質(zhì)粒提取，最后進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序得到三個(gè)拷貝的基因組全長(zhǎng)序列。它們與擬南芥和水稻SRX基因(即AtSRX和OsSRX) 比對(duì)如附圖1所示。具體步驟如下所述所用引物為5，-ACGAATGGCGTCGACCTCGAGCTT-3，和 5，-CATCGCTAACCACCAATTCATCG CATAT-3，。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min ;94°C 40s,68°C 2. 5min，兩步法33個(gè)循環(huán)； 68°C 7min。反應(yīng)體系 50 μ 1 :10XPCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ l，LA_Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng小偃54(ΧΥ54)基因組DNA(XY54種子來自中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所李振聲院士實(shí)驗(yàn)室14)，DNA來自幼苗期的葉片，提取方法如下段描述)，2. 5mmol dNTP 4μ1，5μπι01引物各Ιμ ，加滅菌雙蒸水至50μ1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒(Gel Extraction KIT，購(gòu)自鼎國(guó)公司)從瓊脂糖凝膠上純化目標(biāo)TaSRXDNA片段(方法參照試劑盒說明書)，用Eppendorf公司BioPhotometer測(cè)定濃度后用于酶切、連接或存_20°C 備用。純化的TaSRX DNA片段與pGEM-T Easy載體(Promega公司，氨芐霉素抗性)連接 (T4-DNAligase, Promega公司，按照試劑盒說明書操作)，熱激轉(zhuǎn)化(42°C 90S)入大腸桿菌 DHlOB(Invitrogen公司)。從得到的克隆轉(zhuǎn)化子中用菌落PCR(引物為上述擴(kuò)增引物)鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒(小提質(zhì)粒試劑盒，北京博大泰克公司，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行)。小麥基因組DNA提取方法將新鮮的小麥幼苗經(jīng)液氮冷凍后充分研磨， 取IOOmg粉末于滅菌2mL Eppendorf管中；加入ImL CTAB提取緩沖液{1. 3 % CTAB (HexadecylTrimethyl Ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨，購(gòu)自 Amresco 公司)，133mmol/LTris-HCl ρΗ8· 0(Tris 購(gòu)自 Amresco 公司，HCl 購(gòu)自北京化工廠)，13mmol/ LEDTA(購(gòu)自 Amresco 公司)，0.93mol/L NaCl (購(gòu)自北京化工廠)，0. 66% PVP 3600 (購(gòu)自 Amresco公司)，0. 18mol/L β -巰基乙醇(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)}，混勻； 65°C溫浴1. 5h，其間不時(shí)混合樣品，以充分提??；待樣品冷卻至室溫，加入ImL氯仿/異戊醇(24 1，均購(gòu)自北京化工廠)進(jìn)行抽提，輕輕顛倒混勻Ihr ；4°C，12000rpm離心15min ； 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，重復(fù)氯仿/異戊醇抽提一次；吸取上清液至一新的離心管中，加入3yL RNase A(10mg/ml，購(gòu)自Sigma公司)，室溫下在搖床上消化45min ；緩慢加入420 μ L異丙醇(購(gòu)自北京化工廠)，輕輕上下?lián)u晃，直到出現(xiàn)白色DNA沉淀；用槍頭挑出 DNA，用ImL Wash I溶液(76%乙醇-購(gòu)自北京化工廠，200mM NaAc-購(gòu)自北京化工廠)浸泡洗滌15min。輕柔離心，棄上清；吸干殘余液體，DNA沉淀室溫吹干至透明，加入100 μ L TE溶液 (Tris-EDTA溶液，ρΗ8. 0)；待DNA充分溶解后，測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量；經(jīng)適當(dāng)稀釋后直接用于PCR反應(yīng)或儲(chǔ)存于_70°C冰箱備用。如附圖1所示該基因結(jié)構(gòu)在不同物種相當(dāng)保守，包含了 5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其中第二個(gè)內(nèi)含子在各個(gè)物種之間長(zhǎng)度變化幅度很大。實(shí)施例2 =TaSRX基因cDNA序列的克隆及蛋白序列預(yù)測(cè)和比對(duì)
