專利名稱：聚-3-羥基烷酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含有聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中形成聚-3-羥基烷酸凝集物的方法。
背景技術(shù)：
聚-3-羥基烷酸(以下簡稱PHA)是在很多微生物種的細(xì)胞中作為能量貯藏物質(zhì)而生成、貯藏的熱塑性聚酯，具有生物降解性?，F(xiàn)在由于環(huán)保意識提高，非石油來源的塑料受到關(guān)注。其中尤其關(guān)注能進(jìn)入自然界的物質(zhì)循環(huán)、降解生成物為無害的如PHA那樣的生物降解性塑料，并期望其實(shí)用化。尤其是，微生物菌體內(nèi)生成、貯藏的PHA由于能進(jìn)入自然界的碳循環(huán)，因此預(yù)計(jì)對生態(tài)系統(tǒng)的不良影響較小。由于微生物生成的PHA通常形成顆粒體而在該微生物的菌體內(nèi)貯藏，因此為了將 PHA作為塑料利用，需要從微生物的菌體內(nèi)分離并提取PHA的工序。另外，為了作為塑料使用，希望提高PHA的純度，降低菌體構(gòu)成成分等雜質(zhì)的含有量。作為降解和/或去除PHA以外的生物來源成分的方法，已公開通過物理處理、化學(xué)處理或者生物處理使PHA以外的生物來源成分溶解并去除的方法。對含有PHA的微生物菌體的處理方法，例如，可以列舉出將破碎處理與表面活性劑處理相結(jié)合的方法(專利文獻(xiàn) 1)，添加堿進(jìn)行加熱處理之后、進(jìn)行破碎處理的方法(專利文獻(xiàn)2)等。此外，公開了用次氯酸鈉、酶等處理微生物菌體的水性懸濁液，溶解PHA以外的生物來源成分，獲得PHA的方法 (專利文獻(xiàn)3)。另外，作為從經(jīng)破碎含有PHA的微生物的菌體或者溶解PHA以外的生物來源成分而得到的水性懸濁液中提取PHA的手段，可以列舉出離心分離機(jī)、過濾等分離操作，或者噴霧干燥等干燥操作。但是將菌體生產(chǎn)的PHA粒子照原樣作為原始粒子提取后，存在細(xì)粉變多，難以作為產(chǎn)品處理的問題。如通常所知，添加鹽等之后，可以凝集微細(xì)的漿液狀固液分散液中的固體粉末。但是，含有從破碎的細(xì)胞中漏出的細(xì)胞質(zhì)成分的水性懸濁液中，除了 PHA之外，還含有蛋白質(zhì)等，從中僅凝集目的物PHA是極其困難的，至今沒有這樣的例子。即使使用在活性污泥處理等中廣泛使用的硫酸鋁等，也由于使水性懸濁液中幾乎全部成分均凝集，因此不能只選擇性地凝集目的物PHA。另外，即使能通過高分子凝集劑等選擇性地凝集PHA，也難以將這些添加劑與PHA分離，因此對作為高分子材料的品質(zhì)產(chǎn)生了影響。作為不利用凝集劑的方法，已知加熱PHA懸濁液的方法(專利文獻(xiàn)4)、反復(fù)加熱和冷卻的方法(專利文獻(xiàn)5)等。這兩種方法均需要加熱直到PHA的熔點(diǎn)附近，因此擔(dān)心伴隨加熱的PHA分子量的降低。另一方面，已知通過將PHA溶解在有機(jī)溶劑中之后，添加溶解度低的有機(jī)溶劑或水，來使溶解的PHA析出的方法。根據(jù)該方法，由于能精制PHA溶液，因此能得到純度最高的PHA。作為這樣的溶劑提取方法，公開了以低級酮等為提取溶劑的例子(專利文獻(xiàn)6)，使用四氫呋喃的例子(專利文獻(xiàn)7)等。如果向溶解了 PHA的有機(jī)溶劑中添加弱溶劑，則能夠使PHA析出，根據(jù)添加的溶劑種類、溫度或添加量等添加條件、添加時(shí)的攪拌條件等，能夠比較任意地控制析出體的形狀或大小。這樣通過使PHA從有機(jī)溶劑中析出，而能控制析出物的形狀或大小這一點(diǎn)，對使用水溶性溶劑精制的PHA中細(xì)粉太多的問題而言，是非常有效的解決方法。但是，存在提取時(shí)要使用大量有機(jī)溶劑，且存在為了使原本降解性高的PHA溶解而將其加熱后，精制工序中PHA的分子量降低等根本性問題。