專(zhuān)利名稱：小型振蕩瓶培養(yǎng)的制作方法
小型振蕩瓶培養(yǎng)本文報(bào)道了小型振蕩瓶培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中振蕩瓶?jī)?nèi)部培養(yǎng)基的條件通過(guò)振蕩瓶的旋轉(zhuǎn)速度和振蕩瓶的外部氣壓來(lái)控制。
背景技術(shù)：
在開(kāi)發(fā)例用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)重組多肽的生物技術(shù)生產(chǎn)工藝的過(guò)程中，有多個(gè)參數(shù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)和優(yōu)化。由于需要大量的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，這種優(yōu)化以小規(guī)模進(jìn)行，優(yōu)選在振蕩瓶中進(jìn)行。但由于大型攪拌培養(yǎng)器和小型振蕩瓶在幾何尺寸和反應(yīng)條件上的差異，得到的小規(guī)模的結(jié)果不代表大型工藝的真實(shí)結(jié)果。這些差異是由化學(xué)、生化和加工工程的原因引起的。因此，總體目標(biāo)是找出小型和大型工藝的條件例如細(xì)胞密度、產(chǎn)品濃度或盡可能好的產(chǎn)品質(zhì)量之間的聯(lián)系。為了使大型工藝和小型工藝盡可能具有可比性，必須評(píng)估各種差異對(duì)獲得的結(jié)果的影響。例如，如果大型工藝是攪拌工藝，那么小型工藝最好也采用攪拌工藝。DE441M44報(bào)道了振蕩瓶中攝氧速率在線測(cè)定的自動(dòng)測(cè)定系統(tǒng)。Kensy F.等人 (Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 698-708)報(bào)道了 48 孔微量滴定板的氧傳遞現(xiàn)象。Nowack G.等人(Am. Physio. Soc. (1996)C2072-C2080)報(bào)道了 L-抗壞血酸調(diào)節(jié)腎細(xì)胞的生長(zhǎng)與新陳代謝。Randers-Eichhorn L.等人(Biotechnol. Bioeng. 51 (1996)466-477)報(bào)道了在組織培養(yǎng)瓶中的非侵入性氧測(cè)量和傳質(zhì)考慮因素。Micheletti M.等人(Chem.Eng. Sci. 61(2006)2939-2949)報(bào)道了振蕩生物反應(yīng)器中的流體混合對(duì)于微量型微生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大化預(yù)測(cè)的意義。因此，需要在小型振蕩瓶基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)大型攪拌哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，反之亦然。 另一個(gè)目標(biāo)是提供小型振蕩瓶工藝，在其中實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基攪動(dòng)和混合的小型機(jī)械攪拌。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面是培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括-根據(jù)如下因素調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度i)培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度，和/或ii)培養(yǎng)基中的氧分壓。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟a)培養(yǎng)一套培養(yǎng)容器-每一個(gè)容器的總?cè)莘e最高為200μ 1，或-每一個(gè)容器的工作容積最高為100μ 1，或-每一個(gè)容器的總?cè)莘e在25ml至3000ml之間，或-每一個(gè)容器的工作容積在IOml至1500ml之間，和/或b)通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)攪動(dòng)培養(yǎng)基，c)通過(guò)培養(yǎng)容器的外氣相的二氧化碳濃度來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)容器包含培養(yǎng)基和培養(yǎng)基上方的內(nèi)部氣相。在另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)容器包含將內(nèi)部氣相和外部氣相分離的膜或帽或蓋。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的俯仰運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的振蕩來(lái)實(shí)現(xiàn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括d)通過(guò)非侵入性光化學(xué)傳感器確定培養(yǎng)容器內(nèi)的pH值和p02。在另一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的調(diào)節(jié)如下i)根據(jù)起始細(xì)胞密度將機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度設(shè)置為60rpm至IOOrpm，其中當(dāng)細(xì)胞密度為IxlO5細(xì)胞/ml或更小時(shí)設(shè)置為60rpm，當(dāng)細(xì)胞密度為2. 5x10s細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為80rpm，當(dāng)細(xì)胞密度為5x10s細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為lOOrpm，或在中間細(xì)胞密度時(shí)設(shè)置為線性中間值，ii)活細(xì)胞密度每增加一倍，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞濃度達(dá)到20xl05 細(xì)胞/ml，iii)活細(xì)胞密度每增加20xl05細(xì)胞/ml，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞密度達(dá)到80xl05細(xì)胞/ml，iv)活細(xì)胞密度由80xl05細(xì)胞/ml增加至細(xì)胞密度ΙΟΟχΙΟ5細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加lOrpm。在一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)的速度進(jìn)一步調(diào)節(jié)如下ν)維持機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度在200rpm至210rpm之間，逐步降低機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度至 135rpm,并保持該速度不變直到培養(yǎng)完成。