用實(shí)施例1中相同的引物克隆XY54TaSRX的cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min;94°C 40s, 68°C lmin，兩步法 33 個(gè)循環(huán)；68°C 7min。反應(yīng)體系 50 μ 1 :10XPCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ 1，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 小偃 54cDNA, 2. 5mmoIdNTP 4 μ 1， 5 μ mo 1引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化目標(biāo)TaSRX cDNA片段，Eppendorf公司BioPhotometer測(cè)定濃度后用于酶切、連接或存_20°C備用。純化的TaSRX cDNA片段與pGEM_T Easy載體連接，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B。菌落PCR(引物為上述擴(kuò)增引物)鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒。具體的分子克隆技術(shù)說明如實(shí)施例1中所示。其中，小偃54RNA提取如下實(shí)驗(yàn)所用材料的總RNA提取采用RNAeasy PlantMini Kit(Qiagen，Valencia, CA)試劑盒或 TRIZOL (Invitrogen 公司)提取。模板 cDNA 第一鏈合成在滅菌的Eppendorf管中按順序加入6yg上述總RNA和3μ 1 oligo(dT) ；70°C水浴 10分鐘后，迅速置于冰上冷卻；按以下順序加入以下溶液5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μ1DTT6 μ 1dNTPs6 μ 1RNasin1 μ 1加水補(bǔ)足58 μ 137°C溫育2分鐘；加入2 μ 1 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，37°C反應(yīng)1_2小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將Eppendorf管取出，70°C處理15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；反應(yīng)合成的cDNA第一鏈可用作 PCR反應(yīng)的模板。其中使用的試劑如下M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和0. IM DTT (Gibco) ；dNTPs (IOmM each)和 oligo(dT)18(500 y g/ml) (Sangon) ;RNasin(40U/ml，Takara) ；5X 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 (Takara )。如附圖2和3中所示TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D的cDNA (序列分別表示為SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3)和蛋白(序列分別表示為 SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6)序列(DNAstar軟件預(yù)測(cè))的比對(duì)結(jié)果顯示它們之間有98%的相似性，長(zhǎng)度都是465bp，編碼154個(gè)氨基酸的蛋白。三個(gè)拷貝蛋白序列的物種分析比對(duì)結(jié)果表明它們具有典型的“FSGCHR”的酶活中心；TaSRX-A、TaSRX-D除了信號(hào)肽的微小差別之外，成熟蛋白區(qū)域只有1個(gè)氨基酸的差異(第60位，TaSRX-A為Serine，TaSRX-D為Cystine)，而這個(gè)氨基酸的差異是由二者的 cDNA 第 178 位的一個(gè) SNP (Single Nucleotide Polymorphysim, 單核苷酸多態(tài)性)A-T造成。實(shí)施例3 =TaSRX基因拷貝數(shù)的確定-熒光標(biāo)記的DNA片段分析技術(shù)采用熒光標(biāo)記的跨第2個(gè)內(nèi)含子的保守引物(僅在上游引物的5’端標(biāo)記D4 熒光標(biāo)記，Takara)擴(kuò)增小偃54(亞基因組組分為AABBDD)、京411 (亞基因組組分為 AABBDD,種子來自中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所李振聲院士實(shí)驗(yàn)室14，DNA來自幼苗期的葉片)、 Langdon (亞基因組組分為AABB，種子購(gòu)自美國(guó)的Graingene)、烏拉爾圖小麥(亞基因組組分為AA，種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所)、山羊草(亞基因組組分為DD，種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所)基因組DNA(提取方法參考實(shí)施例1)，得到的PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)證實(shí)目標(biāo)帶存在之后進(jìn)行變性(95°C，10min)，用CEQ TM 8000 GeXP System—Genetics Analysis System(美國(guó)貝克曼公司)進(jìn)行毛細(xì)電泳，分辨率為lbp。電泳條件為4. 8千伏，變性時(shí)間120秒，注射時(shí)間15秒，分離時(shí)間50分鐘。所用保守引物為 5，-CTCATGGACAGCATCCGTGT-3，(帶有 5，熒光標(biāo)記)，5，-GGTTGATTCTGGGATATGGCA-3，；產(chǎn)物大小為TaSRX-A-403bp、TaSRX_B_508bp、TaSRX_D_643bp ；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min ；94°C 35s, 56°C 35s，72°C 40s，33 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；反應(yīng)體系 50 μ 1 :10XPCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ l(Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 基因組 DNA，2. 