因此，在工業(yè)性分離、精制微生物產(chǎn)生的PHA時(shí)，存在如下問題，即不能在減少來源于菌體構(gòu)成成分的雜質(zhì)的同時(shí)考慮環(huán)境，并且無法以高生產(chǎn)率獲得任意體積平均粒徑 PHA粒子的問題。而且，由于支配PHA凝集的參數(shù)不明確，因此，提出該問題的解決辦法是極其困難的。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 日本特表平08-502415號公報(bào)； 專利文獻(xiàn)2 國際公開第2004/065608號； 專利文獻(xiàn)3 日本特開2005-348640號公報(bào)； 專利文獻(xiàn)4:日本特表2000-502399號公報(bào)； 專利文獻(xiàn)5 日本特表2002-517582號公報(bào)； 專利文獻(xiàn)6 日本特表平10-504460號公報(bào)； 專利文獻(xiàn)7 日本特開平07-79788號公報(bào)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的課題在于，在工業(yè)性分離、精制微生物產(chǎn)生的PHA時(shí)，在減少來源于菌體構(gòu)成成分的雜質(zhì)的同時(shí)，抑制有機(jī)溶劑的使用量，不添加鹽、高分子凝集劑等，以及不進(jìn)行高溫處理，并且能高效率地獲得任意體積平均粒徑的PHA粒子。解決問題的手段
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過減少含有PHA的水性懸濁液中的有機(jī)氮量，無需加熱至PHA 的熔點(diǎn)附近，而在低于熔點(diǎn)的溫度，即使不添加鹽、高分子凝集劑等，PHA也會凝集，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的聚-3-羥基烷酸的制造方法之一，特征是，相對于聚-3-羥基烷酸重量， 將含有聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中的有機(jī)氮量調(diào)節(jié)到1500ppm以下之后，使聚_3_羥基烷酸在所述水性懸濁液中凝集，而獲得聚-3-羥基烷酸的凝集物。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，含有上述聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中包含的溶劑是水、 與水具有相溶性的有機(jī)溶劑、或者、水和所述有機(jī)溶劑的混合物。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是，聚-3-羥基烷酸是從由3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸以及3-羥基辛酸形成的組中選擇的兩種以上的3-羥基烷酸所構(gòu)成的共聚體。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，聚-3-羥基烷酸是3-羥基己酸和3-羥基丁酸的二元共聚物，或者是3-羥基己酸和3-羥基丁酸和3-羥基戊酸的三元共聚物。
本發(fā)明中，優(yōu)選的是，聚-3-羥基烷酸是由產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物所產(chǎn)生的聚-3-羥基烷酸。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是屬于氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、青枯菌屬或者貪銅菌屬的微生物。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是鉤蟲貪銅菌。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是導(dǎo)入了來源于豚鼠氣單胞菌的聚-3-羥基烷酸合成酶基因和/或其變異體的轉(zhuǎn)化株。發(fā)明的效果
