專利名稱：幽門螺桿菌診斷試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種幽門螺桿菌診斷試劑盒及其檢測方法，屬于細(xì)菌的檢測技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從澳大利亞學(xué)者M(jìn)arshall等1983年首次從胃炎患者的胃黏膜中分離到幽門螺 桿菌(Helicobacter pylori,HP)后，經(jīng)過20多年的發(fā)展，有關(guān)幽門螺桿菌臨床檢測的研究 取得了長足進(jìn)步。截止目前為止，主要有快速尿素酶試驗(yàn)，細(xì)菌培養(yǎng)，活檢標(biāo)本切片染色，直 接圖片染色和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)JI 13，碳14呼吸試驗(yàn)，血清免疫學(xué)檢測，尿素排泄試驗(yàn) 等，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。焦磷酸測序是近年來發(fā)展起來的一種快速，簡便，高通量的短序 列測序方法，本試驗(yàn)將其應(yīng)用于幽門桿菌的鑒定及耐藥性分析，具有準(zhǔn)確，特異，快速及高 通量的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種幽門螺桿菌診 斷試劑盒。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括(1)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；(3)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO :4和SEQID NO :5所示的引物對;(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示；其中，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3均在5，端標(biāo)記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。上述幽門螺桿菌診斷試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS ；其中，裂解液具體包括Chelex(g/mL)5%，Tricine 30mM，辛酸鈉150mM，鹽酸胍 150mM, Triton 0. 1% (ν/ν)；生理鹽水具體為0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液；PBS具體包括 NaCll. 37M, KCl 27mM, Na2HPO4IOOmM, KH2P0420mM。(2) PCR 反應(yīng)液:PCR Buffer，特異引物 SEQ ID NO 1 610uM, MgCl225mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；其中，PCRBuffer 包括 0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (g/mL)BSA, 0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。
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(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris-Acetate, 結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (ν/ν) Tween20 ；退火緩沖液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒 光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括上述所有核苷酸序列的堿基互補(bǔ)序列，也就 是包括(1)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示；(3)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID N0:10和 SEQID NO 11所示引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 12所示；其中，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9均在5，端標(biāo)記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。上述幽門螺桿菌診斷試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS ；其中，裂解液具體包括Chelex(g/mL)5%，Tricine 30mM，辛酸鈉150mM，鹽酸胍 150mM, Triton 0. 1% (ν/ν)；生理鹽水具體為0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液；PBS具體包括 NaCll. 37M, KC127mM, Na2HPO4IOOmM, KH2P0420mM。(2) PCR 反應(yīng)液:PCR Buffer，特異引物 SEQ ID NO 7 1210uM, MgCl225mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；其中，PCRBuffer 包括 0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (g/mL)BSA, 0. 1% (v/v) Tween-20,0. 06M ρΗ8· 9Tricine。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate， 結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (ν/ν) Tween20 ；退火緩沖液具體為20mM ρΗ 7. 6Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒 光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，包括如下步驟(1)幽門螺桿菌DNA模板的提取；(2)以步驟(1)所得的DNA為模板再按特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以標(biāo)記生物素的引物序列進(jìn)行單鏈純化；(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行測序；(5)結(jié)果分析。步驟(1)中，所述的幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg胃黏膜 組織，加ImL生理鹽水在研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌3次后13000rpm離心沉淀，加50 μ L裂解液，100°C IOmin, 13000rpm離 心，上清即為DNA模板。步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增具體方法為50 μ L 體系=Template 5 μ L，10 X PCR Buffer 5 μ L, MgCl24 μ L, dNTP 1 μ L, SEQ ID NO 11 μ L, SEQ ID NO :21 μ L，5U/μ L Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L，ddH20 32.6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時(shí)將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR 擴(kuò)增條件:95 V 3min ；95 V 30s，45°C 30s, 72 °C 45s, 50 個(gè)循環(huán)；72°C 3min, 16 °C 30min。