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟ν)中機(jī)械運(yùn)動(dòng)的速度維持在200rpm至2IOrpm達(dá)18小時(shí)至30小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟ν)中機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度維持在200rpm至210rpm達(dá)約24小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式包括根據(jù)培養(yǎng)基中的氧分壓來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度，以維持培養(yǎng)基中的氧分壓處于或高于下限水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，增加機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度以增加培養(yǎng)基中的氧分壓或降低機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度以降低培養(yǎng)基中的氧分壓。在一個(gè)實(shí)施方式中，為改變氧分壓而對(duì)機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行的改變是線性變化，或是多項(xiàng)式變化或是指數(shù)變化。在一個(gè)實(shí)施方式中，氧分壓的下限水平是25%空氣飽和度。本發(fā)明的第二個(gè)方面是重組生產(chǎn)異源多肽的方法，包括以下步驟a)提供含有編碼異源多肽的核酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，b)用本發(fā)明的方法培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，c)從培養(yǎng)基中回收異源多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，異源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白接合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、 SP2/0細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明的第三方面是非侵入性光化學(xué)傳感器在本發(fā)明的方法中用于測(cè)定小型培養(yǎng)容器中的PH值和PA的應(yīng)用。本發(fā)明的第四方面是本發(fā)明的方法用于確定在容積為1000L至25000L的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍的應(yīng)用。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及在振蕩瓶中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中，用機(jī)械運(yùn)動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)基的攪動(dòng)，并通過(guò)運(yùn)動(dòng)速度和振蕩瓶外部氣壓來(lái)控制pH、pO)2和p02。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞密度、成活力、活細(xì)胞密度、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、體積產(chǎn)量、產(chǎn)品濃度和產(chǎn)品質(zhì)量與在帶有機(jī)械攪拌的總量為1000L至25000L的培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)相當(dāng)。因此，在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基不通過(guò)直接與小型培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基接觸的機(jī)械部件如機(jī)械攪拌槳或電磁攪拌棒進(jìn)行攪動(dòng)或混合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“機(jī)械運(yùn)動(dòng)”是指使小型培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)、 即使其攪動(dòng)或混合的方式。在一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)通過(guò)使整個(gè)培養(yǎng)容器運(yùn)動(dòng)來(lái)進(jìn)行， 而不是使用直接與培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基接觸的機(jī)械部件。生物技術(shù)生產(chǎn)工藝的開(kāi)始是以獲自冷凍細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞培養(yǎng)作為初始培養(yǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)移確定數(shù)量的細(xì)胞或確定體積的培養(yǎng)基至新的培養(yǎng)容器中將初始培養(yǎng)擴(kuò)大，所述新的培養(yǎng)容器比之前使用的容器具有更大的培養(yǎng)體積并且在其中加入了新鮮的另外的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)可以在通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)如振蕩、俯仰運(yùn)動(dòng)等攪動(dòng)或混合培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在具有一定培養(yǎng)量的情況下，優(yōu)選采用機(jī)械攪拌來(lái)攪動(dòng)和混合培養(yǎng)基，以最小化由于培養(yǎng)基的攪動(dòng)和混合不充分而導(dǎo)致的培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)基組分的濃度差異。這種濃度差異可導(dǎo)致培養(yǎng)條件的不均勻，從而導(dǎo)致不同培養(yǎng)量下得到的培養(yǎng)結(jié)果缺乏可比性。因此，在不進(jìn)行重大修改以及大量工作的情況下，小規(guī)模下獲得的結(jié)果和確定的參數(shù)不能輕易轉(zhuǎn)移到大規(guī)模培養(yǎng)中。