專利名稱：轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)的核受體傳感器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評價物理或化學(xué)試劑對轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因豬內(nèi)組織影響的方法。
背景技術(shù)：
屬于核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子在細胞生長、分化和凋亡中起著至關(guān)重要的作用。 核受體通過活化特異靶基因的表達參與基因表達的調(diào)節(jié)。因此，核受體的活化導(dǎo)致基因表達的改變，并且被懷疑參與發(fā)展成許多病癥的途徑。核受體是許多藥物的主要靶標。已經(jīng)得到確認，典型的核激素受體如視黃酸和維生素D受體調(diào)節(jié)細胞命運，并且在角質(zhì)形成細胞中，類視黃醇和維生素D類似物已經(jīng)在治療表皮病中得到普遍應(yīng)用。最近，在控制角質(zhì)形成細胞生長和分化中已經(jīng)牽涉到所謂過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)家族的成員， 并且已經(jīng)建議靶向PPAR的藥物應(yīng)當考慮作為潛在的皮膚治療劑。鑒于核受體對細胞生長、分化和凋亡的影響，用于檢測特異核受體活化的方法是極其有價值的。此種方法可用于評價特定組織接觸潛在誘導(dǎo)核受體所介導(dǎo)基因活化的試劑的影響。這將是解析大量與核受體活化相關(guān)的病癥的機制的寶貴工具。用于檢測核受體活化的方法已經(jīng)在分子生物學(xué)研究中采用。該方法利用兩個核酸盒包含傳感器組件的一個盒和包含報告器組件的一個盒。然而，以前該核受體傳感器系統(tǒng)僅在單細胞培養(yǎng)中采用。在本發(fā)明中，核受體傳感器系統(tǒng)功能性整合入轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠或豬的基因組中。將核受體傳感器系統(tǒng)整合入轉(zhuǎn)基因動物的基因組中使得可以體內(nèi)時-空分析潛在影響核受體的試劑。例如將核受體傳感器系統(tǒng)整合入轉(zhuǎn)基因動物的皮膚中使得可以用于研究所應(yīng)用藥物或異生素進入皮膚層的滲透性。每天，動物和人均暴露于大量的不同物理和化學(xué)試劑中，例如UV輻射、異生素和食物添加劑，這些當中多數(shù)與皮膚或消化道接觸。然而，對于這些試劑中的絕大多數(shù)，還沒有表征這種接觸所帶來的潛在健康問題，并且因此，需要評價它們以什么程度透過皮膚、腸壁或其他相關(guān)組織。已知相當數(shù)量的試劑能夠影響核受體家族成員的活性，并且因此需要開發(fā)實驗系統(tǒng)，使得高效的且劃算的方法用于檢測給定物理或化學(xué)試劑穿透入特定組織和活化核受體的能力。由于人皮膚結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以難以得到人皮膚模型。已經(jīng)廣泛使用人皮膚外植體評價表皮滲透性。然而，難以得到足夠的人皮膚用于外植體研究，并且此外，有活性的人皮膚外植體具有諸多缺點，例如樣品大小、形狀和質(zhì)量差異相當大。人皮膚外植體的替代物是從分離的人角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的再生人皮膚。再生的表皮模型是精致的、有用的和實用的工具，并且已經(jīng)證明能模擬人表皮的許多分子特性和生物物理學(xué)特性。然而，與正常表皮和人皮膚外植體相比，再生表皮的屏障功能降低。有用的替代物是豬皮膚，已經(jīng)證明其是人皮膚的良好模型，并且已經(jīng)被推薦用于表皮吸收研究(用于開展皮膚吸收研究的OCDE指導(dǎo)文件；測試和評價系列，第觀)。豬皮膚的組織與人皮膚類似，并且預(yù)測，豬系統(tǒng)的皮膚傳感器的產(chǎn)生與先進的基于熒光的方案的結(jié)合將證明其在用于基礎(chǔ)以及原位目的的更多應(yīng)用(測試物質(zhì)和異生素的滲透性)中的重要性。通過使用豬克隆和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的最新進展，可以將核受體傳感器系統(tǒng)整合入豬中以產(chǎn)生在皮膚中具有傳感器系統(tǒng)的克隆的轉(zhuǎn)基因豬，并且因此，可以用于體內(nèi)滲透性研究。此種轉(zhuǎn)基因動物將為研究藥物和異生素的皮膚滲透性提供重要的技術(shù)。此類認識對于向皮膚的藥物遞送和用于異生素的風險評價將是重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于評價試劑對組織影響的方法。本發(fā)明還用作用于評價另外的化合物有效性的方法，該另外的化合物在試劑之前應(yīng)用于組織以最小化或最大化所述物理或化學(xué)試劑對所述組織的影響。在一個方面中，本發(fā)明涉及用于評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法，包括a)提供轉(zhuǎn)基因動物，其包含至少一種核酸序列，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b)向所述動物施用所述試劑， 和c)評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物在步驟 (b)之前和之后的改變表明對所述組織有影響。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于測試化合物改變動物組織內(nèi)試劑影響能力的方法，包括a)向包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b)向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和c)評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物的量在所述化合物存在和缺乏下不同表明所述化合物能夠改變所述試劑在所述組織內(nèi)的影響。在第三個方面中，本發(fā)明涉及包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在第四個方面中，本發(fā)明涉及從根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物衍生的細胞系。本發(fā)明還包括非人轉(zhuǎn)基因動物，其包含本發(fā)明的傳感器和/或報告盒。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物，包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因動物是選自豬、迷你豬、微型豬、小鼠、大鼠、非人靈長類和嚙齒類動物的一個實施方案，并且優(yōu)選是豬。核受體優(yōu)選的是甲狀腺激素受體-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲狀腺激素受體-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、視黃酸受體-α (RARa ；NR1B1, RARA)、 視黃酸受體-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、視黃酸受體-γ (RARy ；NR1B3, RARG)、過氧化物酶體增殖物激活受體-a (PPARa ；NR1C1, PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、過氧化物酶體增殖物激活受體_ Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA a (Rev-ErbA α ；NR1D1)、Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相關(guān)孤兒受體-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相關(guān)孤兒受體-β (ROR^ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受體-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受體-β (LXR β ；NR1H2)、法尼醇 X 受體(FXR ；NR1H4)、維生素D受體(VDR;NR1I1，VDR)(維生素D)、孕烷X受體(P)CR ;NR1I2)、組成型雄烷受體 (〇八1 ;殿113)、肝細胞核因子-4-0 (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝細胞核因子-4-γ (HNF4 γ ； NR2A2, HNF4G)、類視黃醇 X 受體-a (RXRa ； NR2B1, RXRA)、類視黃醇 X 受體-β (RXR3 ； NR2B2, RXRB)、類視黃醇 X 受體-Y (RXR γ ；NR2B3, RXRG)、睪丸受體 2 (TR2 ；NR2C1)、睪丸受體4 (TR4 ；殿2以)、果蠅tai 1 less基因的人同系物(TLX ；NR2E1)、感光細胞-特異核受體(PNR ；NR2E3)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子 II (C0UP-TFII ； NR2F2)、6 :V_erbA-相關(guān)(EAR-2 ； NR2F6)、 雌激素受體-a (ERa ；NR3A1, ESR1)、雌激素受體-β (ER^ ；NR3A2, ESR2)、雌激素相關(guān)受體-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)、雌激素相關(guān)受體-β (ERRβ ；NR3B2, ESRRB)、雌激素相關(guān)受體-Y (ERRy ；NR3B3, ESRRG)、糖皮質(zhì)激素受體(GR ;NR3C1)(皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR;NR3C2)(醛固酮)、孕酮受體(PR;NR3C3，PGR)(性激素孕酮)、雄激素受體 (AR ；NR3C4, AR)(性激素睪酮)、神經(jīng)生長因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受體相關(guān)1 (NURR1 ； NR4A2)、神經(jīng)元衍生的孤兒受體1 (N0R1 ；NR4A3)、類固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)、肝受體同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、生精細胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (劑量敏感性性反轉(zhuǎn)，腎上腺發(fā)育不全關(guān)鍵區(qū)，在X染色體上，基因l(NROBl))、小異二聚體伴侶(SHP;NR0B2)或具有兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體QDBD-NR)，并且更優(yōu)選地核受體選自維生素D受體、肝X受體、 視黃酸受體、類視黃醇X受體、混雜孕烷X受體和過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)，包括 PPARa、PPARi3 / δ、PPAR γ。在優(yōu)選的實施方案中，核受體或其部分包含核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其片段。本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因動物包含a.至少一種編碼融合多肽的核酸序列，融合蛋白包含偶聯(lián)至酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PPAR δ或其部分和/或b.至少一種編碼β-半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是GAL4 DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LexA DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、和/或它們的任何部分。此外，核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分優(yōu)選地從可誘導(dǎo)和/或組織-特異性啟動子表達，例如對選自皮膚、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和/或腫瘤的組織具有特異性的啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，組織-特異性啟動子是角蛋白14增強子/啟動子。在一個實施方案中，編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列還包含至少一種酵母上游活化序列(UASgal)、細菌LexA結(jié)合位點和/或其部分。此外，編碼可檢測報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的核酸序列優(yōu)選地從異源性和/或可誘導(dǎo)啟動子表達。在優(yōu)選的實施方案中，核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分物理性或化學(xué)性偶聯(lián)，例如，多肽優(yōu)選的作為融合肽表達。所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的表達優(yōu)選地促進報告多肽的表達。報告轉(zhuǎn)錄物、多肽或其片段優(yōu)選地包含可目視、光學(xué)或放射自顯影檢測的產(chǎn)物，并且因此，在一個實施方案中報告多肽是選自β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed單體、 ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、螢火蟲螢光素酶、lac Z、海腎螢光素酶、SEAP、增強綠色熒光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增強藍色熒光蛋白(eBFP)、增強黃色熒光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增強青色熒光蛋白(eCFP)、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白、人α-1-抗胰蛋白酶 (hAAT)和/或其片段、修飾物或功能變體；在優(yōu)選的實施方案中，報告多肽是半乳糖苷酶。報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的表達可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何適宜檢測技術(shù)，例如選自酶或光譜測定、共聚焦或多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、引物延伸和DNA陣列技術(shù)檢測。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于評價試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性影響的方法，所述方法包括a.提供如上所定義的本發(fā)明非人轉(zhuǎn)基因動物，b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用試劑，和c.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達指示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。在又一個方面中，本發(fā)明涉及用于檢測化合物改變試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性影響的能力的方法，包括a.提供如上所定義的本發(fā)明非人轉(zhuǎn)基因動物，b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，c.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和d.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達指示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。在本發(fā)明方法中，編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列的表達在所述試劑和/或化合物存在和缺乏下檢測。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，在所述試劑存在下與所述試劑缺乏下相比a.所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達升高指示所述試劑對所述核受體的活性具有刺激性影響，b.所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達降低指示所述試劑對所述核受體的活性具有抑制性影響，和c.所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達未改變指示所述試劑對所述核受體的活性不具有或者具有很小的影響。同樣地，在本發(fā)明方法的另外的優(yōu)選實施方案中，所述化合物存在下與所述化合物缺乏下相比
a.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達的影響升高表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響具有刺激性影響，b.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達的影響減少表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響具有抑制性影響，和c.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達的影響很小或未改變表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響不具有或者具有很小的影響。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的表達促進所述報告多肽的表達。編碼報告多肽的核酸序列的表達優(yōu)選通過檢測編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物檢測，例如，所述報告轉(zhuǎn)錄物或多肽表達的檢測包括通過選自酶或光譜測定、共聚焦或多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、引物延伸和DNA陣列技術(shù)的任何技術(shù)檢測。本發(fā)明方法和用途的試劑和/或化合物是任何物理或化學(xué)試劑，例如藥物組合物、化妝品、藥物、異生素化合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食補充劑、輻射和/或電刺激。在優(yōu)選的實施方案中，化合物是防曬洗劑和/或所述試劑是UV-輻射。試劑和/或化合物為例如溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微粒和/或納米顆粒形式，并且試劑或化合物通過例如口服包括頰和舌下、直腸、鼻、局部、肺、陰道或腸胃外包括肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用或通過吸入或吹入施用而施用；優(yōu)選地試劑或化合物通過局部和/或肺施用而施用。在本發(fā)明方法中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的檢測在活動物中開展；例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的檢測在不將組織從活動物中取出下開展。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯報告產(chǎn)物的檢測在從動物中取出的組織樣品上開展。組織例如選自皮膚、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和/或汗液；優(yōu)選地組織是皮膚、表皮和/或真皮。在另一個方面中，本發(fā)明涉及從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物衍生的細胞系。本發(fā)明的另一個方面涉及轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物衍生的細胞核，和/或轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，其中轉(zhuǎn)基因基因組包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在又一方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、 胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核的方法，包括步驟i.提供供體細胞，ii.通過插入下列對i)的供體細胞進行基因修飾a.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和
