專利名稱：一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域，具體是一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
多年來，人們一直在研究細(xì)胞的重編程及細(xì)胞核的潛在全能性，1998年多利羊的 誕生標(biāo)志著已將這一研究工作推進(jìn)到哺乳動物領(lǐng)域。2006年，日本京都大學(xué)的Yamanaka 教授在《Cell》上發(fā)表了具有里程碑意義的文章(Takahashi K和Yamanaka S，2006)，詳 細(xì)介紹了其利用四種限定因子(0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)將小鼠成纖維細(xì)胞重編程 逆轉(zhuǎn)為類似于多能性干細(xì)胞的研究工作及結(jié)果，從此開創(chuàng)了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS)時代。由于多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cells)具 有形成人和動物個體內(nèi)所有類型細(xì)胞的多向分化潛能和不斷自我更新的特性，使其在細(xì)胞 替代治療、基因治療、發(fā)育生物學(xué)研究、藥理及毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著其獨(dú)特的作用和 優(yōu)越性，也正是由于誘導(dǎo)性多能干技術(shù)研究同時具備如此深遠(yuǎn)的科學(xué)價值和廣泛的應(yīng)用價 值，其已成為當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，并在2007年分別被NatunScience評為第一及 第二大科學(xué)進(jìn)展，又在2008年榮登Science十大科技進(jìn)展榜首。在國內(nèi)，中國科學(xué)院動物研 究所周琪研究組和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院曾凡一研究組合作誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞通過四倍體胚胎互補(bǔ)技術(shù)獲得了完全由誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞制備的活體小鼠，有力地證 明了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞具有真正的全能性(Zhao XY et al.，2009)。周琪等將誘導(dǎo)性多能 干細(xì)胞研究推進(jìn)到了一個新的高度，成為中國科學(xué)家在這一國際熱點(diǎn)研究領(lǐng)域所作出的一 項(xiàng)重要貢獻(xiàn)。這一合作研究成果“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的全能性被首次證明”成功入選2009 年中國十大科技進(jìn)展新聞和世界十大科技進(jìn)展新聞。與小鼠、大鼠、猴子等動物來源的胚胎不同，從豬胚胎分離出的細(xì)胞系在培養(yǎng)過程 中很不穩(wěn)定，很快就會失去其特性。盡管各國科學(xué)家已有多年的嘗試，但目前尚未有成功分 離豬的多能性胚胎干細(xì)胞系的報(bào)道。因此如果通過限定因子成功誘導(dǎo)產(chǎn)生具有全能性的豬 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，那么就能夠有效地利用其干細(xì)胞特征進(jìn)行相關(guān)的科學(xué)研究。例如，借助 豬和人有許多生理同源性，利用豬源的多能性干細(xì)胞系可再現(xiàn)人類重大疾病(如心血管系 統(tǒng)疾病)的發(fā)生發(fā)展過程、開發(fā)相應(yīng)的大動物模型，用于針對該重大疾病的藥物研發(fā)以及 病因發(fā)病機(jī)制的研究。同時，中國是豬肉產(chǎn)品最大的生產(chǎn)和消費(fèi)國，豬源的誘導(dǎo)性多能干細(xì) 胞同樣有可能用于提高豬肉質(zhì)量以及與干細(xì)胞相關(guān)的飼養(yǎng)方式。目前，世界上關(guān)于豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)的研究僅有3篇文獻(xiàn)報(bào)道，最早是在 中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組獲得了成功。他們利用逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)人或小鼠4種限定因子基因(0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)成功將西 藏小型豬的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成西藏豬的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其形態(tài)類似于人類或猴類的 胚胎干細(xì)胞。該研究結(jié)果在線發(fā)表于2009年4月21日的《The Journal of Biological Chemistry》雜志上(Esteban MA et al. , 2009) 0隨后，中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué) 研究所肖磊博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組和美國哥倫比亞州密蘇里大學(xué)R. Michael Roberts領(lǐng)導(dǎo)的
4研究小組也相繼利用慢病毒載體介導(dǎo)人或小鼠4種限定因子成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了豬誘導(dǎo)性多 能干細(xì)胞。但上述三個研究小組均未用組建限定因子融合蛋白來進(jìn)行豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 的誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，利用外源限定因子與增強(qiáng)型綠 色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體 用于豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對表達(dá)外源限定因子融合蛋白的豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行 培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長狀態(tài)穩(wěn)定，核型正 常，堿性磷酸酶檢測為陽性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示0ct4、NanOg、SSEA-I蛋白表達(dá)為陽性， 體內(nèi)能夠分化形成含有三個胚層的畸胎瘤，結(jié)果證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆具有胚胎干細(xì)胞 樣特征，成功分離培養(yǎng)得到豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案為2、一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于包括以下步驟(1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)豬Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人0ct4的DNA序列，設(shè)計(jì)合成出 pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4 基因的上、下游引物；從豬囊胚中提取總RNA，利用設(shè)計(jì)合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游 引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人0ct4的DNA序列經(jīng)h0ct4基因的上、下游引物直 接從人0ct4基因中擴(kuò)增獲取，將豬限定基因DNA和人0ct4的DNA序列進(jìn)行酶切，然后與逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-Nl連接，構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體，從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合 蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV啟動子連同限定基因及EGFP基因，同時通過酶切從pLL3. 7質(zhì) 粒中移除U6啟動子、CMV啟動子和GFP序列，最后把CMV啟動子連同限定基因及EGFP基因 與酶切后的PLL3. 7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物DNA序列為pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，；下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，；pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，；下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，；pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，；下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，；h0ct4 上游5，-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，；下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，。(2)、豬胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)采用組織塊培養(yǎng)法建立豬胎兒成纖維細(xì)胞系，采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因 融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時將慢病毒包裝產(chǎn) 生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到293T細(xì)胞，12_16h后換無病毒的 293T細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒包裝48h后收集病毒培養(yǎng)液，經(jīng)超濾濃縮后添加到含有豬胎兒成纖 維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，病毒開始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞，感染6-7天后，細(xì)胞出現(xiàn)初步形態(tài)變化
5后將感染的細(xì)胞經(jīng)DispaseII消化，接種至絲裂霉素C處理過的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng) 層上進(jìn)行培養(yǎng)，感染15-16天后，豬胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見。所述的慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體構(gòu)建的具體操作步驟包括首先將 PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶切，T4 DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從 pLL3. 7質(zhì)粒中移除TO啟動子、CMV啟動子和GFP序列；設(shè)計(jì)載體改造引物，從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn) 錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中經(jīng)載體改造引物擴(kuò)增出CMV啟動子連同限定基因和EGFP序列， 然后用Mim I進(jìn)行單酶切，純化后用T4連接酶將從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出 的CMV啟動子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的pLL3. 7連接進(jìn)行重組，構(gòu)建好慢病毒 限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的設(shè)計(jì)載體改造引物的DNA序列為上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，；下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。所述的病毒包裝前一天匯合293T細(xì)胞，293T細(xì)胞培養(yǎng)液為含8_12%的胎牛血 清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，細(xì)胞匯合50-60 %時進(jìn)行病毒 包裝；所述的病毒包裝采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子 質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、 pRSV REV和pVSVg包裝到293T細(xì)胞，12_16h后換293T細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，48h后收集含病毒 培養(yǎng)液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過濾后轉(zhuǎn)移到Millipore的100KD超濾管中，在3_5°C下4000rpm 離心20-40min得濃縮病毒液。