專利名稱：一種固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖材料提高白藜蘆醇含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物中天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，特別是提供了一種使
用固定化酶轉(zhuǎn)化虎杖材料來(lái)提純白藜蘆醇的工藝。
背景技術(shù)：
虎杖(Polygonum cuspidatum Sie bet Zucc)為蓼科蓼屬小灌木，為我國(guó)傳統(tǒng)中 藥，其中富含白藜戸醇(3，4'，5-三羥基反式二苯乙烯，Resvertro1)。白藜戸醇為一種中活 性非黃酮多酚物質(zhì)。廣泛存在于葡萄、花生等天然食品或藥物中，是一種具有明確生理功能 的植物生理活性物質(zhì)，具有抗癌和治療心血管疾病的功效。 查新發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于"生物轉(zhuǎn)化法提取白藜蘆醇"方面的文獻(xiàn)和專利已有報(bào) 道。如中國(guó)專利CN101255449工藝為選擇專用菌種，于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25°C -5(TC下培 養(yǎng)，收集上清液為粗酶液。然后將含有白藜蘆醇苷的樣品粉碎至60目，按一定比例加入粗 酶液，靜置轉(zhuǎn)化10-24h后，通過(guò)乙醇加熱回流方式進(jìn)行提取，得到白藜蘆醇粗品。中國(guó)專 利CN101338327A提供了一種從虎杖中提取純度98%以上白藜蘆醇的工藝，首先將虎杖粉 碎后經(jīng)乙醇提取，濃縮回收后使用酶在45°C -50°C恒溫酶解4-5天，然后將酶滅活過(guò)濾， 濾渣經(jīng)絮凝過(guò)濾處理后使用氧化鋁層析精制，最后經(jīng)結(jié)晶干燥得到產(chǎn)品?！吨袊?guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥》 (2009. 09)發(fā)表李易非等人論文，介紹了一種酶解法提取虎杖中白藜蘆醇的工藝，《中國(guó)現(xiàn) 代醫(yī)藥》(2008. 02)發(fā)表李勝銀等人的論文，介紹了一種利用纖維素酶提取虎杖中白藜蘆醇 的研究成果。 經(jīng)文獻(xiàn)查新得知，目前利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)高純度白藜蘆醇的方法已經(jīng)有很多 中。但是普遍存在著酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶解時(shí)間難以控制，工藝復(fù)雜，轉(zhuǎn)化率較低的問(wèn)題，最重 要的其他方法轉(zhuǎn)化后無(wú)法將酶回收再次利用，無(wú)形中提高了白藜蘆醇的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于為了克服上述缺陷，提供一種使用固定化酶技術(shù)從虎杖中生 產(chǎn)高純度白藜蘆醇的工藝，可提高虎杖材料中白藜蘆醇含量10-20倍，避免了同類技術(shù)中 轉(zhuǎn)化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、催化時(shí)間不易控制以及反應(yīng)完成后酶無(wú)法回收造成成本提高的問(wèn)題。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的工藝步驟包括 a)選擇活力大于或等于5000U/g的P -葡萄糖苷酶，配制20%濃度的酶液；
b)將海藻酸鈉在常溫下置于蒸餾水中并攪拌均勻，海藻酸鈉和蒸餾水的重量比為 2 5 : 100，靜置溶脹20min，然后在70 IO(TC下隔水加熱，使其充分溶解，完成后冷卻 至45t:以下； c)將酶液傾入海藻酸鈉凝膠中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，勻速滴? 5%濃度的CaCl2溶 液中形成凝膠顆粒，調(diào)整流速使形成的顆粒直徑在2 4mm之間，完成后濾出顆粒，使用蒸 餾水沖洗后再次加入到2 5%濃度的CaCl2溶液中，于4 l(TC下靜置4 6h，然后濾出 顆粒，用蒸餾水充分沖洗，使用吸水紙張隔紗布將顆粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4 l(TC條件下； d)選取虎杖，充分陰干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 60目篩； e)將粉碎后的虎杖加入濃度為80 95%的乙醇，在30 35。C下對(duì)混合體系進(jìn)行超聲波處理，料液比為虎杖乙醇=lg : 3ml，功率80 150W，提取3次，每次l 2h，完成后抽濾并合并濾液； f)將濾液蒸發(fā)至原體積的6 9X，然后向其中補(bǔ)充水，調(diào)pH至4.0 6.0，備用；