通過本發(fā)明，能夠不通過有機(jī)溶劑的提取操作而精制微生物產(chǎn)生的PHA，而且，能夠不添加鹽、高分子凝集劑等第三成分，而在比PHA的熔點(diǎn)低的溫度下使PHA凝集。能在防止混入菌體構(gòu)成成分的同時(shí)，高生產(chǎn)率地得到細(xì)粉少的PHA凝集體。得到的凝集體不用擔(dān)心由于添加第三物質(zhì)而對品質(zhì)產(chǎn)生影響，另外，能夠避免加熱造成的PHA的分子量降低。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中使用的微生物，只要是在細(xì)胞體內(nèi)生成PHA的微生物即可，不特別限定。 可以使用從自然分離出的微生物、菌株的保藏機(jī)構(gòu)(例如IF0、ATCC等)保藏的微生物、或者基于微生物而制備得到的變異體或者轉(zhuǎn)化株。例如，可以列舉出貪銅菌(Cupriavidus)屬、 產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬、青枯菌(Ralstonia)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、芽胞桿菌 (Bacillus)屬、固氮菌(Azotobacter)屬、諾卡氏菌(Nocardia)屬、氣單胞菌(Aeromonas) 屬的菌等。其中，優(yōu)選的是屬于氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、青枯菌屬、或者貪銅菌屬的微生物。尤其，更優(yōu)選的是解脂產(chǎn)堿桿菌(A. lipolytics)、廣泛產(chǎn)堿菌(A. latus)、豚鼠氣單胞菌(A. caviae)、嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)、鉤蟲貪銅菌(C. necator)等菌株，鉤蟲貪銅菌(C.necator)最為優(yōu)選。另外，在微生物本來沒有PHA的生產(chǎn)能力的情況下，或者生產(chǎn)量低的情況下，也可以將作為目的物的PHA的合成酶基因和/或其變異體導(dǎo)入該微生物，使用所得到的變異株。作為這樣的變異株的制備中使用的PHA的合成酶基因，并不特別限定，但是優(yōu)選的是來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶的基因。通過在合適的條件下培養(yǎng)這些微生物，能夠得到菌體內(nèi)貯藏PHA的微生物菌體。關(guān)于其培養(yǎng)方法，并不特別限定，例如，可以使用日本特開平05-93049號公報(bào)等中記載的方法。本發(fā)明中的PHA是以3-羥基烷酸為單體單元的聚合物的總稱。作為構(gòu)成的3-羥基烷酸并不特別限定，具體來說，可以列舉出3-羥基丁酸(3HB)和其他3-羥基烷酸的共聚物，或者包括3-羥基己酸(3HH)在內(nèi)的3-羥基烷酸的共聚體。另外，可以列舉出從由 3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3羥基己酸、3-羥基庚酸及3-羥基辛酸形成 的組中選擇的兩種以上的3-羥基烷酸為單體單元的共聚體。其中，從得到的聚酯的物理性質(zhì)方面來說，包含3HH作為單體單元的共聚物，例如3HB和3HH的二元共聚物(PHBH) (Macro molecules, 28, 4822-4828 (1955))，或者 3HB、3_ 羥基戊酸(3HV)和 3HH 的三元共聚物 (PHBVH)(日本特許第2777757號公報(bào)，日本特開平08-289797號公報(bào))更優(yōu)選。這里對于構(gòu)成3HB和3HH的二元共聚物PHBH的各單體單元的組成比并不特別限定，但是當(dāng)以全部單體單元的合計(jì)作為100摩爾％時(shí)，3HH單元為廣99摩爾％，優(yōu)選廣50摩爾％，更優(yōu)選廣25摩爾％的組成較佳。