為了能夠從小型向大型轉(zhuǎn)化，在過(guò)去已經(jīng)確定了一些重要的參數(shù)-培養(yǎng)容器的幾何可比性，如高徑比，或內(nèi)部構(gòu)件如液體流斷路器(折流板)，-由類(lèi)似尺寸的攪拌裝置輸入的類(lèi)似的體積比能量，-類(lèi)似的質(zhì)量疏運(yùn)，-類(lèi)似的重要工藝參數(shù)控制如培養(yǎng)基中的氧分壓、pH值、溫度等。根據(jù)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小型培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。在該方法中，通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)攪動(dòng)和混合培養(yǎng)基。此外，氧氣和二氧化碳分壓以及與之相關(guān)的PH值的控制可隨之實(shí)現(xiàn)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法施行時(shí)，小型培養(yǎng)所產(chǎn)生的細(xì)胞密度和產(chǎn)品濃度與在機(jī)械攪拌的培養(yǎng)容器中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大型培養(yǎng)相似。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“機(jī)械攪拌”或其語(yǔ)法等價(jià)術(shù)語(yǔ)是指機(jī)械部件如攪拌槳或攪拌棒直接接觸容器中的培養(yǎng)基。使用本文所報(bào)道的培養(yǎng)方法，可以通過(guò)小型培養(yǎng)來(lái)確定大型培養(yǎng)中關(guān)于培養(yǎng)基PH值、溫度、混合速度、氣相的二氧化碳飽和度以及氧分壓的時(shí)間進(jìn)程的培養(yǎng)參數(shù)范圍。本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“范圍”是指很多小型培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)得的參數(shù)最大值和最小值之間的范圍。因此，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法在容積為25ml至3000ml的培養(yǎng)容器中的小型培養(yǎng)，本發(fā)明的方法可用于確定在容積為1000L至25000L的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法就地使用非侵入性光化學(xué)傳感器在線測(cè)定pH值和PA 值即氧分壓。在一個(gè)實(shí)施方式中，傳感器位于振蕩瓶的下部并且包括嵌入組織相容性聚合物中的熒光性分析物敏感染料，其可通過(guò)光纖讀出。通過(guò)根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)節(jié)機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度可以調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基中的氧分壓。機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度可逐步或連續(xù)地調(diào)節(jié)。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“逐步”是指培養(yǎng)方法中的參數(shù)變化是立即的，即，直接從一個(gè)值變到下一個(gè)值。在“逐步”調(diào)節(jié)中，一個(gè)或多個(gè)參數(shù)在每次變化后保持改變的參數(shù)值直到方法中的下一個(gè)逐步調(diào)節(jié)或方法結(jié)束。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“連續(xù)”是指培養(yǎng)方法中的參數(shù)變化是連續(xù)的，即，參數(shù)值的變化是一系列小步驟，在一個(gè)實(shí)施方式中，每步的變化不大于參數(shù)值的2%，在另一個(gè)實(shí)施方式中，不大于參數(shù)值的1%。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)是連續(xù)和線性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從切105細(xì)胞/ml的接種細(xì)胞密度、IOOrpm的機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度開(kāi)始是很有利的，活細(xì)胞密度每加倍一次機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度就增加20rpm，直到細(xì)胞密度達(dá)到20xl05細(xì)胞/ ml ；之后，活細(xì)胞密度每增加20xl05細(xì)胞/ml，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度就增加20rpm，直到最終細(xì)胞密度達(dá)到SOxlO5細(xì)胞/ml ；之后，將機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加lOrpm，以使活細(xì)胞密度由SOxlO5細(xì)胞 /ml增加至ΙΟΟχΙΟ5細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到IOOxIO5細(xì)胞/ml之后，活細(xì)胞密度增加， 但機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度保持不變。在一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度在最大值保持不變持續(xù)16至 72小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度在最大值保持不變持續(xù)18至30小時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方式中，持續(xù)約M小時(shí)。機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度保持不變后，將其逐步降低至135rpm并保持不變，直到培養(yǎng)完成。更詳細(xì)地，為5xl05細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度設(shè)定到IOOrpm(rpm =每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))。達(dá)到IOxlO5細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到120rpm ；達(dá)到20xl05細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到140rpm ；達(dá)到40xl05細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到160rpm ；達(dá)到60xl05 細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到180rpm ；達(dá)到80xl05細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到 200rpm ；達(dá)到100x10s細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加到210rpm。