所述的病毒開始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將豬胎兒成纖維細(xì)胞注入到豬 胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為IXlO5/孔，豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12% 的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，24小時后換成添加 有濃縮病毒液和濃度為10μ g/mL Polybrene的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開始感染， 12小時后換無病毒液的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開始感染的第二天換成添加有濃縮 病毒液和濃度為10μ g/mLPolybrene的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液再感染一次，12小時后再 換無病毒液的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過2次慢病毒感染后即病毒開始感染的第三天 將豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液更換為豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液，成 纖維細(xì)胞的形態(tài)開始發(fā)生改變，即少量豬胎兒成纖維細(xì)胞由長梭形變成圓球形，并且呈集 落樣生長時，用Dispase II消化接種到絲裂霉素C處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼 養(yǎng)層上，添加新的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液在37. 5°C,5% CO2飽和濕度下繼 續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。所述的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞系培養(yǎng)的具體步驟為取妊娠55-65天的杜洛克-長 白-大約克三元雜交豬胎兒，采用組織塊培養(yǎng)法建立成纖維細(xì)胞系，培養(yǎng)液為8-12%的胎 牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎兒成纖維 細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為選擇鋪滿皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)9-llug/ml的 絲裂霉素C處理2-3h，常規(guī)胰酶消化接種到鋪過濃度為0. 008-0. 012g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn) 行培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為2 X IO5個/ml。所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液為含1.5_2.5mM谷氨酰胺、 1. 5-2. 5mM丙酮酸鈉、0. 8-1. 2%的非必須氨基酸、0. 08-0. 12 mM β -巰基乙醇、990-1100U/ml LIF、3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的 FBS 和 0. 8-1. 2%青鏈霉素的高糖 DMEM。本發(fā)明所述的％均值占總體積的體積百分比。所述的豬Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列信息來自美國國立生物技術(shù)信息中 心數(shù)據(jù)庫。所述的pSoX2、pKlf4、pC-MyC基因的上、下游引物是指能從物種豬的DNA片段中擴(kuò) 增出相應(yīng)基因的特定DNA序列。h0ct4基因的上、下游引物是指從直接人0ct4基因中擴(kuò)增 出h0ct4基因的特定DNA序列。所述的載體改造引物是指從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEGFP-hOCT4/ pS0X2/pMYC/pKLF4中擴(kuò)增出CMV啟動子連同限定基因和EGFP序列的特定DNA序列，引物一 般是自己設(shè)計(jì)，專門的生物公司合成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)、從發(fā)明利用外源限定因子與EGFP構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體用于豬誘導(dǎo) 性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對表達(dá)外源限定因子融合蛋白的豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代， 能夠逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長狀態(tài)穩(wěn)定，核型正常，堿 性磷酸酶檢測為陽性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示0ct4、Nanog, SSEA-I蛋白表達(dá)為陽性，體內(nèi) 能夠分化形成含有三個胚層的畸胎瘤，結(jié)果證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆為豬誘導(dǎo)性多能干細(xì) 胞；因此，此發(fā)明技術(shù)能夠成功誘導(dǎo)豬體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞；(2)、本發(fā)明采用外源限定因子和EGFP組建的融合蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的 誘導(dǎo)，融合蛋白(fusion protein)是采用DNA重組技術(shù)在基因水平上將兩種蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)依讀碼框架首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物；融合 蛋白技術(shù)因其在目的蛋白的表達(dá)、構(gòu)建具有雙功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代 的作用，在醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，環(huán)境等的生產(chǎn)、研究中有著重要的用途，在基因工程的研究中顯示了 廣闊的應(yīng)用前景；EGFP是熒光蛋白家族中常用的一種，熒光具有高度穩(wěn)定性，對于外源限 定因子在細(xì)胞重編程過程中發(fā)揮作用的機(jī)制和特點(diǎn)，外源限定因子和EGFP組建的融合蛋 白能夠有效地檢測、追蹤和掌握外源限定因子的特點(diǎn)，有助于將來進(jìn)行誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 的機(jī)理研究，而在已報(bào)道的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)中均未采用限定因子融合蛋白這一技 術(shù)用于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)；(3)、本發(fā)明應(yīng)用的限定因子，除0ct3/4基因是來自于人的DNA序列外，余3種因 子(Sox2、Klf4和c-Myc)均是來自于豬的DNA序列。


圖1是pLL3. 7質(zhì)粒圖譜示意圖。圖2是限定因子融合蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建圖譜示意圖。圖3是限定因子融合蛋白慢病毒載體質(zhì)粒pLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4-GFP構(gòu) 建圖譜示意圖。圖4是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)過程示意圖。圖5是病毒感染前豬胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)圖。圖6是病毒感染2次后第6天的豬胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)圖。圖7是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞克隆形態(tài)圖。