另外，構(gòu)成3HB、3HV和3HH的三元共聚物PHBVH的各單體單元的組成比并不特別限定，但是以全部單體單元的合計(jì)作為100摩爾％時(shí)，例如，3HB單元的組成比為 Γ95摩爾％、3HV單元的組成比為廣96摩爾％，3HH單元的組成比為廣30摩爾％的范圍較佳。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，在將除PHA之外的生物來源成分等的不純物降解和/或去除之前，預(yù)先采用物理處理、化學(xué)處理或者生物處理將含有PHA的細(xì)胞破碎。這樣，能有效實(shí)施后述降解和/或去除工序。作為破碎的方法，并不特別限定，但是可以使用現(xiàn)有的公知的弗氏細(xì)胞壓碎器或均質(zhì)器、X-壓碎器(X-press)、球磨機(jī)、膠體磨、DYNO磨、超聲波均質(zhì)器等，利用流體剪切力或固體剪切力、磨碎的方法。另外，可以列舉使用酸或堿、表面活性劑、 有機(jī)溶劑、細(xì)胞壁合成抑制劑等藥劑的方法、使用溶菌酶、果膠酶、纖維素酶、藤黃節(jié)桿菌酶等酶的方法、使用超臨界流體的方法以及滲透壓破碎法、凍結(jié)法、干燥粉碎法等。另外，作為破碎法的一種，還可以列舉出利用細(xì)胞自身中包含的蛋白酶或酯酶等的作用的自溶法。上述破碎方法中，理想的是，選擇通過一系列的 處理抑制PHA的分子量降低的方法。另外，上述破碎方法可以單獨(dú)使用，也可以多種方法組合使用。另外，分批處理也可以，進(jìn)行連續(xù)處理也可以。通常，通過上述方法破碎含有PHA的菌體而得到的PHA水性懸濁液中，混入了細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類以及其他菌體構(gòu)成成分或者培養(yǎng)基殘留成分。優(yōu)選的是，在進(jìn)行后述的降解和/或者去除工序之前，先實(shí)施將含有這些蛋白質(zhì)等的水進(jìn)行分離的脫水工序。由此，降低PHA水性懸濁液中含有的不純物的量，以能夠高效實(shí)施后述降解和/或去除工序。作為脫水方法并不特別限定，可以列舉利用過濾、離心分離、沉降分離的方法。供給降解和/或去除工序的水性懸濁液中的PHA的濃度并不特別限定，優(yōu)選50g/L以上，更優(yōu)選 100g/L以上，進(jìn)一步優(yōu)選200g/L以上，更進(jìn)一步優(yōu)選300g/L以上。另外，也可以以調(diào)節(jié)水性懸濁液中的PHA的濃度為目的，實(shí)施上述脫水工序。作為降解和/或去除PHA以外的生物來源成分等不純物的方法，并不特別限定，例如可以列舉出使用酶的方法。作為使用的酶，可以列舉出蛋白質(zhì)分解酶、脂肪分解酶、細(xì)胞壁分解酶、核酸分解酶等。作為這些酶的具體示例，可以列舉出下述示例。這些示例可以單獨(dú)使用，也可以兩種以上合并使用。(1)蛋白質(zhì)分解酶
Esperase、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶寸。(2)脂肪分解酶
脂肪酶、磷脂酶、膽堿酯酶、磷酸酶等。(3)細(xì)胞壁分解酶
溶菌酶、淀粉酶、纖維素酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-葡萄糖苷酶等。(4)核酸分解酶
核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶等。PHA以外的生物來源成分等不純物的降解中使用的酶，不一定限定于上述酶，也可以是能用于工業(yè)產(chǎn)品的、任意具有降解生物來源成分的活性的酶。另外，可以使用一般市售的洗滌用酶洗滌劑等。另外，例如，也可以是含有酶的穩(wěn)定劑、再污染防止劑等和酶的酶組成物，而并不僅限于酶。上述示例中所含的酶中，作為蛋白質(zhì)分解酶，優(yōu)選地，可以列舉出由天野酶公司(天野-A社)生產(chǎn)的蛋白酶A、蛋白酶P、蛋白酶N、由諾維信公司(乂 #