5mmol dNTP4y l，5ymol引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。如附圖4所示片段分析的結(jié)果對(duì)應(yīng)于引物擴(kuò)增的每個(gè)條帶只有一個(gè)峰，表明沒有其它的拷貝存在。因此證實(shí)六倍體普通小麥中只有TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D這三個(gè)拷貝。山羊草中存在兩種類型的D拷貝類型，其中第一種類型與六倍體中TaSRX-D —致，而第二種則比TaSRX-D少了一段內(nèi)含子，這段內(nèi)含子正是TaSRX-D較TaSRX-B多出的內(nèi)含子?，F(xiàn)已證實(shí)這段內(nèi)含子是來自葉綠體基因組的一段序列實(shí)施例4 =TaSRX-A, TaSRX-B, TaSRX-D的成熟蛋白定位于葉綠體為了得到最確切的TaSRX蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果，我們用TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D轉(zhuǎn)擬南芥atsrx的突變體植株7 (來自SALK Institute)，得到純合的擬南芥轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系。轉(zhuǎn)基因載體如附圖5-1所示，GFP連接在TaSRX的C端。用這些轉(zhuǎn)基因植株的葉片觀察到TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D和GFP融合蛋白的熒光與葉綠素的熒光重疊，表明它們都定位在葉綠體當(dāng)中，結(jié)果如附圖5-2所示。具體方法如下所述我們采用PJIT163-GFP (氨芐霉素抗性，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建15)和pCAMBIA_1300 (卡那霉素抗性)載體(購(gòu)自國(guó)際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心)構(gòu)建轉(zhuǎn)化擬南芥的雙元載體。先構(gòu)建 pJIT163-TaSRX-GFP 中間載體引物是 5，-AC AAGCTTATGGCGTCGACGTCGAGCTTGGATT-3，( 帶有 Hind III 接頭)和 5，-AC GGATCCTCGCATATGGTGCCGCAGTG-3，(帶有 BamH I 接頭)； PCR擴(kuò)增實(shí)施例2中TaSRX的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒，產(chǎn)物回收純化，使用Hind III和BamH I進(jìn)行酶切再純化，連接同樣由Hind III和BamH I酶切之后回收純化的pJIT163_GFP載體，熱激轉(zhuǎn)化細(xì)菌(大腸桿菌DH10B，Irwitrogen公司)，經(jīng)菌落PCR鑒定陽性克隆，提質(zhì)粒得到 pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中間載體，測(cè)序無誤之后進(jìn)行下一步。再構(gòu)建1300_TaSRX_GFP 雙元載體作為擬南芥轉(zhuǎn)化的載體用Kpn I和Xho I酶切pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中間載體，Kpn I和Sal I酶切pCAMBIA_1300載體，回收純化相應(yīng)的片段(分別包含35S Promotor-TaSRX-GFP 和 pCAMBIA-1300 的酶切片段)，連接構(gòu)建 1300-TaSRX A/B/D-GFP, 熱激轉(zhuǎn)化細(xì)菌(大腸桿菌DH10B)，菌落PCR鑒定陽性克隆，提質(zhì)粒得到1300-TaSRX Α/Β/ D-GFP載體。具體的分子克隆技術(shù)如實(shí)施例1中所示。pJIT163-TaSRX-GFP中間載體和 pCAMBIA-1300的結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖9_1和9_2所示。農(nóng)桿菌感受態(tài)制備挑取農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens GV3101(利福平 Rif 抗性，50mg/L)GV3101凍存菌(菌株購(gòu)自英國(guó)John Innes Center)，在LB (含50 μ g/ml利福平) 平皿劃線28°C培養(yǎng)1-2天，將生長(zhǎng)良好的單菌落接種于3-5ml LB (含50 μ g/ml利福平， Sigma)液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；吸出Iml菌液接種于IOOml LB (含50 μ g/ml禾Ij 福平)液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)6-8小時(shí)至0D_為0. 5左右，將菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管， 放置冰上30分鐘，然后離心收集菌體(5，OOOrpm, 10分鐘，4°C )；棄去上清，加入Iml冰冷的0. 15M氯化鈉溶液輕輕懸浮菌體，再加入約10ml，使菌體分散均勻，冰上放置30分鐘，離心收集菌體(5，OOOrpm, 10分鐘，4°C )；棄去上清，加入Iml冰冷的20mM氯化鈉溶液懸浮菌體，將制好的感受態(tài)細(xì)胞以0. 