圖8是第13代豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞核型圖。圖9是RT-PCR檢測多能性基因圖，圖中1代表豬胎兒成纖維細(xì)胞，2-3代表豬誘導(dǎo) 性多能干細(xì)胞，4代表小鼠ES細(xì)胞。圖10是是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞AP染色的顯微鏡圖。圖11是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞0ct4蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖12是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞Nanog蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖13是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞SSEA-I蛋白的表達(dá)的顯微鏡圖。圖14是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的神經(jīng)管樣組織的顯微鏡圖。圖15是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腺管樣組織的顯微鏡圖。圖16是豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的軟骨樣組織的顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法(1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建試劑限制性內(nèi)切酶、cDNA第一鏈合成試劑盒、T4 DNA聚合酶和連接酶均購自 TaKaRa生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、NTP均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引 物合成和測序均由上海生物工程有限公司完成。方法根據(jù)NCBI 上豬 Sox2(NM 001123197)、c_Myc (NM 001005154)、 Klf4(NM001031782)基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)合成上、下游引物，引物序列如下pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，h0ct4 上游5’ -AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，載體改造引物上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，從豬囊胚中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人0ct4的DNA序列直 接從人0ct4基因中擴(kuò)增獲取，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-m連接，構(gòu) 建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體。從重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV 啟動子連同限定基因及EGFP基因，同時通過酶切從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動子、CMV啟 動子和GFP序列，最后把重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中擴(kuò)增的啟動子和限定基因融合蛋白序列與 酶切后的PLL3. 7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體(圖3)。具體操 作步驟如下首先將PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶切，T4 DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從PLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟動子、CMV啟動子和GFP序列。設(shè)計(jì)載體改造 引物從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEGFP—h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4中擴(kuò)增出CMV啟 動子、目的片段和EGFP序列，然后用Mim I進(jìn)行單酶切，純化后用T4連接酶將兩者連接即構(gòu)建好慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體。(此為本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)和欲保護(hù)點(diǎn)之 一)(2)、豬胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)材料和試劑胎豬成纖維細(xì)胞(porcine embryo fibroblasts，PEFs)的分離和培養(yǎng)取妊娠 55-65天的杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒，采用組織塊培養(yǎng)法建立胎豬成纖維細(xì)胞 系，培養(yǎng)液為含有占體積百分比10%胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素，0. lmg/ml鏈霉 素的高糖 DMEM(Hyclone)。胎鼠成纖維細(xì)胞(mouseembryo fibroblasts,MEFs)系的建立妊娠 12. 5dICR品 系胎鼠，去除頭、四肢和內(nèi)臟后采用胰酶消化法分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)液為含 有占體積百分比10%新生牛血清(四季青)的高糖DMEM(Hyclone)。飼養(yǎng)層的制備選擇鋪滿皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)lOug/ml的絲裂 霉素C(Sigma)處理2. 5h，常規(guī)胰酶消化接種到鋪過0. 01g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細(xì)胞密 度為2X IO5個/ml。培養(yǎng)液同小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液。豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液含有2mM谷氨酰胺(Gibco)、2mM丙酮酸 鈉(Gibco)、占體積百分比非必須氨基酸(Gibco)、0. ImM β -巰基乙醇(Sigma)、1000U/ ml LIF(ESGR0, Chemicon International)、4ng/ml bFGF (Sigma)、占體積百分比 15 % FBS(Hyclone)、占體積百分比青鏈霉素(Gibco)的高糖DMEM(Hyclone)。