廿^ A社)生產(chǎn)的Esperase、堿性蛋白酶、Savinase, Everlase等作為能工業(yè)使用的酶，從降解活性這點(diǎn)上看，也能夠較佳地使用。但是，并不限于此。酶處理時(shí)間，優(yōu)選的是，一直進(jìn)行到所希望的處理度，通常是0.5 2小時(shí)。酶的使用量取決于酶的種類和活性，并沒有特別的限制，但是相對于PHA 100重量份，優(yōu)選 0. 00廣10重量份，而且從成本這點(diǎn)上看，更優(yōu)選的是0. 00廣5重量份。作為降解PHA以外的生物來源成分等的不純物的其他方法，可以列舉出使用次氯酸、過氧化氫的方法。使用次氯酸時(shí)，在體系的PH為堿性范圍、抑制與熱或光接觸、抑制與金屬接觸的條件下實(shí)施，由此能夠得到氯殘留量低的PHA。理想的是pH為8以上、更理想的是PH為10以上，更理想的為pH12以上。處理溫度為40°C以下是理想的，更理想的是30°C 以下，更理想的是20°C以下，為了更可靠地發(fā)揮效果，在10°C以下實(shí)施是理想的。如上述，在所述脫水工序中，為了將PHA和含有除PHA之外的其他生物來源成分等的不純物的水相分離，可以實(shí)施過濾、離心分離等。過濾的方法并不特別限制，理想的是使用Nutsche 〃 ★工、過濾器)等的方法、抽吸過濾、加壓過濾等方法。工業(yè)上也可以選擇壓濾機(jī)、管壓機(jī)、平板壓力機(jī)、矯正壓力機(jī)(Y — ^ >力)、帶式壓力機(jī)、螺旋壓力機(jī)、圓板壓力機(jī)等具有壓榨功能的過濾裝置、離心脫水機(jī)、多腔缸過濾機(jī)等。在提高生產(chǎn)性的情況下，多腔缸過濾機(jī)等的連續(xù)式設(shè)備是理想的。作為連續(xù)式過濾機(jī)的粒子的除渣方法，可以列舉出繩索方式、刮刀方式、預(yù)涂助濾劑的刮刀(precoat scraper, / l· - 一卜；^夕l· “一) 方式等。另外，也可以使用膜分離方式。作為包含膜分離的過濾方法，可以選擇死端過濾、 錯(cuò)流過濾。其均可根據(jù)濾過性、濾材、膜等的閉塞程度來進(jìn)行選擇。另外，減壓或者真空進(jìn)行也可以，加壓進(jìn)行也可以。另外，使用離心力的方法也可以。作為過濾材料，可以選擇紙、 織物、無紡布、濾網(wǎng)(screen)、燒結(jié)板、素?zé)沾?素?zé)?、高分子膜、沖壓金屬、楔形絲等各種素材。其均可以根據(jù)生產(chǎn)性、閉塞的程度來進(jìn)行選擇。另外，可以使用助濾劑，也可以不用。 在使用助濾劑的情況下，有在濾材上預(yù)先鋪敷的方法(預(yù)敷方式)、在過濾原液中預(yù)先添加的方法(主體加料法)。所述脫水工序中的離心分離方法并不特別限定，可以使用離心沉降機(jī)或者離心脫水機(jī)等。如果是離心沉降機(jī)，可以列舉出分離板型、圓筒型、傾析器型。如果是分離板型，則可以列舉出盤型、自潔型、噴嘴型、螺旋沉降機(jī)型、撇沫型(skimming)等。根據(jù)各種沉降成分的排出方法，有分批式和連續(xù)式。另外，離心脫水機(jī)也有分批式和連續(xù)式。利用這些機(jī)器， 可以根據(jù)比重差來分離含有PHA的沉降物和培養(yǎng)液成分。作為所述脫水工序中可以使用的其他方法，有浮選法、電泳法、旋風(fēng)處理等?？梢詥为?dú)使用過濾、離心分離或者浮選等方法，也可以組合使用。在所述脫水工序中，用過濾、離心分離等方法回收PHA之后，通過將回收的PHA用水等洗凈，可以得到精制程度進(jìn)一步提高的PHA。除了水之外，洗凈還可以使用有機(jī)溶劑，也可以將水和有機(jī)溶劑混合使用。另外，也可以調(diào)節(jié)水的pH。在使用有機(jī)溶劑作為洗凈溶劑的情況下，優(yōu)選的是使用親水性溶劑，具體來說是甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃、酮類、 胺類等。另外，也可以在水中添加表面活性劑等。也可以將這些有機(jī)溶劑或水多種混合使用。另外，如果時(shí)間短的話，也可以將水、這些有機(jī)溶劑加熱或者作為蒸汽噴霧，來提高洗凈性。