b.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或c.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，iii.將在ii)中得到的供體細胞的修飾的基因組轉(zhuǎn)移進入宿主細胞，iv.得到形成胚胎的重構(gòu)胚胎v.培養(yǎng)所述胚胎；和vi.轉(zhuǎn)移所述培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以致于胚胎發(fā)育成基因修飾的胎兒，其中所述基因修飾的胚胎通過包括步驟i)至V)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中所述基因修飾的胚泡通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中所述基因修飾的胎兒通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。此外，本發(fā)明的方面涉及本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物、細胞系、卵母細胞、精細胞、胚泡、 胚胎、胎兒、供體細胞和/或細胞核用于評價核受體活性的用途。在優(yōu)選的實施方案中，用途涉及評價試劑對核受體活性的影響，例如如上所定義試劑。在另一實施方案中，用途涉及體內(nèi)評價因內(nèi)源激動劑而引起的核受體活性，例如因在正常皮膚發(fā)育過程中產(chǎn)生的激動劑而引起的核受體活性。在特定實施方案中，內(nèi)源激動劑在疾病，例如銀屑病、不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生。


圖1. A 核受體傳感器系統(tǒng)原理，C 睡美人(slewing beauty) (SB)基因傳感器。圖 2. A :pT2/UAS-d2eGFP ；B ρ T 2/UA S-d2 e GFP + pM/h VD R ；C :pT2/ UAS-d2eGFP+Gal4VP16 ；D pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-6M 阿法骨化醇；E :pT2/ UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-8M 阿法骨化醇；F :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10"-10M 阿法骨化醇；G :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10"-6M 鈣泊三醇；H pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+10“-8M 鈣泊三醇；I :pT2/UAS-d2eGFP+pM/hVDR+l(T-10M 鈣泊三醇。圖3.如通過對以所標明核受體傳感器載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞進行的FASC篩選所證實的表達GFP細胞的百分數(shù)。圖4.以所標明核受體傳感器載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的表達GFP細胞的平均綠色熒光。圖5. A 在同一質(zhì)粒上具有傳感器和受體組件的順式構(gòu)建體。該構(gòu)建體是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬的本發(fā)明優(yōu)選實施方案。B:與A相同的構(gòu)建體，但是具有SV40啟動子用于 Gal4hVDR表達。C 反式作用構(gòu)建體，其中傳感器和受體部件位于分開的質(zhì)粒上。反式作用構(gòu)建體可用在順式作用構(gòu)建體的功能性降低的情況下。然而，反式作用載體的使用存在在繁殖過程中丟失一個組件的風險。LIR:左反向重復(fù)；4XUAS:4次重復(fù)上游激活序列； d2eGFP 不穩(wěn)定增強綠色熒光蛋白；Neo 新霉素抗性基因；feil4-hVDR 酵母轉(zhuǎn)錄激活劑蛋白質(zhì)；MR:右反向重復(fù)；miniTK啟動子最小胸苷激酶啟動子；SV40啟動子猿猴病毒40 啟動子；K14啟動子人角蛋白14啟動子med β-珠蛋白內(nèi)含子。
具體實施例方式用于檢測特異核受體活化的方法學(xué)是廣泛應(yīng)用性的。本發(fā)明提供檢測特異核受體活化的方法。此外，該方法學(xué)使得可以用于評價物理或化學(xué)試劑對特異核受體活化的影響。在進一步的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法還可以用于評價在所述物理或化學(xué)試劑施用之前、之后或同時向組織施用化合物的抵消或增強所述物理或化學(xué)試劑對核受體活化影響的能力。本發(fā)明可檢測在發(fā)育的各個階段過程中和/或在先前施用可改變所述試劑影響的化合物之后動物組織內(nèi)所選擇核受體的活化。本發(fā)明的方法使得可以用于檢測所選擇核受體的空間和時間活化。根據(jù)本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)可用于數(shù)個目的，包括i)研究已知活化所選擇核受體的藥物物質(zhì)的有效性，ii)測定組織正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中因內(nèi)源激動劑的產(chǎn)生所引起的核受體活化，iii)研究多種異生素進入組織內(nèi)的滲透能力，和iv)用于藥物遞送目的研究不同類型脂質(zhì)體、納米顆?；蚱渌苿┻\輸化合物進入組織內(nèi)的能力。通過以包含已知核受體激活劑的在測配方處理組織，報告系統(tǒng)的活化將反映出配方的滲透能力。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及用于評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法。該方法包括a)提供轉(zhuǎn)基因動物，包含至少一種核酸序列，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b)向所述動物施用所述試劑，和c)評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物在步驟(b)之前和之后的改變表明對所述組織有影響。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于測試化合物改變試劑在動物組織內(nèi)影響的能力的方法。該方法包括a)向包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b)向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和c)評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/ 或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物的量在所述化合物存在和缺乏下存在不同表明所述化合物能夠改變所述試劑在所述組織內(nèi)的影響。在該上下文中，術(shù)語“改變”包括降低或增加物理或化學(xué)試劑對待評價核受體的影響。本發(fā)明的該方面包括向轉(zhuǎn)基因動物組織施用所述化合物，其基因組包含編碼報告多肽的核酸序列，和編碼偶聯(lián)至DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體的另外核酸序列，將轉(zhuǎn)基因動物暴露于施用至組織的物理或化學(xué)試劑下，和測量編碼報告多肽的核酸序列的表達。如本文所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”指非人動物，其在其基因組中包含外來基因。外來基因可以包含在種系組織中并且因此被傳遞至后代。外源性基因可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)轉(zhuǎn)移至動物的基因組中。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選方法和技術(shù)在本文別處描述。如本文所使用，術(shù)語“體內(nèi)”指在活動物身體內(nèi)發(fā)生的任何過程、反應(yīng)或?qū)嶒?。如本文所使用，術(shù)語“異源性”指正常情況下在天然條件下沒有發(fā)現(xiàn)緊密相連的核酸序列的任何組合。根據(jù)本發(fā)明的異源性基因優(yōu)選地選自，但不限于如本文別處所定義的報告基因、核受體、啟動子和增強子。術(shù)語“評價”、“評價，，或“評估，，通常指對目的參數(shù)的估計。估計有代表性地基于對參數(shù)的直接檢測或測定和/或?qū)λ鰠?shù)指示物的檢測或測定。由此，具體而言，試劑對核受體活性的影響基于對報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的檢測而評估。術(shù)語“多核苷酸”或“核酸序列”指長度至少2個堿基的聚合形式的核苷酸。術(shù)語 “氨基酸”和“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列、或它們當中任意一種的片段，并且指天然存在的分子或合成的分子。當為了指天然存在蛋白質(zhì)分子序列而描述“氨基酸序列”時，“氨基酸序列”和相似術(shù)語并不意味著限制氨基酸序列為與所描述蛋白質(zhì)分子有關(guān)的完全天然的氨基酸序列。如本文所使用，術(shù)語“核酸”包括包含一個或一個以上修飾堿基的DNA或RNA。因此，具有因穩(wěn)定性原因或因其它原因而修飾的主鏈的DNA或RNA是“核酸序列”，如該術(shù)語在本文中所預(yù)期的那樣。此外，如在本文中所使用的術(shù)語那樣，包含稀有堿基如肌苷或修飾堿基如三苯甲基化堿基的DNA或RNA是核酸序列，在此僅舉兩例。應(yīng)該意識到，已經(jīng)對DNA和RNA進行各式各樣的修飾，所述修飾用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的諸多有用目的。如在本文所采用的術(shù)語核酸包括此類化學(xué)、酶學(xué)或代謝修飾形式的核酸，以及病毒和細胞特有的化學(xué)形式的DNA和RNA，尤其是單細胞和復(fù)雜細胞。如本文所使用的與核酸序列或多肽有關(guān)的其“片段”或“部分”是本發(fā)明核酸序列或多肽的獨一無二的部分，其在序列上與親本序列相同，但長度上短于親本序列。因此，術(shù)語“片段”或“部分”指這樣的本發(fā)明核酸序列或多肽，其可以包含直至整個長度的所定義序列減去一個核苷酸或氨基酸殘基。例如，片段可以包含從5至100000個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。片段可優(yōu)選地選自分子的某些區(qū)域，例如特異功能區(qū)，例如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，多肽片段可以包含選自如在某些定義序列中所示多肽的第一個 250個或500個氨基酸(或者第一個25%或50% )的某些長度的連續(xù)氨基酸。顯然，這些長度是示例性的，并且說明書，包括序列表、表和圖所支持的任何長度可以包含在本實施方案之內(nèi)。術(shù)語“同源性”指兩個或更多個多核苷酸序列或者兩個或更多個多肽序列之間的序列相似性，或者可互換地，序列同一性。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域眾所周知的。描述了多個程序和比對算法，并且提出了對序列比對方法和同源性計算的詳細考慮，例如VECTOR NTI0兩個核酸序列或者兩個氨基酸序列之間的相似性以序列間用序列相似性表示，否則被稱為序列同一性。序列同一性常常以同一性百分數(shù)(或者相似性或者同源性)測量； 百分數(shù)越高，兩個序列將會越相似。NCBI基本局部比對搜索工具(BLAST)可從數(shù)個來源得到，包括國家生物技術(shù)信息中心(NBCI, Bethesda, Md.)和互聯(lián)網(wǎng)上，用于與序列分析程序blastp、blastn、blastx、 tblastn 和 tblastx 關(guān)聯(lián)使用。其可以以網(wǎng)址 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 訪問。關(guān)于如何使用該程序確定序列同一性的描述可以在http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/blast-help. html 中得到。所公開多肽的同系物有代表性地表征為，與使用有缺口 blastp的NCBI基本Blast 2.0將所公開氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫如nr或者swissprot數(shù)據(jù)庫進行全長比對計算時具有至少94%的序列同一性。備選地，可以手工比對序列并計算相同氨基酸的數(shù)量。將該數(shù)除以你的序列中的氨基酸總數(shù)再乘以100得到同一性百分數(shù)。如對于多核苷酸序列所適用的術(shù)語“同一性百分數(shù)”和“ ％同一性”指使用標準化算法比對的至少兩個多核苷酸序列之間殘基匹配的百分數(shù)。此種算法可以標準化和重現(xiàn)性方式在被比較序列中插入空隙以便優(yōu)化兩個序列之間的比對，并且因此完成兩個序列的更有意義的比較。由于遺傳密碼的簡并性，未顯示高程度同一性的核酸序列仍然可編碼相似的氨基酸序列?？梢岳斫?，可以使用這種簡并性對核酸序列進行更改以產(chǎn)生均編碼基本相同蛋白質(zhì)的多個核酸序列。如對于多肽序列所適用的短語“同一性百分數(shù)”和“％同一性”指使用標準算法比對的至少兩個多肽序列間殘基匹配的百分數(shù)。多肽序列比對方法是眾所周知的。一些比對方法把保守氨基酸替代考慮在內(nèi)。在上面更詳細解釋的此類保守替代通常保留了替換部位的電荷和疏水性，因此保留了多肽的結(jié)構(gòu)(由此保留了功能)。同一性百分數(shù)可以在全部所定義，例如如由特定SEQ ID號所定義多肽序列的長度上測量，或者可以在更短的長度上測量，例如從來自較長的所定義多肽序列的片段長度上測量，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150個連續(xù)殘基的片段。此類長度僅是示例性的，并且應(yīng)當理解，通過本文在表、圖或序列表中所示序列所支持的任何片段長度可以用于描述可以在其上測量同一性百分數(shù)的長度。同一性百分數(shù)可以在整個所定義序列，例如通過特定SEQ ID號所定義的序列的長度上測量，或者可以在更短的長度上測量，例如，來自較長的所定義序列的片段的長度上測量，如至少20、至少30、至少40、至少50、至少70、至少100或至少200個連續(xù)核苷酸的片段。此類長度僅是示例性的，并且應(yīng)當理解，通過本文在表、圖或序列表中所示序列支持的任何片段長度可以用于描述在其上可以測量同一性百分數(shù)的長度。如本文關(guān)于兩個或更多個多肽所使用的術(shù)語“物理或化學(xué)偶聯(lián)的”意思是指多肽通過物理和/或化學(xué)相互作用連接。通過使用化學(xué)或物理交聯(lián)劑的化學(xué)偶聯(lián)方法在本領(lǐng)域中眾所周知。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的物理或化學(xué)偶聯(lián)多肽作為融合肽表達，其中多肽通過肽鍵(酰胺鍵)偶聯(lián)。片段用于指非全長部分的核酸或多肽。因此，片段本身也分別是核酸或多肽。功能同系物功能同系物可以是表現(xiàn)出與給定基因/基因產(chǎn)物/蛋白質(zhì)/多肽的野生型形式/序列具有至少一些序列同一性并且保留了至少一個方面的最初序列功能性的任何核酸/蛋白質(zhì)/多肽。因此，Hiv-I包膜的功能同系物具有誘導(dǎo)針對表達Hiv-I包膜的細胞的免疫應(yīng)答的能力。啟動子DNA鏈上的結(jié)合部位，RNA聚合酶結(jié)合于此通過一個或更多個附近結(jié)構(gòu)基因啟動信使RNA的轉(zhuǎn)錄。如本文所使用的術(shù)語“生物學(xué)樣品”或“樣品”指包含遺傳物質(zhì)，如RNA或DNA和/ 或蛋白質(zhì)的任何適宜生物學(xué)樣品。在優(yōu)選的實施方案中，樣品從受試者，例如豬、小鼠或另一哺乳動物分離。在優(yōu)選的實施方案中，樣品是選自皮膚、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和/或汗液的組織樣品。最方便的樣品類型是血液樣品；然而，樣品的選擇取決于特定疾病或臨床狀態(tài)以及檢測方法并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。術(shù)語“激動劑”指模擬激活分子功能的物質(zhì)。術(shù)語“拮抗劑”指與激動劑競爭結(jié)合部位但不引起有效反應(yīng)的分子。拮抗劑包括，但不限于，藥物、激素、抗體和神經(jīng)遞質(zhì)，以及其類似物和片段。術(shù)語“配體”指結(jié)合另一分子上特異部位(配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD))的任何分子。 因此，術(shù)語“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是例如核受體中結(jié)合配體的部位。配體與多肽如核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合引起多肽中的構(gòu)象改變，這將改變多肽的催化或調(diào)節(jié)活性。術(shù)語“調(diào)整”包括與適宜對照相比所測量活性的增加或降低、刺激、抑制或阻斷。表達水平的“調(diào)整”包括與缺乏正測試的試劑的對照相比，本發(fā)明多核苷酸所編碼mRNA或多肽水平的增加和降低。在一些實施方案中，特別感興趣的試劑是抑制受試多肽生物學(xué)活性、 和/或降低細胞中受試多肽水平、和/或降低細胞中受試mRNA水平和/或降低受試多肽從真核細胞釋放的那些。在另外的實施方案中，感興趣的試劑是增加受試多肽生物學(xué)活性、和 /或增加細胞中受試多肽水平、和/或增加細胞中受試mRNA水平和/或增加受試多肽從真核細胞釋放的那些。如本文所使用的術(shù)語“基因產(chǎn)物”指基因的任何轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括從特定基因轉(zhuǎn)錄的任何RNA種類，例如前體RNA、mRNA、tRNA、miRNA、剪接的和非剪接的RNA。 轉(zhuǎn)錄物可以被RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，并且因此被包裝進入核糖核蛋白(RNP)中，例如mRNP分子。本發(fā)明的翻譯基因產(chǎn)物包括由基因或其片段編碼的任何肽或多肽。因此，“由本發(fā)明基因編碼的多肽”包含在術(shù)語“基因產(chǎn)物”或“翻譯基因產(chǎn)物”中。本發(fā)明的翻譯基因產(chǎn)物包括由本發(fā)明核酸序列編碼的任何多肽種類。例如，本發(fā)明的翻譯基因產(chǎn)物包括由選自任意的SEQ ID NO=I- 或其互補物或其部分的序列所編碼的任何多肽種類。如本文所使用的關(guān)于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯基因產(chǎn)物表達的術(shù)語“增加”或“降低”分別指所述轉(zhuǎn)錄和/或翻譯基因產(chǎn)物的增多或減少；即例如在給定處理，如施用本發(fā)明試劑或化合物之前或之后動物、組織和/或細胞群體中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯基因產(chǎn)物的水平比平均水平更低。關(guān)于本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄物水平可以通過例如定量或半定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定。轉(zhuǎn)錄物水平可以根據(jù)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物標準化。降低的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性可以通過例如如通過RT-PCR所測定的特異RNA轉(zhuǎn)錄物水平的減少或降低觀察到。在優(yōu)選的實施方案中，RNA水平通過RT-PCR測定。翻譯產(chǎn)物活性降低包括多肽如報告多肽數(shù)量/水平兩者的降低，和/或降低的所述多肽的酶活性和/或降低的多肽與另外多肽相互作用并進行信號級聯(lián)的能力。多肽水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的任何適宜方法測定，例如通過western印跡或ELISA。在一個實施方案中，與缺乏本發(fā)明試劑相比，在所述試劑存在下表達增加至少10%、例如至少20%、例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%、例如至少100%、例如至少200%、例如至少300%、例如至少 400%、例如至少500%、例如至少600%、例如至少700%、例如至少800%、例如至少900%、 例如至少1000%。在另一實施方案中，與缺乏本發(fā)明試劑相比，在所述試劑存在下表達降低至小于95%、例如小于90%、例如小于80%、例如小于70%、例如小于60%、例如小于 50%、例如小于40%、例如小于30%、例如小于20%、例如小于10%、例如小于9%、例如小于8%、例如小于7%、例如小于6%、例如小于5%、例如小于4%、例如小于3%、例如小于 2%、例如小于1%、例如小于0.5%。