2ml/管分裝，在液氮中速凍1分鐘后保存在_70°C備用。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將1 μ g以上制備的質(zhì)粒，即1300-TaSRX A/B/D-GFP載體加入含0. 2ml的農(nóng)桿菌感受態(tài)的Eppendorf管中，冰上放置30分鐘；將含有該質(zhì)粒和農(nóng)桿菌感受態(tài)的Eppendorf管放入液氮速凍1分鐘，然后再37°C溫育3分鐘；加入Iml LB液體培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)；5, OOOrpm離心1分鐘，棄去上清，加入200 μ 1 LB液體培 養(yǎng)基， 重懸沉淀；取200 μ 1重懸液(即轉(zhuǎn)化產(chǎn)物)均勻地涂于含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，28°C培養(yǎng)2-3天；挑取適量的轉(zhuǎn)化菌斑PCR鑒定無誤后搖菌轉(zhuǎn)化擬南芥植株。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥將鑒定無誤的農(nóng)桿菌接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中(含50μ g/ ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素，卡那霉素購(gòu)自Sigma)，28°C震蕩培養(yǎng)過夜；次日以1 100 的比例轉(zhuǎn)移至400ml LB液體培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素)，28°C 震蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8左右；離心收集菌體，用400ml轉(zhuǎn)化緩沖液{0. 5 XMS鹽(Murashige & Shoog Medium，購(gòu)自Duchefa Biochemia)，5%蔗糖(購(gòu)自北京化工廠)，調(diào)節(jié)pH 5. 7后加入 0·44μΜ benzylamine purine (苯胺嘌呤，購(gòu)自 Sigma)，0· 02% Silwet (表面活性劑， 購(gòu)自Ameresco)}懸浮該農(nóng)桿菌；抽真空轉(zhuǎn)化擬南芥植株，即將剪枝后4-6天的植株倒置于含其中懸浮有以上農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化緩沖液的玻璃瓶中，抽真空，維持40秒；取下植株，避光保濕側(cè)放24小時(shí)，然后將種植盆直立，按正常的方法培育植株至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子。擬南芥轉(zhuǎn)基因純合株系的篩選將干燥一周后的種子播種于含50μ g/ml潮霉素(hygromycin,購(gòu)自Sigma)和50 μ g/ml頭孢霉素(購(gòu)自Sigma)的0. 5XMS培養(yǎng)基上， 每皿500粒左右；4°C春化2-3天，23°C培養(yǎng)，只有含外源片段的轉(zhuǎn)基因植株才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；長(zhǎng)出的植株生長(zhǎng)到6片真葉時(shí)，移至種植盆中生長(zhǎng)，待成熟后分單株收獲種子(Tl代)；收取的Tl代種子分單株在含50μ g/ml潮霉素的選擇培養(yǎng)基上撒播，將發(fā)生 3 1分離的單株系的存活苗移栽至種植盆中生長(zhǎng)，再分單株收獲種子(T2代)；收取的 T2代種子分單株在含50 μ g/ml潮霉素的選擇培養(yǎng)基上撒播，不發(fā)生任何分離的株系可以分單株收取種子(T3代)。T3代種子即為純合單拷貝轉(zhuǎn)基因株系，可以進(jìn)行繁種擴(kuò)增以便進(jìn)行亞細(xì)胞定位和后期的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。擬南芥正常培養(yǎng)條件23°C ；光照強(qiáng)度100 μ mol photons · m_2 · s—1 (單位面積單位時(shí)間內(nèi)通過的光量子摩爾數(shù))；16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗。實(shí)施例5 =TaSRX多表達(dá)在小麥的葉片中采集小偃54的各類器官幼葉、旗葉、根、莖、幼穗、花、種子，并提取它們的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA (方法參看實(shí)施例2)。實(shí)時(shí)PCR16分析TaSRX總的表達(dá)模式和TaSRX A/B/D拷貝特異的表達(dá)模式。如附圖6中所示=TaSRX多表達(dá)在幼葉和旗葉中，TaSRX A多表達(dá)在旗葉中，TaSRX B多表達(dá)在幼葉和種子中，TaSRX D多表達(dá)在旗葉中。分析TaSRX所用引物為實(shí)施例3中的保守引物；分析TaSRX A所用特異引物17是 5，-GCTTGGATTTGGGAAAGATCAGT-3，和 5，-TCCGAGTCACTCAATGCGTAG-3，(PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件 95°C預(yù)變性 3min ;94°C 20s, 58. 5°C 20s, 72°C 20s，40 個(gè)循環(huán).)；分析 TaSRX B 所用特異引物是5，-ACCTCGAGCTTGGAGTTGAGG-3，和 5，-TTCTTCTCCGAGTCACTCAGAGG-3’(PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 3min ;94°C 20s, 56°C 20s, 72°C 20s，40 個(gè)循環(huán).)