有益效果本發(fā)明方法對幽門螺桿菌16S片段進(jìn)行特異性測序，把測得的幽門螺 桿菌特征性序列5' -CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3 ‘作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，其與常規(guī)的鑒定方法相 比，敏感度為93. 3%，特異性100%。因此，該法在臨床上快速，特異，高通量的鑒定幽門螺 桿菌具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的試劑盒通過檢測23S上的2142和2143位點(diǎn)就可以預(yù) 測幽門螺桿菌是否耐藥，對幽門螺桿菌臨床用藥具有很好的指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)將焦磷酸技 術(shù)應(yīng)用于HP 23S的2142和2143位點(diǎn)SNP檢測，能在5分鐘內(nèi)檢測96個(gè)樣品，具有結(jié)果準(zhǔn) 確，耗時(shí)短，高通量的諸多優(yōu)點(diǎn)。


圖1是幽門螺桿菌陽性標(biāo)本16S rDNA測序結(jié)果圖。圖2是幽門螺桿菌陽性標(biāo)本23S rDNA耐藥測序結(jié)果圖，為野生型的非耐藥菌株即 2142和2143位點(diǎn)均為A?？死顾啬退幘?3S rDNA 2142及2143位點(diǎn)A突變成G時(shí)前三 個(gè)堿基分別為GAA, (2142位點(diǎn)A — G)，或AGA, (2143位點(diǎn)A — G)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 試劑盒的制備。(I)DNA 提取試劑裂解液:Chelex5%(g/mL)(購于 Bio-rad 公司)，Tricine 30mM(購于 Merck 公 司)，辛酸鈉150mM (購于上海西寶生物科技有限公司)，鹽酸胍150mM (購于美國Sigma公 司)，Triton 0. 1% (ν/ν)(購于美國 Sigma 公司)；生理鹽水0. 9% (g/mL)氯化鈉溶液(氯化鈉購于上海試四赫維化工有限公司)；PBS =NaCl 1. 37M(購于上海試四赫維化工有限公司)，KC1 27mM(購于上海試四赫 維化工有限公司)，Na2HP04100mM(購于上海試四赫維化工有限公司)，KH2P0420mM(購于上 海試四赫維化工有限公司)。(2) PCR 反應(yīng)液PCR Buffer 0. 1% (v/v)NP_40 (購于美國 Sigma 公司),0. 02% (ν/ν)明膠(購 于美國 Sigma 公司)，0.06% (g/mL) BSA (購于美國 Sigma 公司)，0. 1 % (v/v) Tween-20 (購 于美國 Sigma 公司)，0· 06M pH8. 9Tricine (購于 Merck 公司)；25mM MgCl2 購于美國 Sigma 公司；
IOmM dNTPs 購于上海鼎國生物技術(shù)有限公司；5U/uLTaq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液無水乙醇購自安徽安特生物化學(xué)有限公司；0. 2Μ NaOH 購于上海試四赫維化工有限公司；IOmM Tris-Acetate (ρΗ 7.6) :Tris_base 購于美國 Sigma 公司，無水乙酸購于杭 州化學(xué)試劑有限公司；結(jié)合緩沖液由IOmM Tris-HCl (Tris_base購于美國Sigma公司，鹽酸購于杭州化 學(xué)試劑有限公司)，2M NaCl (購于上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購于杭州化學(xué) 試劑有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (購于美國Sigma公司)組成。退火緩沖液由20mM Tris-Acetate (ρΗ 7. 6) (Tris-base 購于美國 Sigma 公司， 無水乙酸購于杭州化學(xué)試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購于上海試四赫維化工有限公司)組 成。(4)測序試劑DNA聚合酶購于德國Qiagen公司；ATP硫酸化酶購于德國Qiagen公司；熒光素酶購于德國Qiagen公司；三磷酸腺苷雙磷酸酶購于德國Qiagen公司；底物APS 購于德國Qiagen公司；熒光素購于德國Qiagen公司；四種 dNTP (dATP α S, dTTP, dCTP, dGTP)購于德國 Qiagen 公司。實(shí)施例2 檢測方法。(1)幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg人體胃黏膜組織，加ImL 生理鹽水在研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL EP管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS 洗滌3次后13000rpm離心沉淀，加50 μ L裂解液，100°C IOmin, 13000rpm離心，上清即為 DNA模板；(2)以步驟⑴所得的DNA為模板再按特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物在 Thermolcycler S1000 (美國bio_rad公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法如下50μ L 體系Template 5 μ L, IOXPCRBuffer 5 μ L, MgCl24 μ L, dNTP 1 μ L, SEQ IDNO 11 μ L，SEQ ID NO 21 μ L,5U/uL Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L，ddH20 32. 6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時(shí)將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR 擴(kuò)增條件:95 V 3min ；95 V 30s，45°C 30s, 72 °C 45s, 50 個(gè)循環(huán)；72°C 3min, 16 °C 30min。(3)將步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以標(biāo)記生物素的引物序列進(jìn)行單鏈純化；即 將步驟(2)中得到的50uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與3uL sepharoe beads (購于美國GE公司)及47ul 結(jié)合緩沖液在一個(gè)Eppendorf管中震蕩混合lOmin，然后用Vaccuum pr印workstation系統(tǒng) (PyroMark ID， 惠 15 Qiagen 公司)中的 vaccuum prep tool sepharosebeads,^n^pff 有 beads 的 vaccum prep tool 依次在 75% 乙醇,0. 2M NaOH 溶液，IOmMTris-Acetate 溶液 中清洗10秒，將vacuum prep tool放入含有IuL測序引物和49uL退火緩沖液的PSQ96 (購于德國Qiagen公司)板中，釋放sepharose beads，將該P(yáng)SQ96板放在ThermoPlate (購于 德國Qiagen公司)上加熱到80°C 2mie，再冷卻至室溫，即得到可進(jìn)行后續(xù)測序反應(yīng)的單鏈 純化產(chǎn)物。(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序按照儀器(PyroMark ID, QIAGEN公司)說明書操作；(5)結(jié)果分析，測序結(jié)果與幽門螺桿菌特征性序列 “5' -CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3 ‘ ”或“5' -CGCACAATCAGCGTCAG TAA-3 ‘ ”(圖 1)比對 鑒定幽門螺桿菌。幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的鑒定，通過對幽門螺桿菌23S rDNA中 A2142G及A2143G兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性分析來鑒定幽門螺桿菌是否對克拉霉素耐藥(圖2)， 野生型的非耐藥菌株2142和2143位點(diǎn)均為A?？死顾啬退幘?3S rDNA 2142及2143位 點(diǎn)A突變成G時(shí)前三個(gè)堿基分別為GAA, (2142位點(diǎn)A — G)，或AGA, (2143位點(diǎn)A — G)。以養(yǎng)和生物科技有限公司14C-尿素呼氣試驗(yàn)試劑盒為參照，本發(fā)明試劑盒能穩(wěn) 定檢出的幽門螺桿菌按收集的呼氣樣品每分鐘衰變數(shù)(dpm)計(jì)算最小量為ISOdpm;根據(jù) 14C-尿素呼氣試驗(yàn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)，呼氣樣品的每分鐘衰變數(shù)(dpm) >200dpm為幽門螺桿菌陽 性；150 200dpm為可疑陽性；< 150rpm為陰性。本試劑盒檢測幽門螺桿菌的特異性達(dá)98%以上(每分鐘衰變數(shù)> 200dpm的50例 樣品經(jīng)本試劑盒檢測均為陽性，10例其它微生物包括6例其它細(xì)菌，4例真菌樣品，檢測，重 復(fù)檢測結(jié)果均為陰性。
權(quán)利要求
一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特征在于它包括(1)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；(3)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO4和SEQIDNO5所示的引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示；其中，SEQ ID NO1和SEQ ID NO3均在5’端標(biāo)記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS；(2)PCR反應(yīng)液:PCR Buffer,特異引物 SEQ ID NO 1 610uM, MgCl2 25mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，結(jié)合 緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒光素 和 dNTP。
3.—種幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要求1所述的所有核苷酸序列 的堿基互補(bǔ)序列，也就是包括(1)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQID NO 7和SEQ ID NO 8所示 引物對；(2)幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 9所示；(3)特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQID NO 10和SEQID NO: 11所示引物對；(4)幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 12所示；其中，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9均在5，端標(biāo)記生物素；上述引物在一次檢測中共同使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒，其特征在于它包括如下試劑(1)DNA提取試劑裂解液，生理鹽水，PBS；(2)PCR反應(yīng)液:PCR Buffer,特異引物 SEQ ID NO 7 1210uM, MgCl2 25mM, dNTPs IOmM, Taq DNA 聚合酶 5U/uL ；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2Μ NaOH, IOmM ρΗ 7. 6Tris_Acetate，結(jié)合 緩沖液，退火緩沖液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，APS，熒光素 和 dNTP。
5. 一種幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)幽門螺桿菌DNA模板的提??；(2)以步驟(1)所得的DNA為模板再按特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以標(biāo)記生物素的引物序列進(jìn)行單鏈純化；(4)將步驟(3)所得的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行測序；(5)結(jié)果分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(1)中 所述的幽門螺桿菌DNA模板的提取，具體方法是稱取20mg胃黏膜組織，加ImL生理鹽水在 研缽中研磨成勻漿狀，倒入1. 5mL離心管中，13000rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌3次 后13000rpm離心沉淀，加50 μ L裂解液，100°C lOmin，13000rpm離心，上清即為DNA模板。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中 所述的PCR擴(kuò)增具體方法為50 μ L 體系Template 5 μ L, IOXPCR Buffer 5 μ L, MgCl2 4μ L, dNTP 1 μ L, SEQ ID NO 1 1 μ L, SEQ ID NO 2 IyL, 5U/uL Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L，ddH20 32. 6 yL;或者將 SEQID NO 7替換SEQ ID NO 1,同時(shí)將SEQ ID NO 8替換SEQ ID NO :1，其它體系不變；PCR擴(kuò)增條件95°C 3min ；95°C 30s, 45°C 30s, 72°C 45s，50 個(gè)循環(huán)；72°C 3min, 16°C 30mino
全文摘要
本發(fā)明公開了一種幽門螺桿菌診斷試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；幽門螺桿菌特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；特異性擴(kuò)增幽門螺桿菌耐藥基因引物其核苷酸序列如SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的引物對；幽門螺桿菌耐藥基因特異性測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO6所示。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述幽門螺桿菌診斷試劑盒的檢測方法。本發(fā)明將焦磷酸技術(shù)應(yīng)用于HP 23S的2142和2143位點(diǎn)SNP檢測，能在5分鐘內(nèi)檢測96個(gè)樣品，具有結(jié)果準(zhǔn)確，耗時(shí)短，高通量的諸多優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK101921827SQ20101010150
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者任緒義, 呂江峰, 王棟梁, 虞閏六 申請人:南京迪安醫(yī)學(xué)檢測中心有限公司