293T細(xì)胞培養(yǎng)液同PEFs培養(yǎng)液，所有細(xì)胞均在37. 5°C,5% CO2，飽和濕度下CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。方法取妊娠55-65天的杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒，采用組織塊 培養(yǎng)法建立豬胎兒成纖維細(xì)胞系，胎豬成纖維細(xì)胞從第2代開始感染，具體的重編程方案 見圖4，采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染四因子質(zhì)粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4和包裝組分pMDLg、 pRSV REV和pVSVg到293T細(xì)胞，12_16h后換新鮮培養(yǎng)液，病毒包裝48h后收集含病毒培養(yǎng) 液，含病毒培養(yǎng)液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過濾后轉(zhuǎn)移到Millipore的100KD超濾管中，在4°C下 4000rpm離心20-40min得濃縮病毒液。病毒開始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將豬胎兒 成纖維細(xì)胞注入到6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為1 X IO5/孔，培養(yǎng)液為含占體積百分比10 %胎牛血 清，100U/ml青霉素，0. lmg/ml鏈霉素的高糖DMEM，第二天換成添加有濃縮病毒液和濃度為 10yg/mL Polybrene的牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，12小時后換新鮮牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 液，第三天換成添加有濃縮病毒液和濃度為10 μ g/mL Polybrene的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 液再感染一次，12小時后再換新鮮豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開始感染豬胎兒成纖維 細(xì)胞的當(dāng)天記為O天，經(jīng)過2次慢病毒感染第3d更換豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng) 液，第6d細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)集落變化后，Dispase II(Roche)消化后接種到12. 5d小鼠胎兒成 纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加干細(xì)胞培養(yǎng)液在37. 5°C、5% CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，到感染后第 15-16d天，圓形的邊界清楚的胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見。用Dispase II消化克隆接種到 新的飼養(yǎng)層上繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，剛開始按1 1的比例傳代，然后按1 4的比例傳代，每隔 3-4d左右傳代一次。(3)、豬誘導(dǎo)細(xì)胞的鑒定RT-PCR檢測應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen)處理豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，然后提取細(xì)胞總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書(Takara公司)合成cDNA。鑒定引物擴(kuò) 增相應(yīng)基因，Klf4、c-Myc引物序列同1. 1中相應(yīng)載體構(gòu)建引物，其余引物序列如下p0ct4 上游5’ -TATAAGCTTGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTT-3’下游5，-AAAGGATCCGCGTTTGAATGCATGGGGGAGCCC-3，
pNanog 上游5 ’ -CTTCTCGAGGCCACCATGAGTGTGGATCCAGCTT-3 ’下游5，-GCGAAGCTTCATATCTTCAGGCTGTATGTTC-3，GAPDH 上游5，-TTGGTATCGTGGAAGGACTCTA-3，下游5，-TGTCATATTTGGCAGGTT-3，核型分析0. 1 μ g/ml秋水仙素(Sigma)處理豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞2. 5h，胰酶消化 并重懸于0.075 mol/L KCL，37°C孵育25min，固定液(甲醇冰醋酸=3 1)固定lOmin， 離心固定重復(fù)3次。收獲細(xì)胞，滴片，Gimsa染色，空氣干燥，封片。顯微鏡下觀察及應(yīng)用相 關(guān)軟件分析染色體配對。免疫熒光檢測細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉 30min，添加一抗為兔抗 0ct4 (Abeam)、山羊抗 Nanog (R&D)、鼠抗 SSEA-1 (Chemicon)、鼠抗 SSEA-3 (R&D)、鼠抗 SSEA-4 (R&D)、鼠抗 TRA-1-60 (Chemicon)、鼠抗 TRA-1-81 (Chemicon)，按 1 200稀釋后4°C孵育過夜。PBS洗3次，CY3紅色熒光標(biāo)記的二抗按1 200稀釋后室 溫避光孵育lh，PBS洗3次，用1 μ g/mL的DAPI (Roche)進(jìn)行細(xì)胞核染色I(xiàn)min后熒光鏡下 觀察結(jié)果。AP染色用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，添加堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP) 染液進(jìn)行染色，以胞漿著色為紅棕色或咖啡色顆粒為陽性。體內(nèi)分化檢測=Dispase II消化豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，無血清DMEM重懸細(xì)胞后注 射到免疫缺陷鼠(BALB/C-nu)背側(cè)皮下，注射8w后處死裸鼠，取腫瘤組織4%多聚甲醛固定 后進(jìn)行蘇木精伊紅染色。(4)、結(jié)果磷酸鈣法包裝的限定因子慢病毒感染豬胎兒成纖維細(xì)胞，在干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條 件下6-7d后，豬胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)開始發(fā)生改變，少量豬胎兒成纖維細(xì)胞逐漸由長 梭形轉(zhuǎn)變成圓球形，呈聚集性生長。Dispase II消化的圓球形細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上，用含 1000U/ml LIF和4ng/ml bFGF的干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，在感染后第16d，邊界明顯的集 落狀細(xì)胞克隆逐漸形成。高倍顯微鏡下集落中的單個細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核較大，核質(zhì)比例較高。 