；分析 TaSRX D 所用特異引物是5，-TCGAGCTTGGATTTGGGAAAGATCGTG-3，和 5，-CCTAAGCGCTGGTGAGCCTCACAT-3， (PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 3min ;94°C 20s, 66°C 20s, 72°C 20s，40 個(gè)循環(huán).)。PCR 反應(yīng)體系 50 μ 1 10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ 1 (Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng基因組DNA，2. 5讓ol dNTP4 μ l,5ymol引物各1μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ L· 實(shí)施例6 六倍體小麥中TaSRX保護(hù)葉綠體光合系統(tǒng)的功能為了研究小麥中TaSRX基因的功能，我們利用BSMV (Barly Stripe Mosaic Virus) 介導(dǎo)的小麥內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)18’19’2°下調(diào)了小偃54和京411中TaSRX的表達(dá)。研究了在 TaSRX基因部分沉默的情況下，小偃54和京411在正常生長(zhǎng)條件和脅迫條件下的光合系統(tǒng)效率變化。如附圖7所示沉默該基因造成小偃54和京411在脅迫條件下的光合系統(tǒng)效率 (Fv/Fm)大大下降、光抑制程度加強(qiáng)、非光化學(xué)耗散(NPQ)增多和凈光合速率(Pn)的下降。 這表明TaSRX在六倍體小麥種發(fā)揮了抗氧化和保護(hù)光合系統(tǒng)免受光抑制的作用，同時(shí)這種作用和小麥葉綠體內(nèi)部的非光化學(xué)耗散也是緊密相關(guān)的。京411缺失該基因表現(xiàn)出比小偃 54更加敏感的表型，表明TaSRX基因已經(jīng)在不同的遺傳背景下發(fā)揮了不同程度的功能。具體方法如下所述構(gòu)建BSMV γ -TaSRX 載體所用引物為 5，-ATA GCTAGCATGGCGTCGACCTCGAGCT-3， 禾口 5，-ATT GCTAGCGGCCTTTCTTCTCCGAGTCA-3，(2 條引物都包含 Nhe I 酶切接頭)；以實(shí)施例2中cDNA質(zhì)粒為模版擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，使用Nhe I酶切PCR回收片段和BSMV Y，回收目的片段并連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌(DH10B，Invitrogen公司)，菌落PCR鑒定陽性克隆，提質(zhì)粒得到目的載體并測(cè)序。具體的分子克隆技術(shù)如實(shí)施例1中所示。載體圖譜和病毒介導(dǎo)的小麥內(nèi)源基因沉默(VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程詳見參考文獻(xiàn)18。病毒載體接種小麥葉片后10天提取小麥第3片葉子的RNA并進(jìn)行cDNA合成(方法如實(shí)施例2中所示)，實(shí)時(shí)PCR16分析TaSRX總的沉默效果(相對(duì)于未接種的小麥對(duì)照和接種帶有GFP的病毒的小麥)和TaSRX A/B/D拷貝特異的沉默效果(所用引物和方法與實(shí)施例5中一致)。我們發(fā)現(xiàn)接種含TaSRX病毒的小麥TaSRX-RNA被沉默到對(duì)照TaSRX-RNA 的5-40%之間，符合功能試驗(yàn)的要求。Fv/Fm和NPQ的檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)16和21 ；凈光合速率的檢測(cè)21按照生產(chǎn)商的說明，使用美國(guó)LI-COR公司的Li-6400便攜式光合測(cè)定儀。強(qiáng)光處理?xiàng)l件1200μπιΟ1 photons ·πΓ2 · s—1，25 °C，2h ；強(qiáng)光低溫處理?xiàng)l件 1200 μ mol photons · m2 · s-1，6°C, 2h。實(shí)施例7 : TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D 的功能分化在六倍體普通小麥當(dāng)中驗(yàn)證TaSRX基因具有保護(hù)光合系統(tǒng)的功能，但是由于小麥的遺傳背景的復(fù)雜性以及TaSRX基因A、B、D拷貝之間的高度保守性(目前還不可能在小麥中單獨(dú)沉默單個(gè)SRX拷貝)，在小麥中研究該基因的功能分化遇到了瓶頸，因此我們又進(jìn)一步在煙草中分別研究TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的抗氧化功能和分化。如附圖8所示，煙草中PEBV(豌豆早褐病毒)介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)20實(shí)驗(yàn)表明抗氧化和保護(hù)光合系統(tǒng)功能TaSRX-A > TaSRX-B > TaSRX_D。附圖8_1表明這個(gè)病毒介導(dǎo)的過表達(dá)系統(tǒng)是有效的，TaSRX-GFP的免疫印跡檢測(cè)表明蛋白不但表達(dá)了，而且表達(dá)水平比較一致，所用一抗為抗-GFP，所用二抗為抗-小鼠-AP酶標(biāo)。附圖8-2 過表達(dá)TaSRX-A的煙草表現(xiàn)出生物量增加。