核受體傳感器系統(tǒng)本發(fā)明方法包括用于體內(nèi)檢測核受體活化的分子傳感器系統(tǒng)。核受體系統(tǒng)包括傳感器組件和報告器組件。核受體傳感器系統(tǒng)依賴于組織細胞內(nèi)傳感器系統(tǒng)和報告系統(tǒng)之間的分子相互作用。傳感器系統(tǒng)包含核受體或其片段，其物理性或化學(xué)性偶聯(lián)，如融合至異源性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。配體與核受體的結(jié)合引起融合多肽的構(gòu)象變化，融合多肽與對融合多肽DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性的DNA元件結(jié)合，由此促進下游基因簇的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還涉及包含核受體傳感器盒和/或報告盒的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中傳感器盒通常包含至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，并且傳感器盒通常包含至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點。在本發(fā)明非人轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核以及方法和用途的優(yōu)選實施方案中，核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的表達促進所述報告多肽的表達。具體而言，當存在所述核受體的配體或激動劑時，核受體或其部分，例如所述核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域促進報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的表達。傳感器系統(tǒng)本發(fā)明涉及在其基因組中包含傳感器組件和/或報告器組件的非人轉(zhuǎn)基因動物， 優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核。通常，傳感器組件包含至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和/或任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。因此，本發(fā)明包含編碼報告多肽的一種核酸序列和編碼融合多肽的另外的核酸序列，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。該另外的核酸序列是本發(fā)明傳感器系統(tǒng)的一部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的傳感器系統(tǒng)包含編碼含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合肽的核酸盒。在一個實施方案中，核酸序列或編碼傳感器系統(tǒng)的另外的核酸序列之前是啟動子。因此，在一個實施方案中，所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分從可誘導(dǎo)啟動子和/或組織-特異性啟動子或者可誘導(dǎo)組織-特異性啟動子表達。在特定實施方案中，啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。在一個實施方案中，核酸序列或另外的核酸序列包含組織特異性增強子/啟動子以在特異組織中靶向表達融合肽。由此，本發(fā)明的報告系統(tǒng)可以通過表達此類融合肽活化。特別地，組織-特異性啟動子是對選自皮膚、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和/或腫瘤的組織特異性的。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子是皮膚-特異性啟動子。在另一優(yōu)選的實施方案中，啟動子是角蛋白14增強子/啟動子。因此，在一個此類實施方案中，編碼偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體的另外的核酸序列從組織-特異性啟動子表達。在一個實施方案中，啟動子包含增強子元件。在一個實施方案中，啟動子包含光可誘導(dǎo)序列。在又一實施方案中，啟動子包含化學(xué)可誘導(dǎo)序列。傳感器組件的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是可偶聯(lián)至傳感器組件核受體或其部分的任何多肽或其它化學(xué)基。DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能是指導(dǎo)核受體或其部分至靶區(qū)域，例如本發(fā)明報告基因的啟動子區(qū)或上游活化序列。在優(yōu)選的實施方案中，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)) Gal4 上游活化區(qū)(GAL 4 UAS 或 UASgal)，或其任何部分或功能同系物。在另一優(yōu)選的實施方案中，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是細菌LexA DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其任何部分或功能同系物。在另一實施方案中，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是酵母UASgal，LexA DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其任何部分或功能同系物。在優(yōu)選的實施方案中，核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分物理性或化學(xué)性偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用用于通過使用化學(xué)或物理交聯(lián)劑進行化學(xué)交聯(lián)的數(shù)個方法。在優(yōu)選的實施方案中，核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分作為融合肽表達， 其中多肽通過肽鍵(酰胺鍵)偶聯(lián)。因此，在優(yōu)選的實施方案中，傳感器多肽作為融合肽表達。在優(yōu)選的實施方案中，傳感器組件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自酵母GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自核受體，例如視黃酸受體、維生素D受體、肝X受體、混雜孕烷X受體或PPAR。在特定實施方案中，融合構(gòu)建體的啟動子區(qū)被已知驅(qū)動表皮特異性表達的角蛋白14增強子/啟動子替換，以保證皮膚特異性表達。在優(yōu)選的實施方案中，包含在本發(fā)明融合多肽內(nèi)的核受體或其部分包含至少一個核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段，如下面所定義。核受體或其部分可以插入至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的任何位置和/或偶聯(lián)至DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意末端。因此，在一個實施方案中，融合多肽包含插入至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)和/或在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的N-末端和/或C-末端的核受體或其部分。在特定實施方案中，融合多肽包含插入在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分C-末端的核受體或其部分。在本發(fā)明方法、動物和/或細胞的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明融合多肽的表達促進任何報告多肽的表達，如本文所定義。核受體本發(fā)明使得可以檢測組織中所選擇核受體的活化。檢測可以在該組織發(fā)育的所有階段進行。核受體屬于對激素和某些其它分子響應(yīng)的一類蛋白質(zhì)。核受體與另外的蛋白質(zhì)協(xié)作以增加特異基因的表達。核受體歸類于轉(zhuǎn)錄因子它們與DNA相互作用并且調(diào)節(jié)臨近基因的表達。通過核受體對基因表達的這種調(diào)節(jié)是配體依賴性的，并且核受體正常情況下僅在配體存在下是活化的。配體是化學(xué)物質(zhì)，其與核受體的結(jié)合引起受體的構(gòu)象改變，導(dǎo)致受體的活化和相應(yīng)基因表達的上調(diào)。結(jié)合活化核受體的配體包括親脂性物質(zhì)，例如內(nèi)源激素、維生素A和D、和異生素。大量基因的表達由核受體調(diào)節(jié)并且活化這些受體的配體將對生物體具有重要的影響。具體而言，核受體調(diào)節(jié)與多種病癥有關(guān)的基因，例如多種癌癥類型和其它高增生性病癥。由此，核受體是大范圍藥物的共同靶標。此外，核受體在生物體發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中基因表達的時空調(diào)節(jié)中起著重要的作用。稱作孤兒受體的特定組核受體不具有已知的內(nèi)源配體。這些受體中的一些，例如 FXR、LXR和PPAR結(jié)合大量的代謝中間體，例如脂肪酸、膽汁酸和/或具有相對低親和性的固醇，并且由此將作為代謝傳感器起作用。另外的核受體，例如CAR和P)(R表現(xiàn)出作為刺激代謝異生素的細胞色素P450酶表達的異生素傳感器起作用。核受體具有模塊結(jié)構(gòu)并且包含下列A-F結(jié)構(gòu)域A-B)N_末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含活化功能I(AF-I)，其是配體不依賴性的。AF-I的轉(zhuǎn)錄活化作用通常非常弱，但是與下面提到的活化功能2(AF-2)相聯(lián)合時利于引起基因表達的更強的上調(diào)。A-B結(jié)構(gòu)域在序列上高度可變。ODNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)該結(jié)構(gòu)域包含兩個鋅指，其結(jié)合至稱作激素應(yīng)答元件 (HRE)的特異DNA區(qū)。DBD是高度保守的。D)鉸鏈區(qū)該可變形結(jié)構(gòu)域連接DBD與LBD，見下。鉸鏈區(qū)還影響細胞內(nèi)運輸和亞細胞分布。E)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD) :LBD是α螺旋夾層折疊結(jié)構(gòu)，其中三個反平行α螺旋的一側(cè)為兩個α螺旋另一側(cè)為三個α螺旋。配體結(jié)合腔位于LBD內(nèi)部并且剛好在三個反平行α螺旋下面。LBD與DBD—起促成受體的二聚化以及共激活劑和輔阻遏物蛋白質(zhì)的結(jié)合。該結(jié)構(gòu)域也包含活化功能2 (AF-2)，其作用依賴于配體結(jié)合。在不同核受體之間，LBD 在序列上是適度保守性的，并且不同核受體之間在結(jié)構(gòu)上是高度保守的。F)C_末端結(jié)構(gòu)域在不同核受體之間該結(jié)構(gòu)域在序列上不同。在一般的機制中，配體與核受體的結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象變化，這觸發(fā)了大量的下游事件，最終導(dǎo)致基因表達的上調(diào)或下調(diào)。根據(jù)它們的特定作用機制和在配體缺乏時的亞細胞分布，可將核受體歸為兩個大類。類型I核受體主要位于胞液中，而類型II核受體位于細胞核內(nèi)。類型I配體與胞液中類型I核受體的結(jié)合導(dǎo)致熱休克蛋白的游離和同二聚化，接著是從胞液易位進入細胞核，在其中核受體結(jié)合至稱作激素應(yīng)答元件(HRE)的特異DNA區(qū)。類型 I核受體結(jié)合由通過可變長度DNA分開的兩個半位點組成的HRE，其中第二個半位點是第一個半位點的反向重復(fù)。然后核受體/DNA復(fù)合體引起另外的蛋白質(zhì)的募集，這最終活化位于 HRE下游的基因的轉(zhuǎn)錄。類型II類型II受體主要滯留在細胞核內(nèi)，而不管配體結(jié)合狀態(tài)如何。此外，類型II核受體通常與RXR —起作為異二聚體結(jié)合至DNA。在配體缺乏情況下，類型II核受體常常與輔阻遏物蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。配體與核受體的結(jié)合導(dǎo)致輔阻遏物的游離和共激活劑蛋白質(zhì)的募集。然后另外的蛋白質(zhì)，包括RNA聚合酶被募集至核受體/DNA復(fù)合體以活化下游基因的轉(zhuǎn)錄。類型III類型III核受體(主要是NR亞家族2)與類型I受體相似，在結(jié)合至DNA時具有同二聚體。然而，類型III結(jié)合至同向重復(fù)而不是反向重復(fù)HRE。類型IV類型IV核受體將作為單體或者二聚體兩者結(jié)合。然而，僅核受體的一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至一個半位點HRE。類型IV受體的實例在大多數(shù)NR亞家族中存在。激動和拮抗取決于所涉及到的受體、配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和被影響的組織，核受體配體表現(xiàn)出從激動至拮抗和反向激動的廣泛的多種影響。激動劑配體與其相應(yīng)核受體的結(jié)合將導(dǎo)致基因表達的上調(diào)。這種配體刺激的基因表達被稱為激動劑響應(yīng)。內(nèi)源激素配體的激動作用還可以被某些合成的配體例如糖皮質(zhì)激素受體抗炎癥藥物地塞米松模擬。激動劑配體通過誘導(dǎo)受體的利于共激活劑結(jié)合的構(gòu)象而工作。 共激活劑在結(jié)合至DNA時被核受體募集，并且用于活化轉(zhuǎn)錄。共激活劑常常具有固有的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性，其減弱組蛋白與DNA的結(jié)合，并且由此促進基因轉(zhuǎn)錄。拮抗劑一些合成的核受體配體在內(nèi)源配體缺乏時對基因轉(zhuǎn)錄不具有影響。然而，它們可通過競爭性結(jié)合核受體的同一部位而阻斷激動劑配體的作用。此類配體稱作拮抗劑。拮抗劑通常用作藥物，例如拮抗性核受體藥物是結(jié)合糖皮質(zhì)激素和孕酮受體的米非司酮，由此分別阻止了內(nèi)源激素皮質(zhì)醇和孕酮的活性。拮抗劑配體通過誘導(dǎo)受體的阻止共激活劑結(jié)合和促進輔阻遏物結(jié)合的構(gòu)象起作用。輔阻遏物常常通過募集組蛋白去乙?；?HDAC)而起作用，這加強了組蛋白與DNA的結(jié)合并且因此抑制基因轉(zhuǎn)錄。反向激動劑一些核受體是組成型活化的，在激動劑缺乏時刺激DNA轉(zhuǎn)錄。該組成型活性可被稱作反向激動劑的合成的配體抑制。選擇性受體調(diào)節(jié)劑指向核受體的一些藥物化合物在一些組織內(nèi)表現(xiàn)出激動劑反應(yīng)并且在另外的組織內(nèi)表現(xiàn)出拮抗反應(yīng)。該行為使得可以在一種組織內(nèi)保留預(yù)期有益治療作用，而在另外的組織內(nèi)使藥物的不良副作用最小化。具有該種混合的激動劑/拮抗劑行為的藥物被稱為選擇性受體調(diào)節(jié)劑(SRM)。實例包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)和選擇性孕酮受體調(diào)節(jié)劑(SPRM)。SRM的作用機制取決于所涉及到的配體和受體的化學(xué)結(jié)構(gòu)而變化。然而，通常認為，許多SRM通過促進受體的激動和拮抗間接近平衡的構(gòu)象而起作用。在共激活劑蛋白質(zhì)濃度高于輔阻遏物的組織中，平衡狀態(tài)移向激動劑方向，并且相反在輔阻遏物占優(yōu)勢的組織內(nèi)，配體作為拮抗劑起作用。家族成員下面是根據(jù)序列同源性歸類的48個已知的人核受體列表。核受體組織為亞家族名稱 組名稱(如果整個組共有，為內(nèi)源配體)〇成員名稱(縮寫；NRNC符號，基因)(內(nèi)源配體)亞家族1 甲狀腺激素受體-樣 組A 甲狀腺激素受體(甲狀腺激素)〇1 甲狀腺激素受體-a (TRa ；NRlAl, THRA)〇2 甲狀腺激素受體- β (TR β ；NR1A2, THRB) 組B 視黃酸受體(維生素A和相關(guān)化合物)〇 1 視黃酸受體-a (RARa ；NRlBl，RARA)〇 2 視黃酸受體-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)〇3 視黃酸受體-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)
組C 過氧化物酶體增殖物激活受體〇1 過氧化物酶體增殖物激活受體-a (PPARa ；NRlCl, PPARA)〇2 過氧化物酶體增殖物激活受體-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)〇3 過氧化物酶體增殖物激活受體-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG) 組 D:Rev_ErbA〇 1 =Rev-ErbAa (Rev-ErbA α ；NR1D1)〇 2 =Rev-ErbA^ (Rev-ErbA β ；NR1D2) 組F =RAR-相關(guān)孤兒受體〇 1 :RAR_ 相關(guān)孤兒受體-a (RORa ；NRlFl, R0RA)〇 2 =RAR-相關(guān)孤兒受體- β (R0R β ；NR1F2, R0RB)〇3 =RAR-相關(guān)孤兒受體-Y (R0R γ ；NR1F3, R0RC) 組H:肝X受體-樣〇 3 肝 X 受體-a (LXR α ；NR1H3)〇 2 肝 X 受體-β (L)(R3 ;NR1H2)〇 4 法尼醇 X 受體(F)CR ；NR1H4) 組I:維生素D受體-樣〇1 維生素D受體(VDR ；NRlIl，VDR)(維生素D)〇 2 孕烷 X 受體(PXR ；NRl 12)〇3 組成型雄烷受體(CAR ；NRl 13)亞家族2 類視黃醇X受體-樣 組A 肝細胞核因子_4(HNF4)〇 1 肝細胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)〇2 肝細胞核因子-4- y (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G) 組B 類視黃醇X受體(RXR a )〇 1 類視黃醇 X 受體-a (RXR α ；NR2B1，RXRA)〇 2 類視黃醇 X 受體- β (RXR β ；NR2B2, RXRB)〇3 類視黃醇 X 受體-Y (RXR Y ；NR2B3, RXRG) 組C:睪丸受體〇 1 睪丸受體 2(TR2 ；NR2C1)〇 2 睪丸受體 4 (TR4 ；NR2C2)參組 E:TLX/PNR〇1 果蠅tailless基因的人同系物(TLX ；NR2E1)〇3 感光細胞-特異核受體(PNR ；NR2E3) 組 F:C0UP/EAR〇1 雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)〇2 雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)〇 6 :V-erbA-相關(guān)(EAR-2 ；NR2F6)亞家族3 雌激素受體-樣 組A 雌激素受體(性激素雌激素)