g)向上步所得提取液中加入固定化酶，提取液固定化酶=lml : 0.03 0. lg，
在45 55t:下低速攪拌15 24h，催化完成后將固定化酶濾出； h)對(duì)催化完成后的粗提液按體積比粗體液乙酸乙酯=i : 3 5的比例萃取三
次，萃取合并乙酸乙酯，得白藜蘆醇粗提物；
i)然后柱層析分離，濃縮，結(jié)晶，得白藜蘆醇精品。
步驟d)中，隔水加熱的優(yōu)化溫度為80 90°C 。
步驟c)中，CaCl2溶液的最合適濃度為2. 5 3%。
步驟g)中，催化反應(yīng)的最合適溫度為49 50°C。 其利用酶固定化技術(shù)，提高了轉(zhuǎn)化酶的穩(wěn)定性，同時(shí)轉(zhuǎn)化后固定化酶可以快速與反應(yīng)物分離，避免了轉(zhuǎn)化后殘余酶對(duì)后續(xù)分離純化過(guò)程的影響，提高虎杖材料中白藜蘆醇含量10倍以上。而且酶可以重復(fù)使用數(shù)次，輔以微波低溫、快速提取技術(shù)，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝和操作，縮短生產(chǎn)周期，大幅降低生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，結(jié)合層析，結(jié)晶等分離精制技術(shù)，可以獲得95%的白藜蘆醇和一定純度副產(chǎn)物大黃素等兩種產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 : 1、固定化酶的制作 a)購(gòu)置P-葡萄糖苷酶，活力大于或等于5000U/g，然后配制20^濃度的酶液備用。 b)按海藻酸鈉和蒸餾水重量配比為2 5 : 100稱取海藻酸鈉和蒸餾水，將海藻酸鈉在常溫下加入蒸餾水中攪拌均勻，靜置溶脹20min，然后在80 9(TC下隔水加熱，使其充分溶解，以顏色均勻，無(wú)凝結(jié)顆粒狀為標(biāo)準(zhǔn)，完成后冷卻至45t:以下。
c)將準(zhǔn)備好的酶液傾入海藻酸鈉凝膠中，充分?jǐn)嚢柚辆鶆颍缓笫褂米⑸淦骰蛘邫M流泵，通過(guò)7號(hào)針頭勻速滴入2. 5 3%濃度的CaCl2溶液中形成凝膠顆粒，調(diào)整流速使形成的顆粒直徑在2 4mm之間，完成后濾出顆粒，使用蒸餾水沖洗后再次加入2. 5 3%濃度的CaCl2溶液中，于4 l(TC下靜置4 6h，然后濾出顆粒，用蒸餾水充分沖洗，使用吸水紙張隔紗布將顆粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4 l(TC條件下。
2、虎杖粗提液的制備 d)選取虎杖，充分陰干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 60目篩。 e)超聲波輔助提取將粉碎后的虎杖，使用80 95%乙醇以lg : 3mL的比例(虎杖干重乙醇體積，虎杖單位為g，甲醇單位為mL)混合，在30 35t:下對(duì)混合體系使用超聲波處理，功率控制在80 150W，提取3次，每次1 2h，完成后抽濾并合并濾液。
f)將濾液蒸發(fā)至原體積的6 9%，然后向其中補(bǔ)充上步驟中所使用的乙醇體積5 10X的水，調(diào)pH至4. 0 6. 0之間，備用。
3 、虎杖粗提液的轉(zhuǎn)化及提取 j)向上步提取液中加入的固定化酶，提取液固定化酶=lml : 0.03 0. lg，在49 5(TC下低速攪拌15 24h。催化完成后將固定化酶濾出，蒸餾水沖洗后保存，可重復(fù)使用。 h)對(duì)催化完成后的粗提液按體積比粗體液乙酸乙酯=1 : 5的比例萃取三次，合并乙酸乙酯，既得白藜蘆醇粗提物。 i)白藜蘆醇的精制采用柱層析分離，濃縮，結(jié)晶，得白藜蘆醇精品
實(shí)施例2 : 1、固定化酶的制作同實(shí)施例1
2、虎杖粗提液的制備 a)選取虎杖，充分陰干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 60目篩。 b)超聲波輔助提取使用80 95%甲醇以1 : 3的比例(虎杖干重甲醇體積，虎杖單位為g，甲醇單位為mL)在30 35t:下對(duì)混合體系使用超聲波處理，功率控制在80 150W，提取3次，每次1 1. 5h，完成后抽濾并合并濾液。 c)將濾液蒸發(fā)至原體積的6 9%，然后向其中補(bǔ)充原乙醇體積5 10%的水，調(diào)