如以上所說明的，根據(jù)本發(fā)明的最佳的實(shí)施形態(tài)，通過依次實(shí)施培養(yǎng)具有在細(xì)胞內(nèi)生成PHA的能力的微生物的培養(yǎng)工序、破碎含有PHA的所述微生物的破碎工序、從含有破碎的微生物的水性懸濁液中分離水的脫水工序、降解和/或者去除不純物的精制工序、洗凈PHA的洗凈工序、以及使PHA在所得到的PHA水性懸濁液中凝集并獲得PHA凝集體的凝集工序，能夠高效率地制造PHA凝集體。但是，本發(fā)明未必一定要實(shí)施上述全部工序。如上所述，通過進(jìn)行降解和/或去除不純物的精制工序、和/或者洗凈PHA的洗凈工序，而預(yù)先減少含有PHA的水性懸濁液中的菌體構(gòu)成成分的量，能夠不利用添加鹽或高分子凝集劑、或者高溫加熱等方法，在比較低的溫度下凝集并提取PHA。PHA凝集中理想的條件可以用相對于PHA水性懸濁液中PHA重量的有機(jī)氮量來表示。該有機(jī)氮量在1500ppm 以下。高于1500ppm，則PHA的凝集不能高效進(jìn)行。優(yōu)選的是IOOOppm以下，更優(yōu)選的是 600ppm以下，進(jìn)一步優(yōu)選的是400ppm以下，更進(jìn)一步優(yōu)選的是300ppm以下，最優(yōu)選的是 IOOppm 以下。本發(fā)明中的凝集是指，PHA粒子的體積平均粒徑是相對于凝集操作前的PHA體積平均粒徑的5倍以上，理想的是10倍以上，更理想的是15倍以上。本發(fā)明中的水性懸濁液中包含的溶劑可以含有水、與水具有相溶性的有機(jī)溶劑、 或者水和所述有機(jī)溶劑的混合溶劑。所述有機(jī)溶劑可以僅使用一種，也可以并用兩種以上。 另外，作為水和所述有機(jī)溶劑的混合溶液中的所述有機(jī)溶劑的濃度，并不特別限定，只要在使用的有機(jī)溶劑處于其在水的溶解度以下即可。另外，作為與水具有相溶性的有機(jī)溶劑， 并不特別限定，例如，可以列舉出甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、戊醇、己醇、庚醇等醇類、丙酮、甲基乙基酮等酮類、四氫呋喃、二氧六環(huán)等醚類、乙腈、丙腈等腈類、二甲基甲酰胺、乙酰胺等胺類、二甲基亞砜、吡啶、哌啶等。其中從去除的容易性方面， 甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、丙酮、甲基乙基酮、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙腈、丙腈等較佳。而且，從購買容易方面，優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、 2_ 丁醇、異丁醇、丙酮等。更優(yōu)選的是甲醇、乙醇、丙酮。另外，只要不破壞本發(fā)明的宗旨，含有其他的溶劑、菌體來源成分以及精制時(shí)產(chǎn)生的化合物也沒關(guān)系?？梢酝ㄟ^對將蛋白質(zhì)等菌體構(gòu)成成分去除、將有機(jī)氮量調(diào)節(jié)到1500ppm以下的 PHA水溶性懸濁液加熱，來使PHA凝集。此時(shí)，為了抑制PHA的分子量降低，優(yōu)選的是使加熱溫度盡可能低。如果在低溫，能夠某種程度地防止處理過程中分子量的降低。具體來說， 低于PHA的熔點(diǎn)(PHA的熔點(diǎn)雖然根據(jù)單體組成而不同，但是大概為13(T18(TC)較好，優(yōu)選 130°c以下，更優(yōu)選的是110°C以下。在堿性條件下的情況下，進(jìn)一步優(yōu)選的是90°C以下，尤其優(yōu)選的是50°C以下。加熱溫度的下限并不特別限定，但是為了制造更大的粒徑的凝集體， 優(yōu)選20°C以上。凝集工序時(shí)對水性懸濁液的pH并不特別限定，可以在pH 8以上的堿性區(qū)域。根據(jù)裝置大小和能力，升溫所需的時(shí)間有所不同，但是需要充分加熱至達(dá)到PHA凝集、 粒度提高的溫度。加熱時(shí)間，從達(dá)到所述加熱溫度起，大概5小時(shí)以下，優(yōu)選的是2小時(shí)以下，更優(yōu)選的是1小時(shí)以下，進(jìn)一步優(yōu)選的是30分鐘以下。優(yōu)選的是至少一秒鐘以上的加熱。如以上所述通過預(yù)先減少PHA水性懸濁液中的菌體構(gòu)成成分的量，即使不添加鹽、高分子凝集劑等第三成分，也能夠凝集并得到PHA。另外，在PHA凝集時(shí)，不需要加熱到有可能降低PHA的分子量的高溫，或者將水性懸濁液的pH調(diào)節(jié)到酸性側(cè)，因此PHA的分子量不會降低，另外還能防止蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的凝集。