〇 1 雌激素受體-a (ERa ；NR3A1, ESR1)〇 2 雌激素受體-β (ERβ ；NR3A2, ESR2) 組B:雌激素相關(guān)受體〇 1 雌激素相關(guān)受體-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)〇2 雌激素相關(guān)受體- β (ERR^ ；NR3B2, ESRRB)〇3 雌激素相關(guān)受體-Y (ERR γ ；NR3B3, ESRRG) 組C :3-酮類固醇受體〇1 糖皮質(zhì)激素受體(GR ；NR3C1)(皮質(zhì)醇)〇2 鹽皮質(zhì)激素受體(MR ；NR3C2)(醛固酮)〇3 孕酮受體(PR ；NR3C3, PGR)(性激素孕酮)〇4 雄激素受體(AR ；NR3C4, AR)(性激素睪酮)亞家族4 神經(jīng)生長因子IB-樣 組 A :NGFIB/NURR1/N0R1〇 1 神經(jīng)生長因子 IB(NGFIB ；NR4A1)〇 2 核受體相關(guān) 1 (NURR1 ；NR4A2)〇3 神經(jīng)元衍生的孤兒受體1 (N0R1 ；NR4A3)亞家族5 類固醇生成因子-樣 組 A:SF1/LRH1〇1 類固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)〇2 肝受體同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)亞家族6 生精細胞核因子-樣 組 A:GCNF〇1 精細胞核因子(GCNF ；NR6A1)亞家族0:混雜的 組 B:DAX/SHP〇1 =DAXl,劑量敏感性性反轉(zhuǎn)，腎上腺發(fā)育不全關(guān)鍵區(qū)，在X染色體上，基因 1(NROBl)〇2 小異二聚體伴侶(SHP ；NR0B2) 組C 具有兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體QDBD-NR)(新的亞家族)本發(fā)明提供用于檢測所選擇核受體活性的轉(zhuǎn)基因動物，和從其衍生的細胞，以及檢測特異核受體活化或活性的方法。具體而言，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，其包含至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和/或任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明的核受體是任何哺乳動物或非哺乳動物核受體，包括任何上面所列核受體。在本發(fā)明的一個實施方案中，核受體選自甲狀腺激素受體-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲狀腺激素受體-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、視黃酸受體-a (RARa ；NR1B1, RARA)、 視黃酸受體-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、視黃酸受體-γ (RARy ；NR1B3, RARG)、過氧化物酶體增殖物激活受體-a (PPARa ； NR1C1, PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、過氧化物酶體增殖物激活受體_ Y (PPAR γ ；NR1C3,PPARG)、Rev-ErbA α (Rev-ErbA α ；NR1D1)、Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相關(guān)孤兒受體-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相關(guān)孤兒受體-β (ROR^ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受體-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受體-β (LXR β ；NR1H2)、法尼醇 X 受體(FXR ；NR1H4)、維生素D受體(VDR;NR1I1，VDR)(維生素D)、孕烷X受體(P)CR ;NR1I2)、組成型雄烷受體 (〇八1 ;殿113)、肝細胞核因子-4-0 (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝細胞核因子-4-γ (HNF4 γ ； NR2A2, HNF4G)、類視黃醇 X 受體-a (RXRa ； NR2B1, RXRA)、類視黃醇 X 受體-β (RXR3 ； NR2B2, RXRB)、類視黃醇 X 受體-Y (RXR γ ；NR2B3, RXRG)、睪丸受體 2 (TR2 ；NR2C1)、睪丸受體4 (TR4 ；殿2以)、果蠅tai 11 ess基因的人同系物(TLX ；NR2E1)、感光細胞-特異核受體(PNR ；NR2E3)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子 II (C0UP-TFII ； NR2F2)、6 :V_erbA-相關(guān)(EAR-2 ； NR2F6)、 雌激素受體-a (ERa ；NR3A1, ESR1)、雌激素受體-β (ER^ ；NR3A2, ESR2)、雌激素相關(guān)受體-a (ERRa ；NR3B1, ESRRA)、雌激素相關(guān)受體-β (ERRβ ；NR3B2, ESRRB)、雌激素相關(guān)受體-Y (ERRy ；NR3B3, ESRRG)、糖皮質(zhì)激素受體(GR ;NR3C1)(皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR;NR3C2)(醛固酮)、孕酮受體(PR ；NR3C3, PGR)(性激素孕酮)、雄激素受體 (AR ；NR3C4, AR)(性激素睪酮)、神經(jīng)生長因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受體相關(guān)1 (NURR1 ； NR4A2)、神經(jīng)元衍生的孤兒受體1 (N0R1 ；NR4A3)、類固醇生成因子1 (SFl ；NR5A1)、肝受體同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、精細胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (劑量敏感性性反轉(zhuǎn)，腎上腺發(fā)育不全關(guān)鍵區(qū)，在X染色體上，基因l(NROBl))、小異二聚體伴侶(SHP;NR0B2)和/或具有 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體QDBD-殿)。上面指定的每一核受體旨在是個別的實例。因此，根據(jù)本發(fā)明對它們當中每一個活化的檢測可各自要求專利保護。在一個優(yōu)選的實施方案中，核受體選自維生素D受體、肝X受體、視黃酸受體、類視黃醇X受體、混雜孕烷X受體和/或過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)，包括PPAR a、 PPAR β / δ、PPAR γ。在一個優(yōu)選的實施方案中，核受體選自過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR)。在特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是PPARii/δ。在另一特別優(yōu)選的實施方案中， 核受體是PPARa.在另一特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是PPAR β。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是PPAR Y。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是PPAR δ。PPARS是人表皮中表達的主要的PPAR亞型。在另一優(yōu)選的實施方案中，核受體是孕烷X受體(PXR)。 P)(R是為數(shù)眾多的異生素的可能的靶標。在另一優(yōu)選的實施方案中，核受體選自視黃酸受體(RARs)。視黃酸受體是經(jīng)驗證的皮膚靶標和皮膚穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)者。在特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是視黃酸受體-a (RARa)0在另一特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是視黃酸受體-β (RAR^)0在甚至進一步特別優(yōu)選的實施方案中，核受體是視黃酸受體-Y (RARy)0 在進一步優(yōu)選的實施方案中，核受體是維生素D受體。維生素D受體是銀屑病治療中的已知藥物靶標。本文所提到的任何一個核受體的任何部分或功能同系物也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，核受體或其部分是核受體或其部分的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 例如上面所列。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核包含至少一種編碼融合多肽的核酸序列，其中融合多肽含有偶聯(lián)至酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PPAR δ或其部分，和/或至少一種編碼β -半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。報告系統(tǒng)本發(fā)明涉及在其基因組中包含傳感器組件和/或報告器組件的非人轉(zhuǎn)基因動物， 優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核。通常，報告器組件包含至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點，和/或任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。因此，本發(fā)明包含一種編碼報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的核酸序列。報告系統(tǒng)包含盒，所述盒包含編碼報告多肽的核酸序列。報告系統(tǒng)將包含于如本文其它地方所述的載體中。如本文所使用的術(shù)語“報告基因”指其轉(zhuǎn)錄活化可以被檢測的任何基因。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法、動物和細胞包含報告多肽或其含有可檢測產(chǎn)物的片段。轉(zhuǎn)錄活化的檢測在本文別處描述，然而；通常報告多肽或其片段包含視覺可檢測的、光學(xué)可檢測的或放射自顯影可檢測的產(chǎn)物。動物，優(yōu)選豬，以及卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核包含編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到存在許多用于檢測的報告基因和系統(tǒng)。例如編碼本發(fā)明報告多肽的報告基因或核酸選自半乳糖苷酶、HcRecUDsRecUDsRed 單體、hGreen、AmCyan、ZsYellow、螢火蟲螢光素酶、lac Z、 海腎螢光素酶、SEAP、增強綠色熒光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增強藍色熒光蛋白(eBFP)、增強黃色熒光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增強青色熒光蛋白(eCFP)、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白、人α "I"抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修飾物和/或功能變體。應(yīng)當理解，任何的β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed 單體、ZsGreen, AmCyan, ^^ellow、螢火蟲螢光素酶、lac Z、海腎螢光素酶、SEAP、增強綠色熒光蛋白(eGFP)、 d2EGFP、增強藍色熒光蛋白(eBFP)、增強黃色熒光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增強青色熒光蛋白(eCFP)、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白、人α-l-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修飾物或功能變體將各自用于它們單獨的實施方案中。在優(yōu)選的實施方案中，編碼報告多肽的報告基因或核酸是半乳糖苷酶，或其變體或功能同系物。在另一優(yōu)選的實施方案中，報告基因是eGFP，或其變體或功能同系物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，編碼報告多肽的報告基因或核酸是半乳糖苷酶基因，或其功能同系物或部分。該酶由大腸桿菌Iac操縱子中的IacZ基因編碼，并將乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖苷酶也在人消化道中產(chǎn)生。半乳糖苷酶作為報告基因的使用使得可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法簡單地進行酶學(xué)檢測。根據(jù)本發(fā)明的檢測和分析方法描述于本文別處。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，報告基因是熒光蛋白。在特別優(yōu)選的實施方案中，報告基因是綠色熒光蛋白，或者其衍生物或功能同系物，包括增強綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白。編碼熒光肽的報告基因的使用使得可以通過共聚焦和多光子熒光顯微鏡進行直接熒光檢測。包含編碼報告多肽的核酸序列的盒可進一步包含啟動子元件。在一個實施方案中，編碼報告多肽的核酸序列之前是啟動子。在特定實施方案中，盒包含驅(qū)動報告基因表達的啟動子。在一個實施方案中，啟動子是異源性啟動子。在另一實施方案中，啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。在特定實施方案中，啟動子是胸苷激酶啟動子，或其片段或功能同系物。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子元件是胸苷激酶啟動子。包含編碼報告多肽的核酸序列的盒還進一步包含至少一個增強子和/或調(diào)節(jié)元件。增強子元件是促進基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)性DNA序列。增強子將通過提高同一 DNA分子上最近啟動子的活性來提高基因轉(zhuǎn)錄速率。增強子不需要特別地接近于其所作用的基因，但是增強子主要位于與其所作用的基因同一核酸序列上，雖然會出現(xiàn)例外。在一個實施方案中，編碼報告多肽的核酸序列之前是增強子。在特定實施方案中， 盒包含至少一個促進報告基因表達的增強子元件。在一個實施方案中，至少一個增強子元件是異源性增強子。在特定實施方案中，增強子元件選自酵母UASgal增強子和/或細菌LexA 結(jié)合位點。在優(yōu)選的實施方案中，增強子元件是酵母UASgal增強子，或其片段或功能同系物。 在另一優(yōu)選的實施方案中，增強子元件是細菌LexA結(jié)合位點，或其片段或功能同系物。增強子/啟動子是酵母UASgal增強子或細菌LexA結(jié)合位點與胸苷激酶啟動子的優(yōu)選常規(guī)組合。在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核、用途和方法的優(yōu)選實施方案中，編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列還包含至少一種酵母上游活化序列(UASgal)，細菌LexA結(jié)合位點和/或其部分。 此外，編碼可檢測報告轉(zhuǎn)錄物或多肽的核酸序列從異源性和/或可誘導(dǎo)啟動子表達，例如上面所定義。分析和檢測本發(fā)明提供用于評價試劑或化合物在動物組織內(nèi)影響的方法，其中在施用所述試劑步驟之前和之后表達產(chǎn)物的改變表明對所述組織有影響。如果表達產(chǎn)物的量增加或降低至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、 至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500%、至少550%、至少600%、至少750%、至少800%、至少850%、至少 900%、至少950%、至少1000%、至少1100%、至少1200%、至少1300%、至少1400%、至少 1500%、至少 1600%、至少 1700%、至少 1800%、至少 1900%、至少 2000%、至少 2500%、至少 3000 %、至少；3500 %、至少 4000 %、至少 4000 %、至少 4500 %、至少 5000 %、至少 5500 %、 至少6000%、至少6500%、至少6500 %、至少7000 %、至少7500 %、至少8000%、至少 8500 %、至少9000 %、至少10000 %、至少15000 %、或至少20000 %，則視為試劑或化合物對組織具有影響。在本文中使用術(shù)語“評價”來包括檢測本發(fā)明報告基因活化。檢測可以通過測量轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的水平實現(xiàn)，即表達產(chǎn)物包括RNA和/或多肽。通常，本發(fā)明動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核的報告轉(zhuǎn)錄物、多肽或其片段包括視覺可檢測的、光學(xué)可檢測的或放射自顯影可檢測的產(chǎn)物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法、動物、胚胎、胚泡和/或細胞包含報告多肽或其含有可檢測產(chǎn)物的片段。報告多肽或其片段或功能同系物包含視覺可檢測的、光學(xué)可檢測的和 /或放射自顯影可檢測的產(chǎn)物。然而，檢測可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)開展，包括酶學(xué)和分光光度測定、共聚焦和多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、 引物延伸和/或DNA陣列技術(shù)。此外，可以采用基于特異PCR的技術(shù)例如RT-PCR、q_PCR以及熒光顯微鏡和免疫組織化學(xué)。當使用半乳糖苷酶作為本發(fā)明的報告基因時，表達產(chǎn)物可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶學(xué)方法檢測。存在用于快速方便檢測和定量半乳糖苷酶活性的數(shù)個方法和商業(yè)試劑盒。在一個實施方案中，半乳糖苷酶活性通過提供底物如 X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)測量。Χ-gal是β-半乳糖苷酶的惰性生色底物。β -半乳糖苷酶將X-Gal水解成無色的半乳糖和形成強藍色沉淀物的 4-氯-3-溴-靛藍，其可以通過光學(xué)和/或顯微鏡方法檢測。然而，半乳糖苷酶表達還可以通過抗β -半乳糖苷酶抗體使用免疫測定，如ELISA、western印跡和原位雜交檢測。評價可在從動物取出的樣品上開展。在一個實施方案中，評價在選自乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和汗液的組織上開展。在優(yōu)選的實施方案中，樣品選自皮膚組織，包括表皮和真皮組織、乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、 骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和汗液。在另一實施方案中，樣品選自乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、泌尿生殖組織、干細胞包括癌干細胞，和體液例如痰、尿、血液和汗液。在另一優(yōu)選的實施方案中，組織選自皮膚、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤。在甚至另一實施方案中，樣品選自乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織和肺組織。在又一實施方案中，樣品選自干細胞和癌干細胞。在甚至另外的實施方案中，樣品選自體液、痰、尿、血液和汗液。在甚至進一步的實施方案中，樣品選自卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織和泌尿生殖組織。在尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是皮膚組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是表皮組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是真皮組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是血液組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是肺組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是皮膚組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是前列腺組織。在另一尤其優(yōu)選的實施方案中，樣品是卵巢組織。在與本發(fā)明試劑或化合物有關(guān)的分析中，在一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的評價在活動物中開展。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的評價在無需從活動物中取出組織的情況下開展。