在1 4傳代的情況下細(xì)胞克隆大約每隔3-4d傳代一次，細(xì)胞集落生長傳代穩(wěn)定(圖6，7， 8)。對傳至第13代的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞進(jìn)行核型分析顯示豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞染色體 數(shù)為38，XY正常核型(圖9)。RT-PCR檢測限定因子融合蛋白誘導(dǎo)的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 相關(guān)多能性基因的表達(dá)，豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)0Ct4、C-MyC、Klf4和Nanog基因，相同條 件下豬胎兒成纖維細(xì)胞表達(dá)Nanog基因，不表達(dá)0Ct4、C-MyC、Klf4等相關(guān)基因(圖10，11， 12，13)。AP在早期胚胎的干細(xì)胞中有較高表達(dá)，而在已分化的細(xì)胞中活性明顯降低，甚至 不表達(dá)，AP的表達(dá)是一種ES細(xì)胞及相關(guān)干細(xì)胞的重要特征之一。AP染色結(jié)果顯示限定因 子融合蛋白誘導(dǎo)的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞AP表達(dá)為強(qiáng)陽性(圖9)。細(xì)胞免疫熒光檢測顯示 誘導(dǎo)培養(yǎng)的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)0ct4、NanOg、SSEA-I蛋白(圖11，12，13)，對于0(^4 蛋白的表達(dá)檢測，攜帶外源限定因子的細(xì)胞在整個細(xì)胞克隆中呈現(xiàn)0ct4蛋白強(qiáng)表達(dá)，EGFP
10為強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞則0ct4蛋白檢測為強(qiáng)陽性，EGFP表達(dá)較弱或沉寂的細(xì)胞則0ct4蛋白表達(dá) 水平呈現(xiàn)一般陽性(圖11)，在相同條件下，Nanog蛋白的表達(dá)水平在細(xì)胞集落中介于表達(dá) EGFP或不表達(dá)EGFP的細(xì)胞之間沒有差異。SSEA-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81等蛋白未 見表達(dá)。取限定因子融合蛋白誘導(dǎo)的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在BALB/C裸鼠皮下8w后形成的 畸胎瘤，HE染色結(jié)果顯示在畸胎瘤組織內(nèi)存在神經(jīng)、肌肉、腺體、軟骨等三個胚層來源的細(xì) 胞和組織(圖14，15，16)。
權(quán)利要求
一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于包括以下步驟(1)、限定因子慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)豬Sox2、c Myc、K1f4基因的mRNA序列和人Oct4的DNA序列，設(shè)計(jì)合成出pSox2、pK1f4、pc Myc、hOct4基因的上、下游引物；從豬囊胚中提取總RNA，利用設(shè)計(jì)合成出的pSox2、pK1f4和pc Myc基因的上、下游引物經(jīng)RT PCR擴(kuò)增出豬限定基因DNA，人Oct4的DNA序列經(jīng)hOct4基因的上、下游引物直接從人Oct4基因中擴(kuò)增獲取，將豬限定基因DNA和人Oct4的DNA序列進(jìn)行酶切，然后與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP N1連接，構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體，從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出CMV啟動子連同限定基因及EGFP基因，同時通過酶切從pLL3.7質(zhì)粒中移除U6啟動子、CMV啟動子和GFP序列，最后把CMV啟動子連同限定基因及EGFP基因與酶切后的pLL3.7進(jìn)行重組，構(gòu)建出慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體；所述的pSox2、pK1f4、pc Myc、hOct4基因的上、下游引物DNA序列為pSox2上游5’ TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC 3’；下游5’ AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC 3’；pK1f4上游5’ TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC 3’；下游5’ GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC 3’；pc Myc上游5’ GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG 3’；下游5’ AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG 3’；hOct4上游5’ AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC 3’；下游5’ CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC 3’。(2)、豬胎兒成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)采用組織塊培養(yǎng)法建立豬胎兒成纖維細(xì)胞系，采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì)粒PLL hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同時將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到293T細(xì)胞，12 16h后換無病毒的293T細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒包裝48h后收集病毒培養(yǎng)液，經(jīng)超濾濃縮后添加到含有豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，病毒開始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞，感染6 7天后，細(xì)胞出現(xiàn)初步形態(tài)變化后將感染的細(xì)胞經(jīng)DispaseII消化，接種至絲裂霉素C處理過的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，感染15 16天后，豬胚胎干細(xì)胞樣克隆明顯可見。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的慢病毒 限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體構(gòu)建的具體操作步驟包括首先將PLL3. 7用Apa I進(jìn)行酶 切，T4DNA聚合酶將其末端平滑化，再用EcoR I進(jìn)行單酶切，即從pLL3. 