實(shí)施例以下，提出以下實(shí)施例，以對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但是，本發(fā)明并不是僅限于這些實(shí)施例。(PHA水性懸濁液中的有機(jī)氮量(相對于PHA重量)的計(jì)算方法)
使PHA水性懸濁液中的水溶性溶劑全部蒸發(fā)得到殘留的固體成分。向該固體成分中添加5M的NaOH，在95°C 下實(shí)施水解反應(yīng)。以等量的60%醋酸水溶液中和該水解反應(yīng)液，添加醋酸緩沖液和茚三酮溶液，在100°C進(jìn)行顯色反應(yīng)。利用日立制作所Ratio Beam分光光度計(jì)U-1800型對該顯色反應(yīng)液的吸光度進(jìn)行測定。將該吸光度與用亮氨酸樣品制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，計(jì)算出固體成分中的有機(jī)氮量。以相對于固體成分重量的有機(jī)氮量，作為 PHA水性懸濁液中的有機(jī)氮量(相對于PHA重量)。(PHA水性懸濁液中的PHA粒子的體積平均粒徑的測定方法)
PHA水性懸濁液中的PHA粒子的體積平均粒徑通過激光衍射散射式的粒度分布測定器求出。(實(shí)施例1)菌體培養(yǎng)液的制備
將國際公開第2008/010296號第0049段中記載的真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha) KNK-005株，按照第0050-0053段中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)，得到包含含有 PHA的菌體的菌體培養(yǎng)液。另外，真氧產(chǎn)堿桿菌目前分類屬于鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus Necator)ο(實(shí)施例2)滅菌的方法
對得到的培養(yǎng)液以內(nèi)部溫度6(T8(TC加熱、攪拌處理20分鐘，進(jìn)行滅菌處理。(實(shí)施例3)PHA水性懸濁液的制備
將按上述記載的方法進(jìn)行了培養(yǎng)、滅菌操作的培養(yǎng)液進(jìn)行堿性處理(添加30%Na0H，調(diào)節(jié)到pH 11. 8，溫度50°C，保持?jǐn)嚢鐸h)之后，進(jìn)行機(jī)械破碎處理(高壓均質(zhì)機(jī)處理(NS3015 型、Niro Soavi S.P.A)、pH 12. 5以上，600 bar下通入7次液體(7回通液)))。針對該進(jìn)行了破碎處理的培養(yǎng)液，添加占所含有PHA的1/100重量的蛋白酶(諾維信公司生產(chǎn)，商品名Esuperaze (工7 “，一七))，在pH 10、內(nèi)部溫度60°C下保持?jǐn)嚢?小時(shí)。多次進(jìn)行如下操作對其進(jìn)行離心分離(1400G、20分鐘)，去除部分上清液，接著添加等量的純水，懸濁 PHA的操作，制備具有各種有機(jī)氮量的PHA水性懸濁液。(實(shí)施例4)