之后，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度保持在200rpm士20rpm持續(xù)大約對(duì)小時(shí)。以后，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度降低至135rpm。在一個(gè)實(shí)施方式中是逐步降低，在一個(gè)不同的實(shí)施方式中是連續(xù)降低。在另一個(gè)實(shí)施方式中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的降低是連續(xù)和漸進(jìn)的。達(dá)到135rpm的最終機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度之后，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度保持不變直到培養(yǎng)完成，然后收獲重組生產(chǎn)的多肽。改變機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度允許增加或降低液相中的氧分壓，其一方面取決于培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度，另一方面取決于培養(yǎng)階段，即取決于培養(yǎng)是在指數(shù)增長(zhǎng)階段、穩(wěn)定階段還是生產(chǎn)階段。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“線性”是指可表達(dá)為線性方程的兩個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系，如y =a ^ x+b，其中y和χ表示兩個(gè)參數(shù)，a和b表示常數(shù)值。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“多項(xiàng)式” 是指可表達(dá)為多項(xiàng)式方程的兩個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系，如y = a * x+b * x2+c * x3+d * x4+···， 其中y和x表示兩個(gè)參數(shù)，a、b、c和d等表示常數(shù)值。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“指數(shù)”是指可表達(dá)為指數(shù)方程的兩個(gè)參數(shù)的相互關(guān)系，如y = a * ex+b，其中y和χ表示兩個(gè)參數(shù)，a和 b表示常數(shù)值，e為歐拉指數(shù)，為2. 71828182845904523536o在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器外部的二氧化碳分壓來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ρΗ 值。由于氣相壓力和液相分壓的關(guān)系，氣態(tài)二氧化碳可以強(qiáng)制進(jìn)入液相(氣相中的壓力上升)或者它可以從液相中(氣相中的壓力降低)去除。由于二氧化碳在液體培養(yǎng)基中水化， 它是碳酸氫根的來(lái)源，因此，提供了液相中的碳酸鹽緩沖劑以調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的PH值。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)小型培養(yǎng)容器外的二氧化碳?xì)鈮簛?lái)調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的ΡΗ，因此外部pC02的降低導(dǎo)致培養(yǎng)基的ρΗ上升，反之亦然。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)是分批補(bǔ)料培養(yǎng)的方式?！暗鞍踪|(zhì)”是大分子，包括一個(gè)或多個(gè)多肽鏈或超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。蛋白質(zhì)還可包括如碳水化合物基團(tuán)的非肽類(lèi)組分。碳水化合物和其他非肽類(lèi)取代基可通過(guò)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞加成到蛋白質(zhì)上，并隨細(xì)胞類(lèi)型而變化。本文所定義的蛋白質(zhì)是根據(jù)其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)來(lái)定義的；取代基如碳水化合物基團(tuán)一般不明確指出，不過(guò)仍然可能存在。免疫球蛋白的重組生產(chǎn)在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，并描述在例如Makrides， S. C. ， Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S. φ 人·，Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151 — 161 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”是指由一個(gè)或多個(gè)大量被免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。已經(jīng)確定的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以各種形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體(例如 Huston，J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.等人，Science 242(1988)423-426 ；通常，Hood 等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)；禾口 Hunkapiller, T.和 Hood, L.，Nature 323(1986) 15-16)。一般情況下，免疫球蛋白包括兩條所謂的輕鏈多肽(輕鏈)和兩條所謂的重鏈多肽(重鏈)。每個(gè)重鏈和輕鏈多肽都包含可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(一般為多肽鏈的氨基末端部分)，其包括能與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。每個(gè)重鏈和輕鏈多肽都包含恒定區(qū)(一般為羧基末端部分)。