7質(zhì)粒中移除U6啟 動子、CMV啟動子和GFP序列；設(shè)計(jì)載體改造引物，從構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載 體中經(jīng)載體改造引物擴(kuò)增出CMV啟動子連同限定基因和EGFP序列，然后用Mim I進(jìn)行單酶 切，純化后用T4連接酶將從逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達(dá)載體中擴(kuò)增出的CMV啟動子連同限定 基因及EGFP基因與酶切后的pLL3. 7連接進(jìn)行重組，構(gòu)建好慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu) 表達(dá)載體；所述的設(shè)計(jì)載體改造引物的DNA序列為 上游5’ -AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’ ； 下游5’ -GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步 驟所述的病毒包裝前一天匯合293T細(xì)胞，293T細(xì)胞培養(yǎng)液為含8_12 %的胎牛血清、 95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，細(xì)胞匯合50-60%時進(jìn)行病毒包 裝；所述的病毒包裝采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染慢病毒限定基因融合蛋白重構(gòu)表達(dá)載體的四因子質(zhì) 粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同時將慢病毒包裝產(chǎn)生病毒需要的輔助質(zhì)粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包裝到293T細(xì)胞，12_16h后換293T細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，48h后收集含病毒培養(yǎng) 液經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過濾后轉(zhuǎn)移到Millipore的100KD超濾管中，在3_5°C下4000rpm離心 20-40min得濃縮病毒液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括以下步驟 所述的病毒開始感染豬胎兒成纖維細(xì)胞的前一天將豬胎兒成纖維細(xì)胞注入到豬胎兒成纖 維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為IXlO5/孔，豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液為含8-12%的胎牛血 清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM，24小時后換成添加有濃縮病 毒液和濃度為10μ g/mL Polybrene的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開始感染，12小時后 換無病毒液的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒開始感染的第二天換成添加有濃縮病毒液和 濃度為10 μ g/mL Polybrene的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液再感染一次，12小時后再換無病 毒液的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過2次慢病毒感染后即病毒開始感染的第三天將豬胎 兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液更換為豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液，成纖維細(xì) 胞的形態(tài)開始發(fā)生改變，即少量豬胎兒成纖維細(xì)胞由長梭形變成圓球形，并且呈集落樣生 長時，用Dispase II消化接種到絲裂霉素C處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上， 添加新的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液在37. 5°C、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)進(jìn)行培 養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的小鼠胎 兒成纖維細(xì)胞系培養(yǎng)的具體步驟為取妊娠55-65天的杜洛克_長白-大約克三元雜交豬 胎兒，采用組織塊培養(yǎng)法建立成纖維細(xì)胞系，培養(yǎng)液為8-12%的胎牛血清、95-105U/ml青 霉素、0. 08-0. 12mg/ml鏈霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法 為選擇鋪滿皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)9-1 lug/ml的絲裂霉素C處理2_3h，常 規(guī)胰酶消化接種到鋪過濃度為0. 008-0. 012g/L明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度 為 2X IO5 個/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的豬 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)液為含1. 5-2. 5mM谷氨酰胺、1. 5-2. 5mM丙酮酸鈉、 0. 8-1. 2% 的非必須氨基酸、0. 08-0. 12mM β -巰基乙醇、990_1100U/ml LIF,3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的FBS和0. 8-1. 2%青鏈霉素的高糖DMEM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)方法，利用外源限定因子與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)報(bào)告基因構(gòu)建融合蛋白慢病毒表達(dá)載體用于豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)，對表達(dá)外源限定因子融合蛋白的豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，細(xì)胞集落生長狀態(tài)穩(wěn)定，核型正常，堿性磷酸酶檢測為陽性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表達(dá)為陽性，體內(nèi)能夠分化形成含有三個胚層的畸胎瘤，分離培養(yǎng)的細(xì)胞克隆得到豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
文檔編號C12N7/01GK101955910SQ20101013875
公開日2011年1月26日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者丁建平, 任春環(huán), 劉亞, 劉旭光, 孫雪萍, 宋銳, 張衛(wèi)琴, 張子軍, 張運(yùn)海, 方富貴, 曹鴻國, 李運(yùn)生, 殷宗俊, 殷慧群, 章孝榮, 薛奕杰, 陳濤, 陶勇, 黃偉玲 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)