將按上述記載的方法制備的PHA水性懸濁液的pH調(diào)到10，一邊攪拌一邊加熱。加熱之前的各種PHA水性懸濁液中的PHA粒子的體積平均粒徑為1 μ m。對于PHA水性懸濁液中的有機(jī)氮量為3119ppm以上的PHA水性懸濁液，加熱到80°C，沒有觀察到凝集。另一方面， 對于具有低于3199ppm的有機(jī)氮量的PHA水性懸濁液，加熱到80°C，PHA粒子的體積平均粒徑凝集成IOym以上。另外，加熱時(shí)間是60分鐘。由此可知，隨著PHA水性懸濁液中的有機(jī)氮量的降低，不加熱到PHA的熔點(diǎn)(約140°C)附近，在低于熔點(diǎn)的溫度下容易發(fā)生凝集。 這些一系列的結(jié)果示于表1。
(表1) PHA水性懸濁液中的有機(jī)氮量和凝集性表1
權(quán)利要求
1.一種聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，相對于聚-3-羥基烷酸重量，將含有聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中的有機(jī)氮量調(diào)節(jié)到1500ppm以下之后，使聚_3_羥基烷酸在所述水性懸濁液中凝集，而獲得聚-3-羥基烷酸的凝集物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，上述含有聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中包含的溶劑是水、與水具有相溶性的有機(jī)溶劑、或者水和所述有機(jī)溶劑的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，聚-3-羥基烷酸是從由3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸以及3-羥基辛酸形成的組中選擇的兩種以上的3-羥基烷酸所構(gòu)成的共聚體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，聚-3-羥基烷酸是 3-羥基己酸和3-羥基丁酸的二元共聚物，或者是3-羥基己酸、3-羥基丁酸和3-羥基戊酸的三元共聚物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于， 聚-3-羥基烷酸是由產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物所產(chǎn)生的聚-3-羥基烷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，所述產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是屬于氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、青枯菌屬或者貪銅菌屬的微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，所述產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是鉤蟲貪銅菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚-3-羥基烷酸的制造方法，其特征在于，所述產(chǎn)生聚-3-羥基烷酸的微生物是導(dǎo)入了來源于豚鼠氣單胞菌的聚-3-羥基烷酸合成酶基因和/或其變異體的轉(zhuǎn)化株。
全文摘要
在工業(yè)性分離、精制微生物產(chǎn)生的聚-3-羥基烷酸時(shí)，能夠在減少來源于菌體構(gòu)成成分的雜質(zhì)的同時(shí)，抑制有機(jī)溶劑的使用量，并且以高生產(chǎn)率獲得任意體積平均粒徑的聚-3-羥基烷酸粒子。本發(fā)明中，相對于聚3-羥基烷酸重量，將含有聚-3-羥基烷酸的水性懸濁液中的有機(jī)氮量調(diào)節(jié)到1500ppm以下之后，使聚-3-羥基烷酸在所述水性懸濁液中凝集，而獲得聚-3-羥基烷酸的凝集物。
文檔編號C12R1/01GK102224250SQ20098014666
公開日2011年10月19日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者上野雅邦, 瀧田昌輝, 淺井洋介 申請人:株式會社鐘化