然而，在另一實施方案中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的評價在從動物取出的樣品上開展。樣品可以衍生自如本文別處所定義的任何組織。例如，樣品選自皮膚組織包括表皮和真皮組織、乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、 腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和/或汗液。本發(fā)明方法可包括一個或一個以上評價步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明方法還包括至少一個額外的評價步驟。評價可發(fā)生1次或更多次，例如評價步驟通過至少1、2、3、4、5、10、20、30、60、180、365 或 700 天分開。載體本發(fā)明的傳感器系統(tǒng)和報告系統(tǒng)將包含于一個或一個以上重組DNA載體中。載體可以是任何載體，包括任何商業(yè)可獲得的載體和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另外的載體。因此， 載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、穿梭載體或者哺乳動物表達載體。在一個實施方案中，載體是基于轉(zhuǎn)座子的載體，例如基于睡美人DNA轉(zhuǎn)座子的載體。在另一實施方案中，載體是基于重組酶的載體，例如特別是FLP-FRT重組酶載體。施用可以通過本發(fā)明方法或用途評價的物理或化學(xué)試劑和/或化合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜施用方法施用。在一個實施方案中，施用包括經(jīng)口包括頰和舌下、直腸、鼻、局部、肺、陰道或腸胃外包括肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用或通過吸入或吹入施用。在優(yōu)選的實施方案中，試劑通過局部施用而施用。在另一實施方案中，所述施用是肺施用。在一些情況中，本發(fā)明方法包括向組織重復(fù)施用試劑和/或化合物。因此，試劑和 /或化合物可以經(jīng)多次循環(huán)施用，例如至少2、例如至少3、例如至少4、例如至少5、例如至少6、例如至少7、例如至少8、例如至少9例如至少10、例如至少20、例如至少30、例如至少 40、例如至少50、例如至少60、例如至少70、例如至少80、例如至少90例如至少100次循環(huán)施用。多個施用循環(huán)分開至少1小時、例如至少2小時、例如至少3小時、例如至少4小時、例如至少5小時、例如至少6小時、例如至少7小時、例如至少8小時、例如至少9小時、 例如至少10小時、例如至少11小時、例如至少12小時、例如至少13小時、例如至少14小時、例如至少16小時、例如至少18小時、例如至少20小時、例如至少22小時、例如至少24 小時。在另一實施方案中，施用循環(huán)分開至少1天、例如至少2天、例如至少3天、例如至少 4天、例如至少5天、例如至少6天、例如至少7天、例如至少8天、例如至少9天、例如至少 10天、例如至少12天、例如至少14天、例如至少16天、例如至少18天、例如至少20天、例如至少30天、例如至少40天、例如至少50天、例如至少100天。動物在一個方面中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物，包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物選自豬、迷你豬、微型豬、小鼠、大鼠、非人靈長類和嚙齒類動物。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選是豬。本發(fā)明還涉及評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及用于評價試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性影響的方法，所述方法包括a.提供非人轉(zhuǎn)基因動物，包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用試劑，和c.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達指示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于檢測化合物改變試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性的影響的能力的方法，包括a.提供非人轉(zhuǎn)基因動物，包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和 /或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，c.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和d.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達指示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。在本發(fā)明方法中，編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列的表達在所述試劑和/或化合物存在和缺乏下檢測。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，在所述試劑存在下與所述試劑缺乏下相比a.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達升高指示所述試劑對所述核受體的活性具有刺激性影響，b.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達降低指示所述試劑對所述核受體的活性具有抑制性影響，和c.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達未改變指示所述試劑對所述核受體的活性不具有或者具有很小的影響。類似地，在本發(fā)明方法的另外的優(yōu)選實施方案中，所述化合物存在下與所述化合物缺乏下相比a.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響升高表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響具有刺激性影響，b.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響降低表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響具有抑制性影響，和c.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響很小或未改變表明所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響不具有或者具有很小的影響。在一個實施方案中，所述動物是人、非人靈長類動物、豬、迷你豬、微型豬、小鼠、大鼠和嚙齒類動物。在特定實施方案中，所述動物是人。根據(jù)本發(fā)明，試劑在動物組織內(nèi)，包括人組織內(nèi)的影響通過提供轉(zhuǎn)基因動物評價，所述轉(zhuǎn)基因動物包含至少一種核酸序列，其中所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或另外的核酸序列編碼融合多肽， 融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。向轉(zhuǎn)基因動物施用試劑并且評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物。施用試劑之前和之后的表達產(chǎn)物的改變表明對所述組織有影響。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物是在其基因組中包含外來基因的非人動物。外來基因可以包含于種系組織中，并且因此可以傳給后代。外源性基因可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)轉(zhuǎn)移至動物的基因組。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物選自非人靈長類動物、豬、迷你豬、微型豬、小鼠、大鼠和嚙齒類動物。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物是豬(野豬(sus scrofus))0在另一優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物是小鼠(mus musculus)。轉(zhuǎn)基因動物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法得到。此類技術(shù)的實例包括向單一細胞胚胎的微管注射、使用Cre/lox或Flp/FRT系統(tǒng)的重組技術(shù)、和使用脂質(zhì)體或電穿孔的轉(zhuǎn)染。修飾的遺傳物質(zhì)還可以通過轉(zhuǎn)座提供(例如通過使用睡美人轉(zhuǎn)座子)。此外， 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如基于逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的載體)適宜產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。在優(yōu)選的實施方案中，用于轉(zhuǎn)移的胚泡通過體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)完成，如本文別處所述。在一個方面中，本發(fā)明涉及包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)基因動物適宜評價試劑對組織的影響和/或適宜測試化合物改變試劑在該動物的組織內(nèi)影響的能力。在一個實施方案中，動物選自豬、小鼠、大鼠、嚙齒類動物、狗、猴、豚鼠、 迷你豬和/或微型豬。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物是豬。在另一實施方案中，動物是小鼠。轉(zhuǎn)基因動物的報告多肽可以選自本文所述的任何報告多肽。在一個實例中，轉(zhuǎn)基因動物的報告多肽選自β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed單體、ZsGreen, AmCyan, llow、螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、SEAP、EGFP、EBFP、EYFP、d2EGFP和GFPuv、青色、 綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白和/或其片段、修飾物和/或功能變體。在優(yōu)選的實施方案中，報告多肽是半乳糖苷酶或其片段或功能變體。而且，轉(zhuǎn)基因動物的核受體可以選自本文別處定義的那些的任何核受體。在一個實施方案中，核受體選自維生素D受體、肝X受體、混雜孕烷X受體和/或PPAR，和/或其片段，特別是配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)基因動物的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地選自GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，然而，可選擇任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于此目的。在特定實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因豬，包含至少一種核酸序列，其中a.所述至少一種核酸序列編碼半乳糖苷酶或其部分，和/或b.另外的核酸序列編碼融合多肽，包含偶聯(lián)至酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PPAR δ或其部分，或者所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因豬可以用于體內(nèi)測定因內(nèi)源激動劑產(chǎn)生所引起的核受體活化。在一個實例中，激動劑在正常皮膚發(fā)育過程中產(chǎn)生，然而，在另一實施方案中，內(nèi)源激動劑在疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生，如銀屑病、不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病。在優(yōu)選的實施方案中，疾病是銀屑病。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因豬適宜測定試劑在組織內(nèi)的原位穿透和/或核受體被試劑，例如本文別處所定義試劑的活化。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及從本文所定義轉(zhuǎn)基因動物衍生的細胞系。術(shù)語衍生的意思是指細胞系起源于從本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物而來的細胞。還可以在從轉(zhuǎn)基因動物分離后對細胞進一步修飾以開發(fā)修飾的轉(zhuǎn)基因細胞系。在一個方面中，本發(fā)明涉及從本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人動物衍生的轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，和/或轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，其中轉(zhuǎn)基因基因組包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列， 其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。本發(fā)明還在一個方面中涉及本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因豬的產(chǎn)生，以及產(chǎn)生本發(fā)明卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核的方法。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因非人動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核的方法，包括步驟i.提供供體細胞，ii.通過插入下列對i)的供體細胞進行基因修飾a.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和b.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/ 或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點和/或c.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，iii.將在ii)中得到的供體細胞的修飾的基因組轉(zhuǎn)移進入宿主細胞，iv.得到形成胚胎的重構(gòu)胚胎v.培養(yǎng)所述胚胎；和vi.轉(zhuǎn)移所述培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物使得胚胎發(fā)育成基因修飾的胎兒，其中所述基因修飾的胚胎通過包括步驟i)至V)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中所述基因修飾的胚泡通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中所述基因修飾的胎兒通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。對于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因豬的產(chǎn)生，根據(jù)本發(fā)明在細胞核轉(zhuǎn)移方法中所涉及到的供體(體細胞或體細胞的細胞核)和受體(細胞質(zhì))是非人哺乳動物。同樣，根據(jù)本發(fā)明，重構(gòu)胚胎可以植入的動物是非人哺乳動物，優(yōu)選。哺乳動物可以是選自馴養(yǎng)的或野生的典型的?？?、羊科、鹿科、豬科、馬科和駱駝科的有蹄動物。在特別的實施方案中，哺乳動物是母?；蚬?、野牛、水牛、綿羊、大角綿羊、馬、矮馬、驢、騾、鹿、麋鹿、馴鹿，山羊、水牛、 駱駝、馱馬、羊駝或豬。在本發(fā)明的特別的實施方案中，哺乳動物是豬。在一個實施方案中， 豬是野豬。在另一實施方案中，豬是馴養(yǎng)豬野豬(Sus scrofa)或家豬(S. domesticus)。在再一實施方案中，本發(fā)明涉及迷你豬，但是還涉及近親繁殖的豬。在特定實施方案中，豬可選自蘭德瑞斯豬、約克夏豬、漢普夏豬、杜洛克豬、中國眉山豬、巴克夏豬和皮特蘭豬。在再一實施方案中，本發(fā)明涉及由蘭德瑞斯豬、約克夏豬、漢普夏豬和杜洛克豬組成的組。然而， 本發(fā)明還涉及由蘭德瑞斯豬、杜洛克豬和中國眉山豬的組。類似地，由巴克夏豬、皮特蘭豬、 蘭德瑞斯豬和中國眉山豬組成的組可以是本發(fā)明的對象。并且由蘭德瑞斯豬和中國眉山豬組成的組也是本發(fā)明的對象。在特別的實施方案中，豬是蘭德瑞斯豬或約克夏豬。在特別的實施方案中，本發(fā)明不但涉及繁殖的漢普夏豬，還涉及杜洛克豬。在再一優(yōu)選的實施方案， 豬是繁殖的中國眉山豬。然而，本發(fā)明還涵蓋巴克夏豬，并且在特別的實施方案中，本發(fā)明涵蓋皮特蘭豬。本發(fā)明的另一實施方案涉及選自Goettingen、Yucatan、Bama Xiang Zhu, ffuzhishan.Xi Shuang Banna的迷你豬。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及由Goettingen、 Yucatan 組成的組。備選地，本發(fā)明涉及由 Bama XiangZhu、Wuzhishan、Xi Shuang Banna 組成的組。具體而言，本發(fā)明涉及Goettingen。但是Yucatan也與本發(fā)明有關(guān)。類似地， Bama Xiang Zhu涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)，但是mizhishan，尤其是Xi Shuang Banna也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的供體哺乳動物可以是雌性的或者雄性的。哺乳動物的年齡可以是任何年齡，例如成體，或者例如胎兒。轉(zhuǎn)基因豬和豬的克隆根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因豬包含至少一種核酸序列，其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在一個實施方案中，包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因豬其中i)所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii)另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，即將包含至少一種核酸序列，是通過將包含編碼報告多肽或其部分的所述至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因豬與包含編碼融合多肽(融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物)的至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因豬雜交獲得。因此，本發(fā)明還涉及包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因豬，其中所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因豬，其中所述至少一種核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分， 或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。通過使用當今技術(shù)水平的豬克隆和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，可以將報告基因系統(tǒng)和/或傳感器系統(tǒng)，例如i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列， 和ii.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列整合在一起，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點，和/或進入豬成纖維細胞的細胞核內(nèi)，其隨后用于向卵胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因豬通過從遺傳工程改造的成纖維細胞體細胞轉(zhuǎn)移到卵胞質(zhì)克隆產(chǎn)生。由此，本文別處描述的基因報告系統(tǒng)和/或傳感器系統(tǒng)被整合在基因組中以分別得到轉(zhuǎn)基因報告豬和/或傳感器豬。具體而言，體細胞核轉(zhuǎn)移通過手工克隆，例如由Gabor Vajta所描述的手工克隆(trends in biotechnology，2007)開展。包含本發(fā)明核受體傳感器系統(tǒng)的豬品種可以用于體內(nèi)測定因內(nèi)源激動劑產(chǎn)生所引起的核受體活化。在一個實施方案中，內(nèi)源激動劑在皮膚的正常發(fā)育過程中產(chǎn)生。在另一實施方案中，內(nèi)源激動劑在疾病狀態(tài)發(fā)展過程中產(chǎn)生。在特定實施方案中，所述疾病是銀屑病、不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病。在一個實施方案中，所述疾病是任何皮膚疾病。在另一實施方案中，所述疾病是任何癌癥疾病。在優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是銀屑病。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是皮膚癌癥。