附圖8-3、8-4和8-5表明過表達(dá)TaSRX-A的煙草葉片在正常生長(zhǎng)條件下葉綠素增加；在paraquat光漂白耐受實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)TaSRX-A的煙草葉片抗光氧化漂白能力最強(qiáng)(維持了最大的葉綠素含量)，同時(shí)過氧化氫含量最低。如附圖8-6和8-7所示在引發(fā)光抑制的脅迫實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)TaSRX-A的煙草葉片維持了最大的光合系統(tǒng)效率， 同時(shí)具有最小程度的非光化學(xué)耗散；過表達(dá)TaSRX-B的煙草葉片次之；過表達(dá)TaSRX-D的煙草葉片發(fā)生光抑制的程度接近GFP對(duì)照，光合效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于表達(dá)TaSRX-A的葉片，同時(shí)非光化學(xué)耗散最大。TaSRX A和D的cDNA 178bp處的SNP (附圖2)互相突變之后產(chǎn)生TaSRX Am和 TaSRX Dm,TaSRX Dm 即為 TaSRX A,TaSRX Am 即為 TaSRX D。如附圖 8 中所示TaSRX_Am 的功能接近TaSRX-D，TaSRX-Dm的功能接近TaSRX_A。TaSRX-A和TaSRX-D功能差異源于蛋白第60位的一個(gè)氨基酸，TaSRX-A中為絲氨酸(Ser)，TaSRX-D中為半胱氨酸(Cys)，而交互突變之后發(fā)生了功能的互變，這充分說明了這個(gè)SNP對(duì)于TaSRX-A強(qiáng)大的抗氧化功能的重要性。煙草中PEBV(豌豆早褐病毒)介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)體系如下1、載體構(gòu)建PEBV-pCACE2-TaSRX_GFP (具體的載體圖譜酶切位點(diǎn)參考文獻(xiàn)22)。所用引物為5，-AT CCATGG CGTCGACCTCGAGCTT-3，，5，-TACCATGG CTCGCATATGGTGCCGCAGT-3，(2條引物都帶有Nco I酶切位點(diǎn))；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C 預(yù)變性 5min;94°C 35s, 58 °C 35s, 72 °C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72 °C IOmin ；反應(yīng)體系 50 μ 1 10 X PCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，LA-Taq酶(Takara公司)0. 5 μ 1，1 μ 1實(shí)施例2中的cDNA質(zhì)粒， 2. 5mmol dNTP 4 μ 1，5 μ mol引物各1 μ 1，加滅菌雙蒸水至50 μ 1。PCR產(chǎn)物目的條帶回收純化，Nco I酶切基因片段和載體PEBV-pCACE2-GFP載體(載體來自丹麥農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，回收連接基因和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，鑒定克隆陽性克隆，提質(zhì)粒。具體的分子克隆技術(shù)如實(shí)施例1中所示。2、經(jīng)Nco I酶切測(cè)序驗(yàn)證的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101(菌株購(gòu)自英國(guó)John Innes Center)，同時(shí)分別用pCAPEl和pCAPE2-GFP、pCAPE2_PDS (載體均購(gòu)自丹麥農(nóng)業(yè)科學(xué)院)轉(zhuǎn)化GV3101 (轉(zhuǎn)化方法參見實(shí)施例4)。3、煙草準(zhǔn)備25°C培養(yǎng)間內(nèi)，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，蛭石中生長(zhǎng)的本氏煙草苗 (煙草種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))，長(zhǎng)到5-6片展開葉時(shí)用于農(nóng)桿菌注射。4、煙草注射DpCAPEl及pCAPE2_GFP、pCAPE2_PDS轉(zhuǎn)GV3101后鑒定無誤，挑取轉(zhuǎn)化成功的克隆劃線 28 °C 培養(yǎng)過夜(LB 培養(yǎng)基，50 μ g/ml Rif(Sigma)，50 μ g/ml Kana(Sigma)；2)挑取上述過夜菌接種到5ml LB (50 μ g/ml Rif，50 μ g/ml Kana)中28°C培養(yǎng)過夜；3)將上述過夜的菌液轉(zhuǎn)接到50ml LB (IOmM MES (Ameresco)+20 μ M乙酰丁香酮 (Sigma) +50 μ g/ml Kana)中，28°C培養(yǎng)過夜；4)離心收集上述菌液，然后重懸在LB(10mM MgC12+10mM MES+200 μ M乙酰丁香酮)中，調(diào)0D600 = 2. 0，在室溫下靜置3小時(shí)；5)按pCAPEl pCAPE2 = 1 1注射煙草，注射時(shí)要注射近軸端的嫩葉；6)兩周后觀察表型，進(jìn)行蛋白檢測(cè)，之后進(jìn)行各種生理實(shí)驗(yàn)。
參考t獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.一種小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列； 編碼序列表中SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和與SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