pH至4. 0 6. O之間，備用。 3、虎杖粗提液的轉(zhuǎn)化及精提 d)向上步提取液中加入提取液重量5%的固定化酶，在提取液上方按粗提液乙酸乙酯=1 : 3的比例加入乙酸乙酯，在45 52t:下用攪拌機(jī)低速攪拌15 24h。
e)催化過(guò)程中，每隔5 8h更換乙酸乙酯1次，重復(fù)三次，合并乙酸乙酯層備用。
f)完成后將乙酸乙酯完全取出，以防止固定化酶被污染，乙酸乙酯層完全取出后，將固定化酶濾出，蒸餾水沖洗后保存，可重復(fù)使用。
4.白藜蘆醇的精制 采用常規(guī)方法柱層析分離，濃縮，結(jié)晶，得白藜蘆醇精品。
權(quán)利要求
一種固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖材料提高白藜蘆醇含量的方法，其特征在于，步驟包括a)選擇活力大于或等于5000U/g的β-葡萄糖苷酶，配制20％濃度的酶液；b)將海藻酸鈉在常溫下置于蒸餾水中并攪拌均勻，海藻酸鈉和蒸餾水的重量比為2～5∶100，靜置溶脹20min，然后在70～100℃下隔水加熱，使其充分溶解，完成后冷卻至45℃以下；c)將酶液傾入海藻酸鈉凝膠中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，勻速滴?～5％濃度的CaCl2溶液中形成凝膠顆粒，調(diào)整流速使形成的顆粒直徑在2～4mm之間，完成后濾出顆粒，使用蒸餾水沖洗后再次加入到2～5％濃度的CaCl2溶液中，于4～10℃下靜置4～6h，然后濾出顆粒，用蒸餾水充分沖洗，使用吸水紙張隔紗布將顆粒表面水分吸干，即得固定化酶，密封保存于4～10℃條件下；d)選取虎杖，充分陰干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40～60目篩；e)將粉碎后的虎杖加入濃度為80～95％的乙醇，在30～35℃下對(duì)混合體系進(jìn)行超聲波處理，料液比為虎杖∶乙醇＝1g∶3ml，功率80～150W，提取3次，每次1～2h，完成后抽濾并合并濾液；f)將濾液蒸發(fā)至原體積的6～9％，然后向其中補(bǔ)充水，調(diào)pH至4.0～6.0，備用；g)向上步所得提取液中加入固定化酶，提取液∶固定化酶＝1ml∶0.03～0.1g，在45～55℃下低速攪拌15～24h，催化完成后將固定化酶濾出；h)對(duì)催化完成后的粗提液按體積比粗體液∶乙酸乙酯＝1∶3～5的比例萃取三次，萃取合并乙酸乙酯，得白藜蘆醇粗提物；i)然后柱層析分離，濃縮，結(jié)晶，得白藜蘆醇精品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖材料提高白藜蘆醇含量的方法，其特征在于，步驟d)中，隔水加熱的優(yōu)化溫度為80-90°C 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖材料提高白藜蘆醇含量的方法，其特征在于，步驟c)中，CaC^溶液的最合適濃度為2.5-3%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖材料提高白藜蘆醇含量的方法，其特征在于，步驟g)中，催化反應(yīng)的最合適溫度為49-5(TC。
全文摘要
本發(fā)明提供一種固定化酶法轉(zhuǎn)化虎杖提取液提高白藜蘆醇的方法，其采用專用固定化酶對(duì)虎杖材料粗提液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，短時(shí)間內(nèi)使其中白藜蘆醇類似物轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，然后采用萃取分離技術(shù)獲得高純度的白藜蘆醇。本發(fā)明可提高虎杖材料中白藜蘆醇含量10-20倍，避免了同類技術(shù)中轉(zhuǎn)化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、催化時(shí)間不易控制以及反應(yīng)完成后酶無(wú)法回收造成成本提高的問(wèn)題，同時(shí)采用層析、結(jié)晶等分離、精制技術(shù)，獲得大于95％的白藜蘆醇和一定純度的副產(chǎn)物大黃素兩種產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12P7/22GK101735999SQ20101002207
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者徐勇, 曹庸, 李赟 申請(qǐng)人:曹庸