在本發(fā)明的另一個方面中，包含本發(fā)明核受體傳感器系統(tǒng)的豬品種可以用于研究組織的原位穿透和核受體被試劑，包括異生素的活化。在特定實施方案中，轉(zhuǎn)基因豬品種包含整合在基因組中并在特異組織中表達的 GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PXR、視黃酸受體、維生素D受體或任何PPAR 的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合物。在優(yōu)選的實施方案中，該組織是皮膚、表皮、真皮、皮下組織或表皮基細胞。在另一特別的實施方案中，角蛋白14增強子/啟動子被整合在編碼融合多肽的基因的上游以驅(qū)動皮膚的特異表達。在另外的實施方案中，轉(zhuǎn)基因豬包含至少一種核酸序列，其中所述至少一種核酸序列編碼包含偶聯(lián)至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的孕烷X受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在另一實施方案中，轉(zhuǎn)基因豬包含至少一種核酸序列，其中所述至少一種核酸序列編碼包含偶聯(lián)至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的視黃酸受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在又一實施方案中，轉(zhuǎn)基因豬包含至少一種核酸序列，其中所述至少一種核酸序列編碼偶聯(lián)至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的維生素D受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。在另外的實施方案中，轉(zhuǎn)基因豬包含至少一種核酸序列，其中所述至少一種核酸序列編碼偶聯(lián)至GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何PPAR，包括PPAR δ配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的融合多肽，或者所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。體細胞核轉(zhuǎn)移在克隆中，將身體的(身體)細胞或體細胞的細胞核轉(zhuǎn)移進入其自身細胞核被去除(去核的或無核的)的卵細胞中稱作體細胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)。將從該重構(gòu)胚胎發(fā)育成新個體并且新個體與體細胞供體在遺傳學(xué)上相同。在本發(fā)明中，體細胞核轉(zhuǎn)移方法是細胞核轉(zhuǎn)移方法，包括步驟a)提供至少一個具有至少部分修飾透明帶的卵母細胞，b)將卵母細胞分成至少兩個部分，得到至少一個胞質(zhì)體，c)提供至少一個具有預(yù)期遺傳特性的供體細胞或細胞核，d)將至少一個胞質(zhì)體與供體細胞或膜包繞細胞核融合。然而，本發(fā)明還涉及細胞核轉(zhuǎn)移方法，包括步驟a)提供至少一個卵母細胞，b)將卵母細胞分成至少三部分，得到至少兩個胞質(zhì)體，c)提供至少一個具有預(yù)期遺傳特性的供體細胞或細胞核，d)將至少一個胞質(zhì)體與供體細胞或膜包繞細胞核融合。對于所列步驟的參數(shù)可以改變以便得到對于給定動物種類最有效的核轉(zhuǎn)移。多個參數(shù)在下面詳細描述。卵母細胞根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“卵母細胞”意思是指未成熟的雌性生殖細胞，它是一種沒有完成成熟過程以形成卵子(配子)的細胞。在本發(fā)明中，去核的卵母細胞是核轉(zhuǎn)移過程的受體細胞。根據(jù)本發(fā)明的卵母細胞從哺乳動物的輸卵管和/或卵巢分離。雖然卵母細胞可以從活動物的輸卵管和/或卵巢分離，但是正常情況下，卵母細胞從已故動物取回。在一個實施方案中，卵母細胞通過輸卵管恢復(fù)法或經(jīng)陰道恢復(fù)法分離。在優(yōu)選的實施方案中，卵母細胞通過吸出分離。卵母細胞有代表性地在去核之前在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種介質(zhì)中成熟。卵母細胞還可以從新近處死動物的卵巢分離，或者當卵巢已經(jīng)被冰凍和/或解凍時分離。優(yōu)選地，卵母細胞從輸卵管新鮮地分離。卵母細胞或胞質(zhì)體還可以在使用之前冷凍保存。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當認識到，新分離和成熟的卵母細胞是優(yōu)選的，但是也應(yīng)當認識到，可以在收獲之后或者在成熟之后冷凍保存卵母細胞。如果利用冷凍保存的卵母細胞，則必須在將卵母細胞置于成熟培養(yǎng)基中之前將它們最初解凍。解凍冷凍保存的材料以致于它們在解凍過程之后是具有活性的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。然而，通常，卵母細胞和胞質(zhì)體的冷凍保存是要求極高的過程，并且其在豬中特別困難，這是因為上述提到過豬卵母細胞和胞質(zhì)體通常脆弱， 并且因為高脂質(zhì)含量使得它們對低溫凍害極其敏感(即在降溫和升溫步驟過程中，在+15 和+5°C之間出現(xiàn)的傷害)。在另一實施方案中，已經(jīng)體內(nèi)成熟的成熟(中期II)卵母細胞將被收取并用于本文所述的核轉(zhuǎn)移方法中。實質(zhì)上，成熟中期II卵母細胞從非超排卵哺乳動物或者從發(fā)情開始或者注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或相似激素后35至48小時后的超排卵哺乳動物通過手術(shù)收集。在卵母細胞已經(jīng)體外培養(yǎng)情況下，體內(nèi)包繞卵母細胞的卵丘細胞將積累并去除以提供處于更適宜成熟階段的卵母細胞用于去核。卵丘細胞將在例如0. 1至5%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 2至5%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 5至5%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 2至3%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 5至3%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 5至2%范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 5 至范圍透明質(zhì)酸酶、例如0. 5%透明質(zhì)酸酶存在下通過移液或渦旋去除。優(yōu)選方法中的第一個步驟涉及從適宜動物分離受體卵母細胞。為此，卵母細胞可從任何動物來源得到并且處于任何成熟階段。已經(jīng)報導(dǎo)在去核和核轉(zhuǎn)移時卵母細胞的成熟階段對于核轉(zhuǎn)移方法的成功是至關(guān)重要的。來自哺乳動物卵巢的未成熟(前期I)卵母細胞常常通過吸出收集。為了采用技術(shù)如遺傳工程、核轉(zhuǎn)移和克隆，在卵母細胞將用作核轉(zhuǎn)移受體細胞之前，此種收集的卵母細胞優(yōu)選體外成熟。優(yōu)選地，成功的哺乳動物胚胎克隆使用中期II階段卵母細胞作為受體卵母細胞， 因為據(jù)信在該階段成熟的卵母細胞可被或被充分活化以將所引入細胞核看作是它似乎是一個受精的精子。然而，本發(fā)明涉及適宜開展體細胞核轉(zhuǎn)移的任何成熟階段的卵母細胞、可通過本發(fā)明體細胞核轉(zhuǎn)移方法得到的胚胎、胚泡和/或動物。卵母細胞的體外成熟通常在成熟介質(zhì)中發(fā)生直到卵母細胞已經(jīng)達到中期II階段或者已經(jīng)擠出第一極體。未成熟卵母細胞達到成熟的時間稱作成熟期。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，卵母細胞來自大母豬或者小母豬，優(yōu)選來自大母豬。胚胎根據(jù)本發(fā)明，重構(gòu)胚胎(即單細胞胚胎)包含供體細胞的遺傳物質(zhì)。隨后，重構(gòu)胚胎在開始有絲分裂后進行性地分裂成為多細胞胚胎。有絲分裂的體外起始有代表性地通過如本文所述的活化誘導(dǎo)。在本發(fā)明中，術(shù)語“胚胎”還指重構(gòu)胚胎，其是在通過活化誘導(dǎo)有絲分裂開始后的核轉(zhuǎn)移過程后形成的胚胎。重構(gòu)胚胎體外培養(yǎng)。當胚胎包含大約12-16個細胞時，稱作“桑椹胚”。隨后，胚胎進一步分裂并形成許多細胞，并在其中心具有充滿流體的囊腔，即囊胚腔。在該階段，胚胎被稱作“胚泡”。此時， 處于容易移植階段的發(fā)育階段的“受精的”卵母細胞從桑椹胚形成并由內(nèi)細胞團、內(nèi)腔和稱作滋養(yǎng)外胚層細胞的外層細胞構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的胚泡可以移植入宿主哺乳動物的子宮并持續(xù)生長成胎兒，然后生長成動物。在本文提供的用于產(chǎn)生基因修飾或轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物、用于克隆非人哺乳動物、用于培養(yǎng)重構(gòu)胚胎和/或用于冷凍保存豬胚胎的方法中，胚胎可以體外培養(yǎng)。胚胎可以例如以連續(xù)培養(yǎng)進行培養(yǎng)。應(yīng)當意識到，胚胎可以是正常胚胎或者重構(gòu)胚胎，如本文別處所定義。胞質(zhì)體已經(jīng)去除核的卵母細胞或卵母細胞部分。供體細胞本發(fā)明的術(shù)語“供體細胞”意思是指體細胞和/或從種系衍生的細胞。本發(fā)明的術(shù)語“體細胞”意思是指來自任何發(fā)育階段動物的任何“身體”細胞。例如體細胞可以源于胎兒或成體組織。特別優(yōu)選的體細胞是胎兒起源的體細胞。然而，來自種系的細胞也可以使用。根據(jù)本發(fā)明，供體細胞是體細胞。在本發(fā)明的另一實施方案中，供體細胞是從生殖細胞系衍生的細胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，供體細胞具有預(yù)期特性。然而，供體細胞可具有通過如本文別處所述遺傳操作獲得的預(yù)期特性。體細胞選自上皮細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞、角質(zhì)形成細胞、造血細胞、黑素細胞、 軟骨細胞、淋巴細胞(B和T淋巴細胞)、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、單核細胞、成纖維細胞、心肌細胞和其它肌肉細胞。這些細胞可以從不同器官得到，例如皮膚、肺、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、 膀胱、腎、尿道和其它泌尿器官。可從中獲取體細胞的動物在本文別處描述。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是使用來源于與作為受體卵母細胞(胞質(zhì)體)同一物種的體細胞。優(yōu)選地，體細胞是可以從發(fā)育中的胎兒和成體動物兩者大量獲得的成纖維細胞。 此外，成纖維細胞可以容易地體外繁殖。最優(yōu)選地，體細胞是胎兒來源的體外培養(yǎng)的成纖維細胞。在優(yōu)選的實施方案中，體細胞是基因修飾的。在本發(fā)明的仍然進一步的優(yōu)選的實施方案中，體細胞是豬細胞，并且優(yōu)選胎兒來源，或者如來自成體。轉(zhuǎn)基因細胞系本發(fā)明還涉及本文所述任何轉(zhuǎn)基因動物來源的細胞系。因此，本發(fā)明的細胞系包含至少一種核酸序列，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或 ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。特別的報告多肽、核受體、融合多肽、啟動子等實例在本文別處提供。組織本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，以及用于評價物理和/或化學(xué)劑在組織中對組織核受體影響的方法和用途。本發(fā)明可以在多種組織上實施。在一個實施方案中，組織選自皮膚、肌肉、肝、肺、腫瘤和角膜。在另一實施方案中，組織選自皮膚、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法涉及皮膚組織，即所述組織是皮膚。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法涉及表皮組織，即所述組織是表皮。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法涉及真皮組織，即所述組織是真皮。本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)可以在多種組織中表達。根據(jù)本發(fā)明用于檢測核受體活化的優(yōu)選組織是皮膚。皮膚包含兩個主要層，即表皮和真皮，其位于下皮(皮下的組織)上面，包含成纖維細胞、脂肪細胞和巨噬細胞。上面的皮膚層即表皮由成層的上皮細胞組成，其中細胞通過最深層有絲分裂形成并遷移至表面替代連續(xù)不斷脫掉的細胞。通過表皮層的遷移使細胞改變形狀和組成，因為它們在稱作角質(zhì)化的過程中分化并變得充滿角蛋白。最外層的表皮由大約25層死細胞組成。表皮可以分成5個不同層角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和生發(fā)層(或基底層、基層)。角質(zhì)層由死亡的去核角質(zhì)形成細胞組成， 其中交聯(lián)的結(jié)構(gòu)蛋白提供機械保護。在下層顆粒層中的角質(zhì)形成細胞合成形成幾乎水不透性屏障即透性屏障所需的大量脂質(zhì)。構(gòu)成透性屏障的脂質(zhì)主要是膽固醇、脂肪酸和神經(jīng)酰胺。脂質(zhì)在顆粒層完全分化角質(zhì)形成細胞內(nèi)的大量包含脂質(zhì)的板層小體中裝配，然后通過胞吐作用釋放。在釋放后，脂質(zhì)被加工和重組織以形成連續(xù)的層狀單位結(jié)構(gòu)基質(zhì)，構(gòu)成功能透性屏障(Madison, K. C. (2003). Barrier function of the skin “ la raison d' ete" of the epidermis. J Invest Dermatol 121:231-241)。透性屏障防止身體失水，但是同時它降低了對通過局部應(yīng)用所施用生物學(xué)活性分子的吸收。多種基于脂質(zhì)體的制劑已經(jīng)用于通過皮膚遞送藥物，并且基于所謂柔韌脂質(zhì)體的新制劑已經(jīng)證明能深入滲透并有效進入皮膚。Application of vesicles to rat skin in vivo :a confocal laser scanning microscopy study. J Control Release 56 :189-96 ；van Kuijk—Meuwissen， Μ. E.，Junginger, H. Ε. and Bouwstra, J. A. (1998). Interaction between liposomes and human skin in vitro,a confocal laser scanning microscopy study. Biochim Biophys Actal371 :31-9.)。最近，納米顆粒也考慮作為獲得有效皮膚滲透的載體。真皮是表皮下面的皮膚層。真皮由結(jié)締組織組成并且使身體抵抗不同類型的壓力和拉力。真皮還包含神經(jīng)纖維用于觸覺和熱覺。其還包含毛囊、汗腺、皮脂腺、頂泌腺和血管。血管向真皮細胞以及表皮的生發(fā)層提供營養(yǎng)并帶走廢物。關(guān)于不同層皮膚中核受體活化的信息可以通過將本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)靶向轉(zhuǎn)基因動物，如轉(zhuǎn)基因克隆豬的皮膚中得到，由此建立對于人皮膚的體內(nèi)模型。豬皮膚的組織結(jié)構(gòu)與人皮膚相似，因此使得豬皮膚成為人皮膚的良好模型。因此，在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)整合入皮膚組織內(nèi)。 在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)整合入表皮組織內(nèi)。在另一優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核受體傳感器系統(tǒng)整合入真皮組織內(nèi)。試劑和化合物本發(fā)明提供用于評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法。本發(fā)明還涉及用于測試化合物改變試劑在動物組織內(nèi)影響的能力的方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑和/或化合物包含任何可能的物理或化學(xué)試劑、化合物、混合物、復(fù)合物、復(fù)合體、物質(zhì)、材料、物品、顆粒、元素、單元、成分或制劑。在一個實施方案中，試劑和/或化合物是藥物組合物、化妝品、藥物、異生素化合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、 膳食補充劑、輻射或電刺激。在優(yōu)選的實施方案中，試劑和/或化合物是異生素化合物。術(shù)語“異生素化合物” 如本文所使用指不是所接觸生物體的天然成分的任何化學(xué)化合物。異生素化合物也稱作外來或外源物質(zhì)或化合物。異生素化合物還涵蓋以比通常高得多的濃度出現(xiàn)的天然存在物質(zhì)。異生素化合物實例包括但不限于天然存在化合物、藥物、抗生素、環(huán)境試劑、污染物如二惡英和多氯聯(lián)苯、致癌物和殺蟲劑。在優(yōu)選的實施方案中，試劑和/或化合物是維生素D類似物。在另一優(yōu)選的實施方案中，試劑和/或化合物是輻射，包括紫外線輻射(UV-輻射)、紅外線輻射、電磁輻射、伽瑪-輻射(Y -輻射)、Χ"射線和日曬。在特別優(yōu)選的實施方案中，試劑和/或化合物是UV-輻射。在另一優(yōu)選的實施方案中，試劑和/或化合物是化妝品，例如皮膚洗劑、防曬洗劑或防曬隔離洗劑。更加具體而言，在一個實施方案中，試劑是UV-輻射，例如UV-C輻射并且化合物是防曬洗劑或防曬乳。以該方式，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物、細胞、方法和用途可以用于評價防曬洗劑/防曬組合物抵抗UV-輻射對組織如皮膚組織內(nèi)核受體活性的影響的能力。本發(fā)明的試劑和化合物包含任何形狀、大小或構(gòu)象。在一個實施方案中，試劑是流體、結(jié)晶、溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微?；蚣{米顆粒形式。具體應(yīng)用本發(fā)明的方法、動物和細胞系可用于許多具體應(yīng)用。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法、動物和細胞系可用于評價物理或化學(xué)試劑在組織，例如皮膚組織中對特定核受體活化的影響。此種影響可用于解釋試劑穿透特定組織的能力。本發(fā)明的該方面涵蓋著評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法，包括a.提供轉(zhuǎn)基因動物，包含至少一種核酸序列，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或 .另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b.向所述動物施用所述試劑，和c.評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物在步驟(b)之前和之后的改變表明對所述組織有影響。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法、動物和細胞系可用于評價化合物抵抗或增強物理或化學(xué)試劑在組織中影響的能力。在一個實施方案中，此種化合物是防曬洗劑。