4.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-A，其選自權(quán)利要求1中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-A所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID N0. 4的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與SEQ ID N0. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 4衍生的氨基酸序列。
5.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-B，其選自權(quán)利要求2中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-B所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID N0. 5的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與SEQ ID N0. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。
6.小麥抗氧化相關(guān)蛋白TaSRX-D，其選自權(quán)利要求3中的小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-D所編碼的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺少或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有與SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。
7.含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述基因的表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求7中所述的表達(dá)載體，其中所述載體是雙元農(nóng)桿菌載體。
9.含有權(quán)利要求7或8中所述的表達(dá)載體的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的基因在調(diào)節(jié)植物抗氧化功能或在保護(hù)光合系統(tǒng)免除光抑制和光氧化功能中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求10中所述的應(yīng)用，其中所述植物是小麥，優(yōu)選是六倍體普通小麥，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。
12.—種分析小麥基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介導(dǎo)的內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)或外源基因過表達(dá)系統(tǒng)分析基因功能和分化。
13.權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述小麥?zhǔn)橇扼w普通小麥，如小偃54(XY54)、京 411 (J411)、Langdon、烏拉爾圖小麥和山羊草。
14.權(quán)利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介導(dǎo)的內(nèi)源基因沉默系統(tǒng)是大麥條紋花葉病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介導(dǎo)的小麥內(nèi)源基因沉默系
15.權(quán)利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)系統(tǒng)是豌豆早褐病毒(Pea Early Browning Virus, PEBV)介導(dǎo)的外源基因過表達(dá)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了小麥抗氧化相關(guān)基因TaSRX-A、TaSRX-B和TaSRX-D及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明還公開了所述基因及其編碼蛋白在調(diào)節(jié)植物抗氧化功能或在保護(hù)光合系統(tǒng)免除光抑制和光氧化功能中的應(yīng)用。該基因在光脅迫條件下能起到清除活性氧、保護(hù)光合系統(tǒng)，使植物的抗光抑制和抗光氧化能力增強(qiáng)，進(jìn)而提高植物的生物量。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白對(duì)于普通小麥耐光脅迫機(jī)制的研究具有重要的理論意義，對(duì)于提高普通小麥和其它重要農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要的理論以及實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102220346SQ20101014760
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者劉昕, 張坤普, 王燃, 王道文, 秦?zé)ň?申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所