本發(fā)明的該方面被用于測試化合物改變試劑在動物組織內(nèi)影響能力的方法所涵蓋，所述方法包括a.向轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，轉(zhuǎn)基因動物包含至少一種核酸序列，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物， b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和c.評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中在所述化合物存在和缺乏下所述表達產(chǎn)物量的差異表明所述化合物能夠改變所述試劑在所述組織內(nèi)的影響。該后一方面的化合物可以是如本文別處所詳細說明的任何物理或化學(xué)試劑。在一個實施方案中，化合物選自藥物組合物、化妝品、藥物、異生素化合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、膳食補充劑、輻射和/或電刺激。在特定實施方案中，化合物是溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微粒和/或納米顆粒形式。在優(yōu)選的實施方案中，化合物是防曬洗劑。 在另一實施方案中，后一方面的試劑是輻射，例如試劑是UV-輻射。因此，在一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物、細胞系、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞和/或細胞核用于評價核受體活性的用途。在優(yōu)選的實施方案中，用途涉及評價試劑，如上面所定義的試劑對核受體活性的影響。因此，本發(fā)明的動物、細胞系、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞和/或細胞核可用于通過比較在所述試劑存在和缺乏下報告轉(zhuǎn)錄物和/或多肽的表達來評價物理或化學(xué)試劑對核受體活性的影響，如本文別處所描述的那樣。在另一實施方案中，用途涉及體內(nèi)評價因內(nèi)源激動劑而引起的核受體活性，例如因在正常皮膚發(fā)育過程中產(chǎn)生的激動劑而引起的核受體活性。以這種方式，可以通過檢測報告轉(zhuǎn)錄物和/或多肽的時空表達評價特定核受體的時空活化。然而，在特定實施方案中，內(nèi)源激動劑在疾病，例如銀屑病、不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生。實施例為了得到關(guān)于不同皮膚層中核受體活化的信息，設(shè)計了可以靶向轉(zhuǎn)基因克隆豬皮膚的基因報告系統(tǒng)，以建立人皮膚的替代體內(nèi)模型。核受體傳感器系統(tǒng)可用于三個目的。首先，本發(fā)明可以用于檢查不同類型脂質(zhì)體或其它制劑轉(zhuǎn)運化合物進入皮膚的能力。通過以包含核受體激活劑的制劑處理皮膚，報告基因的活化將反映出制劑的穿透能力。第二，傳感器-細胞系統(tǒng)使得可以檢查多種異生素穿透進入表皮的能力。最后，傳感器-細胞系統(tǒng)還使得可以測定正常發(fā)育和皮膚穩(wěn)態(tài)過程中和/或不同疾病階段過程中因內(nèi)源激動劑的產(chǎn)生所引起的核受體活化。實施例1核受體傳感器系統(tǒng)報告基因系統(tǒng)由含有驅(qū)動報告基因表達的增強子/啟動子的盒組成。使用常規(guī) P-半乳糖苷酶基因，因此使得對表達的酶性檢測簡單。隨后，使用基于綠色熒光蛋白(或綠色熒光蛋白的多種衍生物)的報告子使得能夠通過共聚焦和多光子熒光顯微鏡進行直接熒光檢測。增強子/啟動子是酵母UAS (gal)增強子或細菌LexA結(jié)合位點與胸苷激酶啟動子融合的常規(guī)組合。為活化這些報告基因系統(tǒng)，酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與視黃酸受體、維生素D受體、肝X受體配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的融合活化混雜孕烷X受體并且將使用PPAR。為了保證皮膚-特異性表達，這些構(gòu)建體的啟動子區(qū)將被已知驅(qū)動表皮特異性表達的角蛋白14增強子/啟動子取代。為了產(chǎn)生傳感器細胞系和轉(zhuǎn)基因克隆豬，使用PXR-眾多異生素的可能靶標-還有PPAR δ -在人表皮中表達的主要PPAR亞型-維生素D受體-已知在銀屑病治療中的藥物靶標-和視黃酸受體-經(jīng)驗證的皮膚靶標和皮膚穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)者。實施例2轉(zhuǎn)基因豬作為測試藥物和異生素穿透入皮膚的模型豬皮膚是人皮膚的良好模型。轉(zhuǎn)基因豬通過從遺傳工程改造的纖維細胞向卵胞質(zhì)體的體細胞核轉(zhuǎn)移克隆而來。通過這種方法，本發(fā)明描述的基因報告系統(tǒng)整合入基因組以得到轉(zhuǎn)基因報告豬。此外，將產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因豬品種，即其中GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或LexADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PXR、視黃酸受體、維生素D受體和PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合物被整合入基因組并且通過使用驅(qū)動皮膚-特異性表達的K14增強子/啟動子在表皮的基細胞中表達。轉(zhuǎn)基因報告豬與轉(zhuǎn)基因K14-核受體轉(zhuǎn)基因豬的雜交將產(chǎn)生傳感器豬品種。這些傳感器豬品種可以用于確定因正常皮膚發(fā)育過程中所產(chǎn)生內(nèi)源激動劑的產(chǎn)生導(dǎo)致的活化。此外，傳感器豬品種還可用于研究原位皮膚滲透性和核受體被異生素的活化。隨后如下所述開展皮膚滲透性分析。如通過核受體活化所測定，分析例如不同制劑促進測試化合物進入皮膚的滲透性以及不同異生素的滲透性?？梢詼y定響應(yīng)于接觸不同制劑中所選擇藥物和異生素的核受體的空間活化。所讀出的是通過免疫組織化學(xué)檢測的報告基因表達的酶的誘導(dǎo)或者通過共聚焦熒光和/或多光子激發(fā)熒光顯微鏡檢測的報告基因表達的熒光蛋白的誘導(dǎo)。此外，不同脂質(zhì)體和納米顆粒制劑在皮膚中的滲透性可以通過共聚焦熒光和/或外部熒光探針的多光子激發(fā)熒光顯微鏡直接檢查，由此可以得到制劑的空間分布與皮膚結(jié)構(gòu)之間的直接相互關(guān)系。共聚焦熒光和/或多光子激發(fā)熒光顯微鏡已經(jīng)成功地用于確定關(guān)于皮膚的動力學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。例如，這兩種技術(shù)的剖切能力對于以無創(chuàng)方式，例如通過使用天然存在或者外部熒光探針解開皮膚組織的復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)是非常有用的。對動物和人皮膚真皮和皮下結(jié)構(gòu)的體內(nèi)和間接體內(nèi)成像均可用于此目的。實施例3傳感器受體系統(tǒng)的瞬時體外轉(zhuǎn)染HEK 細胞以 1. 0 μ g 載體 pT2/UAS-d2eGFP 或 1. 0 μ g pM/hVDR 或 Gal4VP16 轉(zhuǎn)染。 在轉(zhuǎn)染前12小時、向細胞提供維生素D類似物，轉(zhuǎn)染時不提供，并且在轉(zhuǎn)染后3小時再次提供。在轉(zhuǎn)染后M小時通過熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)分析細胞，見圖2-4。載體描述PT2/UAS-d2eGFP包含處于最小胸苷激酶(TK)啟動子控制下的帶有非穩(wěn)定GFP和 UAS元件的傳感器組件。pM/hVDR和Gal4VP16分別包含融合至fell 4的UAS結(jié)合區(qū)的hVDR或VP16。VP16 是組成型活性的，而hVDR需要配體結(jié)合以作為轉(zhuǎn)錄活化劑起作用。序列SEQ ID NO 1Gal4 DBD Atgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaa gaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgct gactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgag aagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagat aatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatag aataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgSEQ ID NO 2hVDR LBD aagcggaaggaggaggaggccttgaaggacagtctgcggcccaagctgtctgaggagcagcagcgcatc attgccatactgctggacgcccaccataagacctacgaccccacctactccgacttctgccagttccggcctccagttcgtgtgaatgatggtggagggagccatccttccaggcccaactccagacacactcccagcttctctggggactcct cctcctcctgctcagatcactgtatcacctcttcagacatgatggactcgtccagcttctccaatctggatctgagt gaagaagattcagatgacccttctgtgaccctagagctgtcccagctctccatgctgccccacctggctgacctggt cagttacagcatccaaaaggtcattggctttgctaagatgataccaggattcagagacctcacctctgaggaccaga tcgtactgctgaagtcaagtgccattgaggtcatcatgttgcgctccaatgagtccttcaccatggacgacatgtcc tggacctgtggcaaccaagactacaagtaccgcgtcagtgacgtgaccaaagccggacacagcctggagctgattga gcccctcatcaagttccaggtgggactgaagaagctgaacttgcatgaggaggagcatgtcctgctcatggccatct gcatcgtctccccagatcgtcctggggtgcaggacgccgcgctgattgaggccatccaggaccgcctgtccaacaca ctgcagacgtacatccgctgccgccacccgcccccgggcagccacctgctctatgccaagatgatccagaagctagc cgacctgcgcagcctcaatgaggagcactccaagcagtaccgctgcctctccttccagcctgagtgcagcatgaagc taacgccccttgtgctcgaagtgtttggcaatgagatctcctgaSEQ ID NO 34 X UASCaaggcggagtactgtcctccgggctggcggagtactgtcctccggcaaggtcggagtactgtcctccg acactagaggtcggagtactgtcctccgacgSEQ ID NO 4最小TK啟動子Gtggccgccccgactgcatctgcgtgttcaaattcgccaatgacaagacgctgggcggggtttgtgtc atcatagaactaaagacatgcaaatatatttcttccggggacaccgccagcaaacgcgagcaacgggccacgggga tgaagcagSEQ ID NO 5d2eGFPatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgta aacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctg caccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctggggcgtgcagtgcttcagccgct accccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagct gaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacatcagccacaacgtct atatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtg cagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgag cacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccg ggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaagSEQ ID NO 6RIR(T2-2.代)agtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctct ctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttacta ggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaac tgSEQ ID NO 7
LIR(T2-2.代)項目下列項目定義本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。第1項.用于評價試劑在動物組織內(nèi)影響的方法，包括a.提供轉(zhuǎn)基因動物，包含至少ー種核酸序列，其中i.所述至少ー種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受 體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b.向所述動物施用所述試劑，和c.評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中所述表達產(chǎn)物在步驟(b)之前和之后發(fā)生改變表明對所述組織有影響。第2項.根據(jù)第1項的方法，其中所述試劑是任何物理或化學(xué)試劑。第3項.根據(jù)第1項的方法，其中所述試劑是藥物組合物、化妝品、藥物、異生素化 合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食補充劑、福射、電刺激。第4項.根據(jù)第3項的方法，其中所述試劑是溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微粒、納米顆 粒形式。第5項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述組織選自皮膚、表皮、真皮、下皮、月旨 肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤。第6項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述組織是皮膚。第7項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述組織是表皮。第8項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述組織是真皮。第9項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述動物選自人、非人靈長類動物、豬、迷 你豬、微型豬、小鼠、大鼠和哨齒類動物。第10項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述動物是人。第11項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動物是豬。第12項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。第13項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述報告多肽或其片段包含可檢測產(chǎn) 物。第14項.根據(jù)第13項的方法，其中所述報告多肽或其片段包含可視覺檢測、光學(xué) 檢測或放射自顯影檢測的產(chǎn)物。第15項.根據(jù)前述任意ー項的方法，其中所述報告多肽選自0-半乳糖苷酶、 HcRecU DsRecU DsRed單體、ZsGreen. AmCyan、むれ110*、螢火蟲螢光素酶、Iac 2、海腎螢光 素酶、5￡六 、增強綠色焚光蛋白(66ド )、42￡6ド 、增強藍色焚光蛋白(68ド )、增強黃色焚光 蛋白(6￥ド )、和6ド じ 、增強青色焚光蛋白(6〔ド )、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚焚光蛋 白、人a-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修飾物或功能變體.
第16項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述報告多肽是β -半乳糖苷酶。第17項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述評價包括通過選自酶學(xué)和分光鏡學(xué)測定、共聚焦和多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、引物延伸和DNA陣列技術(shù)的任何技術(shù)檢測。動子。
第18項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中編碼報告多肽的所述核酸序列前面是啟
第19項第20項第21項第22項第23項,
菌LexA結(jié)合位點(第M 項第25 項·
根據(jù)第18項的方法，其中所述啟動子是異源性啟動子。 根據(jù)第18項的方法，其中所述啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。 根據(jù)第18項的方法，其中所述啟動子是胸苷激酶啟動子。 根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述啟動子還包含增強子元件。 根據(jù)第22項的方法，其中所述增強子元件選自酵母UASgal增強子和細
根據(jù)第23項的方法，其中所述增強子元件是酵母UASgal增強子。 根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述融合多肽包含核受體或其部分插入 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)和/或插入在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的N-末端和/或C-末端。第沈項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述融合多肽包含核受體或其部分插入在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的C-末端。
的表達t
第27項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述融合多肽的表達促進所述報告多肽
第觀項第四項第30項
根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述另外的核酸序列前面是啟動子。 根據(jù)第觀項的方法，其中所述啟動子是可誘導(dǎo)啟動子。 根據(jù)第觀項的方法，其中編碼偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體的另外的所述核酸序列從組織-特異性啟動子表達。 第31項.根據(jù)第30項的方法，其中所述組織-特異性啟動子對選自皮膚、表皮、 真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、 角膜和/或腫瘤的組織是特異的。
第32項.根據(jù)第30項的方法，其中所述啟動子是皮膚-特異性啟動子。
根據(jù)第觀項的方法，其中所述啟動子是角蛋白14增強子/啟動子。 根據(jù)第觀項的方法，其中所述啟動子包含增強子元件。 根據(jù)第觀項的方法，其中所述啟動子包含光可誘導(dǎo)序列。 根據(jù)第觀項的方法，其中所述啟動子包含化學(xué)可誘導(dǎo)序列。 根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體或其部分包含核受體配體結(jié)個片段。
.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體是甲狀腺激素受體- a (TRa ；NRlAl，THRA)、甲狀腺激素受體-β (TRβ ；NR1A2, THRB)、視黃酸受體-a (RARa ；NR1B1, RARA)、視黃酸受體-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、視黃酸受體-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)、過氧化物酶體增殖物激活受體_ a (PPAR α ；NRlCl，
第33項第；34項第35項第36項第37項.
合結(jié)構(gòu)域的至少-
第 38 項PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體-β / δ (PPAR β / δ ；NR1C2, PPARD)、過氧化物酶體增殖物激活受體-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA α (Rev-ErbA α ；NR1D1)、 Rev-ErbA β (Rev-ErbA β ；NR1D2)、RAR-相關(guān)孤兒受體-α (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相關(guān)孤兒受體-β (R0R β ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受體-a (LXR α ；NR1H3)、肝 X 受體-β (LXR β ； NR1H2)、法尼醇X受體(FXR ；NR1H4)、維生素D受體(VDR ；NRlIl, VDR)(維生素D)、孕烷X 受體(P)CR ;NR1I2)、組成型雄烷受體(CAR;NR1I3)、肝細胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝細胞核因子-4-γ (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G)、類視黃醇 X 受體-a (RXRa ；NR2B1, RXRA)、類視黃醇 X 受體-β (RXR β ；NR2B2，RXRB)、類視黃醇 X 受體-Y (RXR Y ；NR2B3， RXRG)、睪丸受體2(TR2 ；NR2C1)、睪丸受體4 (TR4 ；NR2C2)、果蠅tailless基因的人同系物(TLX;NR2E1)、感光細胞-特異核受體(PNR;NR2E3)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)、6 V-erbA-相關(guān)(EAR-2 ;NR2F6)、雌激素受體-a (ERa ；NR3A1，ESR1)、雌激素受體-β (ERβ ； NR3A2，ESR2)、雌激素相關(guān)受體-a (ERRa ； NR3B1, ESRRA)、雌激素相關(guān)受體-β (ERR β ； NR3B2, ESRRB)、雌激素相關(guān)受體-γ (ERRy ； NR3B3, ESRRG)、糖皮質(zhì)激素受體(GR ；NR3C1) (皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR ；NR3C2)(醛固酮)、孕酮受體O3R ；NR3C3,PGR)(性激素孕酮)、雄激素受體(AR ；NR3C4, AR)(性激素睪酮)、神經(jīng)生長因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受體相關(guān)1 (NURR1 ；NR4A2)、神經(jīng)元衍生的孤兒受體1 (N0R1 ；NR4A3)、類固醇生成因子1 (SFl ； NR5A1)、肝受體同系物-1 (LRH-1 ；NR5A2)、精細胞核因子(GCNF ；NR6A1)、DAXl (劑量敏感性性反轉(zhuǎn)，腎上腺發(fā)育不全關(guān)鍵區(qū)，在X染色體上，基因I(NROBl))、小異二聚體伴侶(SHP ； NR0B2)或具有兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體QDBD-NR)。 第39項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體選自維生素D受體、肝X受體、視黃酸受體、類視黃醇X受體、混雜孕烷X受體和過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)，包括 PPAR a、PPAR β / δ、PPAR γ。第40 項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體選自PPAR。第41 項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體是PPARS。第42 項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述核受體是混雜孕烷X受體。第43 項 根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自GAL4DNA結(jié)合
結(jié)構(gòu)域和LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第44項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述施用包括經(jīng)口，包括頰和舌下、直腸、鼻、局部、肺、陰道或腸胃外包括肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用或通過吸入或吹入施用。第45項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述施用是局部施用。第46項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述施用是肺施用。 第47項根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述表達產(chǎn)物包含RNA和/或多肽。第48項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或翻譯產(chǎn)物的評價在
活動物中開展。第49項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或翻譯產(chǎn)物的評價在無需從活動物中取出組織的情況下開展。第50項.根據(jù)前述任意一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或翻譯產(chǎn)物的評價在從動物取出的樣品上開展。第51項.根據(jù)第50項的方法，其中所述樣品選自皮膚組織包括表皮和真皮組織、 乳腺組織、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和/或汗液。第52項.根據(jù)前述任意一項的方法，還包括向組織重復(fù)施用試劑。第53項.根據(jù)前述任意一項的方法，還包括至少一個另外的評價步驟。第討項.根據(jù)第53項的方法，其中評價步驟分開至少1、2、3、4、5、10、20、30、60、 180,365 或 700 天。第55項.用于測試化合物改變試劑在動物組織內(nèi)影響的能力的方法，包括a.向包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和c.評價編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物和/或翻譯表達產(chǎn)物，其中在所述化合物存在和缺乏下所述表達產(chǎn)物量的差異表明所述化合物能夠改變所述試劑在所述組織內(nèi)的影響。第56項.根據(jù)第55項的方法，如第2項至第M項中任意一項所定義。第57項.根據(jù)第55項和第56項中任意一項的方法，其中所述化合物是任何物理或化學(xué)試劑。第58項.根據(jù)第57項的方法，其中所述化合物是藥物組合物、化妝品、藥物、異生素化合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、膳食補充劑、輻射或電刺激。第59項.根據(jù)第57項和第58項中任意一項的方法，其中所述化合物是溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微粒、納米顆粒形式。第60項.根據(jù)第55項和第59項中任意一項的方法，其中所述化合物是防曬洗劑。第61項.根據(jù)第55項至第60項的方法，其中所述試劑是輻射。第62項.根據(jù)第61項的方法，其中所述試劑是UV-輻射。第63項.包含至少一種核酸序列的轉(zhuǎn)基因動物，其中i.所述至少一種核酸序列編碼報告多肽或其部分，和/或ii.另外的核酸序列編碼融合多肽，融合多肽包含偶聯(lián)至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。第64項.根據(jù)第63項的轉(zhuǎn)基因動物，用于評價試劑對組織的影響。第65項.根據(jù)第63項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物選自豬、小鼠、大鼠、嚙齒類動物、狗、猴、豚鼠、迷你豬和微型豬。第66項.根據(jù)第63項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物是豬。第67項.根據(jù)第63項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物是小鼠。第68項.根據(jù)第63項至第67項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告多肽選自 β -半乳糖苷酶、HcRed, DsRed, DsRed 單體、ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、SEAP、EGFP、EBFP, EYFP、d2EGFP和GFPuv、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白和/或其片段、修飾物或功能變體。第69項.根據(jù)第63項至第68項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告多肽是 β-半乳糖苷酶或其片段或功能變體。第70項.根據(jù)第63項至第69項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體選自維生素D受體、肝X受體、混雜孕烷X受體和PPAR，或其片段。第71項.根據(jù)第63項至第70項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第72項.根據(jù)第66項的轉(zhuǎn)基因豬，包含至少一種核酸序列，其中a.所述至少一種核酸序列編碼β -半乳糖苷酶或其部分，和/或b.另外的核酸序列編碼融合多肽，包含偶聯(lián)至酵母GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 PPAR δ或其部分，或所述另外核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。第73項.根據(jù)第63項至第72項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，用于體內(nèi)測定因內(nèi)源激動劑的產(chǎn)生所引起的核受體活化。第74項.根據(jù)第73項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述激動劑在皮膚正常發(fā)育過程中產(chǎn)生。第75項.根據(jù)第73項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述內(nèi)源激動劑在疾病，例如銀屑病、 不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生。第76項.根據(jù)第75項的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述疾病是銀屑病。第77項.根據(jù)第63項至第76項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物，用于測定試劑在組織內(nèi)的原位穿透性和/或核受體被第2項至第4項中任意一項所定義試劑的活化。第78項.從根據(jù)第63項至第77項任意一項的轉(zhuǎn)基因動物衍生的細胞系。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因動物，包含1.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和 .至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點，和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物是豬。
3.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動物選自豬、迷你豬、 微型豬、小鼠、大鼠、非人靈長類動物和嚙齒類動物。
4.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，包含a.至少一種編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含偶聯(lián)至酵母GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PPAR δ或其部分，和/或b.至少一種編碼半乳糖苷酶或其部分的核酸序列。
5.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體或其部分包含核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其片段。
6.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體是甲狀腺激素受體-a (TRa ；NRlAl, THRA)、甲狀腺激素受體-β (TR^ ；NR1A2, THRB)、視黃酸受體-a (RARa ；NR1B1, RARA)、視黃酸受體-β (RAR^ ；NR1B2, RARB)、視黃酸受體-Y (RAR γ ；NR1B3, RARG)、過氧化物酶體增殖物激活受體_ a (PPAR α ；NRlCl， PPARA)、過氧化物酶體增殖物激活受體-β / δ (PPARβ / δ ；NR1C2, PPARD)、過氧化物酶體增殖物激活受體-Y (PPAR γ ；NR1C3, PPARG)、Rev-ErbA a (Rev-ErbA α ；NR1D1)、 Rev-ErbAβ (Rev-ErbAβ ；NR1D2)、RAR-相關(guān)孤兒受體-a (RORa ；NR1F1, R0RA)、RAR-相關(guān)孤兒受體-β (R0Rβ ；NR1F2, R0RB)、肝 X 受體-a (LXRa ；NR1H3)、肝 X 受體-β (LXRβ ； NR1H2)、法尼醇X受體(FXR ；NR1H4)、維生素D受體(VDR ；NRlIl, VDR)(維生素D)、孕烷X 受體(PXR;NR1U)、組成型雄烷受體(CAR;NR1I3)、肝細胞核因子-4-a (HNF4 α ；NR2A1, HNF4A)、肝細胞核因子-4-γ (HNF4 γ ；NR2A2, HNF4G)、類視黃醇 X 受體-a (RXRa ；NR2B1, RXRA)、類視黃醇 X 受體-β (RXR β ；NR2B2，RXRB)、類視黃醇 X 受體-Y (RXR Y ；NR2B3， RXRG)、睪丸受體2 (TR2 ；NR2C1)、睪丸受體4 (TR4 ；NR2C2)、果蠅tai 1 less基因的人同系物(TLX;NR2E1)、感光細胞-特異核受體(PNR ；NR2E3)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子I (C0UP-TFI ；NR2F1)、雞卵白蛋白上游啟動子-轉(zhuǎn)錄因子II (C0UP-TFII ；NR2F2)、6 V-erbA-相關(guān)(EAR-2 ;NR2F6)、雌激素受體-a (ERa ；NR3A1，ESR1)、雌激素受體-β (ERβ ； NR3A2，ESR2)、雌激素相關(guān)受體-a (ERRa ； NR3B1, ESRRA)、雌激素相關(guān)受體-β (ERR β ； NR3B2, ESRRB)、雌激素相關(guān)受體-γ (ERRy ； NR3B3, ESRRG)、糖皮質(zhì)激素受體(GR ；NR3C1) (皮質(zhì)醇)、鹽皮質(zhì)激素受體(MR ；NR3C2)(醛固酮)、孕酮受體(PR ；NR3C3，PGR)(性激素孕酮)、雄激素受體(AR ；NR3C4, AR)(性激素睪酮)、神經(jīng)生長因子IB(NGFIB ；NR4A1)、核受體相關(guān)1 (NURR1 ；NR4A2)、神經(jīng)元衍生的孤兒受體1 (N0R1 ；NR4A3)、類固醇生成因子1 (SFl ； NR5A1)、肝受體同系物-1(LRH-1 ；NR5A》、精細胞核因子(GCNF ;NR6A1)、DAXl (劑量敏感性性反轉(zhuǎn)，腎上腺發(fā)育不全關(guān)鍵區(qū)，在X染色體上，基因I(NROBl))、小異二聚體伴侶(SHP ； NR0B2)或具有兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體QDBD-NR)。
7.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體選自維生素D受體、肝X受體、視黃酸受體、類視黃醇X受體、混雜孕烷X受體和過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)，包括 PPAR α、PPAR β / δ、PPAR γ。
8.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是GAL4DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LexA DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或其部分。
9.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分從誘導(dǎo)型和/或組織-特異性啟動子表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述組織-特異性啟動子對選自皮膚、表皮、真皮、下皮、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和/或腫瘤的組織具有特異性。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述啟動子是角蛋白14增強子/啟動子。
12.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分物理性或化學(xué)性偶聯(lián)。
13.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列還包含至少一種酵母上游活化序列(UASgal)、細菌 LexA結(jié)合位點和/或其部分。
14.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中編碼可檢測報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽的所述核酸序列從異源性啟動子和/或誘導(dǎo)型啟動子表達。
15.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中在對所述核受體特異的配體存在下所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的表達促進所述報告多肽的表達。
16.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告轉(zhuǎn)錄物、多肽或其片段包括可視覺檢測、光學(xué)檢測或放射自顯影檢測的產(chǎn)物。
17.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告多肽選自半乳糖苷酶、 HcRed, DsRed, DsRed 單體、ZsGreen, AmCyan, ZsYellow、螢火蟲螢光素酶、lac Z、海腎螢光素酶、SEAP、增強綠色熒光蛋白(eGFP)、d2EGFP、增強藍色熒光蛋白(eBFP)、增強黃色熒光蛋白(eYFP)、和GFPuv、增強青色熒光蛋白(eCFP)、青色、綠黃、紅色和遠紅色礁珊瑚熒光蛋白、人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和/或其片段、修飾物或功能變體。
18.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告多肽是半乳糖苷酶。
19.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽的所述表達可通過選自酶測定或光譜測定、共聚焦或多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、引物延伸和DNA陣列技術(shù)的任何技術(shù)檢測。
20.一種評價試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性的影響的方法，所述方法包括a.提供如前述權(quán)利要求1至19中任一項所述的非人轉(zhuǎn)基因動物，b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用試劑，和c.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達表示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。
21.用于檢測化合物改變試劑對非人動物組織內(nèi)核受體活性的影響的能力的方法，包括a.提供如前述權(quán)利要求1至19中任一項所述的非人轉(zhuǎn)基因動物，b.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述化合物，c.向所述轉(zhuǎn)基因動物施用所述試劑，和d.檢測編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的所述核酸序列在所述動物中的表達，其中在施用所述試劑后所述表達表示所述試劑對所述組織內(nèi)核受體活性的影響。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求20至21任一項的方法，其中編碼報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列的表達在所述試劑和/或化合物存在和缺乏下檢測。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求20至22任一項的方法，其中在所述試劑存在下與在缺乏所述試劑下相比a.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達升高表示所述試劑對所述核受體的活性具有刺激性影響，b.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達降低表示所述試劑對所述核受體的活性具有抑制性影響，和c.所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達未改變表示所述試劑對所述核受體的活性不具有或者具有很小的影響。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求20至23任一項的方法，其中在所述化合物存在下與在所述化合物缺乏下相比a.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響升高表示所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響具有刺激性影響，b.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響降低表示所述化合物對所述試劑對核受體活性的影響具有抑制性影響，和c.所述試劑對所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的影響很小或未改變表示所述化合物對所述試劑對所述核受體活性的影響不具有或者具有很小的影響。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至M任一項的方法，其中所述核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的表達促進所述報告多肽的表達。
26.根據(jù)權(quán)利要求20至25任一項的方法，其中編碼報告多肽的核酸序列的表達通過檢測編碼報告多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯表達產(chǎn)物檢測。
27.根據(jù)權(quán)利要求20至沈任一項的方法，其中所述報告轉(zhuǎn)錄物或報告多肽表達的檢測包括通過選自酶測定或光譜測定、共聚焦或多光子熒光顯微鏡、western印跡、免疫染色、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及核酸檢測技術(shù)例如northern印跡、southern印跡、聚合酶鏈式反應(yīng)、引物延伸和DNA陣列技術(shù)的任何技術(shù)檢測。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求20至27任一項的方法，其中所述試劑或化合物是任何物理或化學(xué)試劑。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求20至觀任一項的方法，其中所述試劑或化合物是藥物組合物、 化妝品、藥物、異生素化合物、食物成分、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食補充劑、輻射和/或電刺激。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求20至四任一項的方法，其中所述化合物是防曬洗劑和/或所述試劑是UV-輻射。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求20至30任一項的方法，其中所述試劑或化合物是溶液、霜劑、洗劑、凝膠、微粒和/或納米顆粒形式。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求20至31任一項的方法，其中所述試劑或化合物通過口服包括頰和舌下、直腸、鼻、局部、肺、陰道或腸胃外包括肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用或通過吸入或吹入施用。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求20至32任一項的方法，其中所述試劑或化合物通過局部和/或肺施用進行施用。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求20至33任一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的檢測在活動物中開展。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求20至34任一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的檢測在無需從活動物中取出組織的情況下開展。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求20至35任一項的方法，其中所述對轉(zhuǎn)錄和/或翻譯報告產(chǎn)物的檢測在從動物中取出的組織樣品上開展。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求20至36任一項的方法，其中所述組織選自皮膚、表皮、真皮、下皮、乳腺、脂肪、胸腺、腸、小腸、大腸、胃、肌肉、胰腺、心肌、骨骼肌、平滑肌、肝臟、肺、腦、角膜和腫瘤、卵巢組織、子宮組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織、腎臟組織、胸腺組織、睪丸組織、造血組織、骨髓、泌尿生殖組織、呼出氣、干細胞包括癌干細胞、和體液例如痰、尿、血液和/或汗液。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求20至37任一項的方法，其中所述組織是皮膚、表皮和/或真皮。
39.從根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項的轉(zhuǎn)基因動物衍生的細胞系。
40.從如在權(quán)利要求1至19任一項所定義的轉(zhuǎn)基因非人動物衍生的轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，和/或轉(zhuǎn)基因非人卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核，其中轉(zhuǎn)基因基因組包含i.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和 .至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點，和/或iii.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。
41.產(chǎn)生根據(jù)前述權(quán)利要求1至19、39和40任一項的轉(zhuǎn)基因非人動物、卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核的方法，包括步驟i.提供供體細胞，ii.通過插入下列對i)的供體細胞進行基因修飾a.至少一種編碼核受體或其部分和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸序列，和b.至少一種編碼可檢測報告核酸轉(zhuǎn)錄物和/或報告多肽或其部分的核酸序列，其中所述核酸還包含至少一個包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合位點，和/或c.任何所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物，iii.將在ii)中得到的供體細胞的修飾的基因組轉(zhuǎn)移進入宿主細胞，IV.得到形成胚胎的重構(gòu)胚胎V.培養(yǎng)所述胚胎；和Vi.轉(zhuǎn)移所述培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物使得胚胎發(fā)育成基因修飾的胎兒，其中所述基因修飾的胚胎通過包括步驟i)至V)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，其中所述基因修飾的胚泡通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生， 其中所述基因修飾的胎兒通過包括步驟i)至vi)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。
42.在權(quán)利要求1至19任一項所定義的轉(zhuǎn)基因動物，在權(quán)利要求39中所定義的細胞系，和/或在權(quán)利要求40中所定義的卵母細胞、精細胞、胚泡、胚胎、胎兒、供體細胞或細胞核用于評價核受體活性的用途。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的用途，用于評價試劑對核受體活性的影響。
44.根據(jù)權(quán)利要求42至43任一項的用途，用于評價體內(nèi)因內(nèi)源激動劑而引起的核受體活性。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的用途，其中所述激動劑在皮膚的正常發(fā)育過程中產(chǎn)生。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的用途，其中所述內(nèi)源激動劑在疾病，例如銀屑病、不同的癌癥類型和/或其它高增生性疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生。
47.根據(jù)權(quán)利要求42至46任一項的用途，其中所述核受體、評價、試劑和/或組織如前述權(quán)利要求任一項中所定義。
全文摘要
提供用于檢測動物組織內(nèi)特異核受體活化的傳感器系統(tǒng)。核受體傳感器系統(tǒng)包括包含偶聯(lián)至DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核受體或其部分的傳感器組件，和包含報告基因的報告器組件。提供了轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因豬，其在其基因組中包含核受體傳感器系統(tǒng)的組件。還提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法以及轉(zhuǎn)基因動物用于體內(nèi)評價核受體活性的用途。
文檔編號C12N15/63GK102203259SQ200980144264
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者L·A·伯朗德, 卡斯滕·克里斯蒂安森, 尼克拉斯·海涅·斯塔斯特普, 雅各布·齊姆·米克爾森 申請人:南丹麥大學(xué), 奧胡斯大學(xué)