重鏈的恒定區(qū)調(diào)節(jié)抗體與如下細(xì)胞的結(jié)合i)帶有Fc γ受體(FcyR)的細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞，或ii)帶有新生Fc受體(Fcfoi)(也被稱為Brambell受體)的細(xì)胞。它還調(diào)節(jié)與某些因子、包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子如免疫成分(Clq)的結(jié)合。免疫球蛋白的輕或重鏈可變區(qū)本身又包括不同的片段，即四個(gè)框架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(⑶R)。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白接合物”是指包含至少一個(gè)通過(guò)肽鍵與另外的多肽結(jié)合的免疫球蛋白重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域的多肽。另外的多肽是非免疫球蛋白肽，如激素，或生長(zhǎng)受體，或抗融合肽或補(bǔ)充因子等。術(shù)語(yǔ)“異源免疫球蛋白”是指不是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞自然生產(chǎn)的免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的免疫球蛋白是通過(guò)重組方式生產(chǎn)的。這種方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，包括蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的表達(dá)以及隨后回收和分離異源免疫球蛋白，并且通常純化得到藥學(xué)上可接受的純度。為了生產(chǎn)，即表達(dá)免疫球蛋白，編碼輕鏈的核酸和編碼重鏈的核酸均通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法被插入到表達(dá)框中。編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核酸很容易用常規(guī)程序分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞或B-細(xì)胞可作為這種核酸的來(lái)源。表達(dá)框可被插入到表達(dá)質(zhì)體中，然后將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到在未轉(zhuǎn)染的情況下無(wú)法生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并且從溶胞后的細(xì)胞或從培養(yǎng)上清液中回收免疫球蛋白。術(shù)語(yǔ)“重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞”是指這樣的細(xì)胞，核酸、例如編碼異源多肽的核酸可被或者被引入或轉(zhuǎn)染進(jìn)入該細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括用于表達(dá)核酸的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞(如CHO K1、CH0DG44)、或BHK細(xì)胞、或NSO細(xì)胞、或SP2/0細(xì)胞、或HEK 293細(xì)胞、或HEK 293 EBNA細(xì)胞、或PER. C6 細(xì)胞、或COS細(xì)胞。特別優(yōu)選CHO 細(xì)胞、或BHK細(xì)胞、或PER. C6 細(xì)胞。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括母細(xì)胞及其后代細(xì)胞。 因此，術(shù)語(yǔ)“重組細(xì)胞”包括初級(jí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和包含由其衍生的后代細(xì)胞(不考慮傳代次數(shù))的培養(yǎng)物?？梢岳斫獾氖?，由于故意或無(wú)意的突變，所有的后代細(xì)胞的DNA內(nèi)容可能不完全相同。與初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有相同的功能或生物活性的變種后代也包括在內(nèi)。為了純化重組生產(chǎn)的異源免疫球蛋白，通常采用不同柱色譜步驟的組合。一般來(lái)說(shuō)，在蛋白A親和色譜之后進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)附加的分離步驟。最后的純化步驟是所謂的 “精煉步驟”，用來(lái)去除痕量雜質(zhì)和污染物如聚集的免疫球蛋白、殘余HCP(宿主細(xì)胞蛋白)、 DNA(宿主細(xì)胞核酸)、病毒或內(nèi)毒素。對(duì)于精煉步驟，通常在流通模式下使用陰離子交換材料。很好地建立了不同的方法并普遍用于回收和純化蛋白質(zhì)，如微生物蛋白質(zhì)親和色譜法(如蛋白A或蛋白G親和色譜法)、離子交換色譜法(如陽(yáng)離子交換(羧甲基樹(shù)脂)、陰離子交換(氨基乙基樹(shù)脂)和混合模式交換)、嗜硫吸附色譜法(例如采用巰基乙醇和其他SH配體)、疏水作用或芳香吸附色譜法(如采用苯基瓊脂糖、氮雜嗜沙 (aza-arenophilic)樹(shù)脂，或間氨基苯硼酸)、金屬螯合親和色譜法(如采用Ni (II)-和銅 (II)-親和材料)、體積排阻色譜法和電泳法(如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi， Μ. Α.，App1. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。提供下面的實(shí)施例和附圖來(lái)幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍由所附的權(quán)利要求確定。可以理解的是，可以對(duì)提出的方法進(jìn)行修改而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。


附圖1 培養(yǎng)基(原位)中在線測(cè)定的培養(yǎng)過(guò)程中pH值和p02 (氧分壓)值時(shí)程圖。附圖2 在線測(cè)定和離線測(cè)定之間的pH值和p02值的比較。附圖3 :p02值(離線和在線)的時(shí)程圖、活細(xì)胞密度和機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的進(jìn)程圖。附圖4 離線和在線測(cè)定之間PH值的比較。此外，給出了恒溫箱中P(X)2的時(shí)程圖。附圖5 取決于培養(yǎng)基中活細(xì)胞密度(X軸)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度(y軸)的示例性變化。實(shí)施例1
材料和方法細(xì)胞密度通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞密度。由于其完整的細(xì)胞膜，活細(xì)胞能夠排出帶有負(fù)電荷的染料臺(tái)盼藍(lán)，由此可以區(qū)分活細(xì)胞與非活細(xì)胞(參見(jiàn)例如Freshney，R. (1987) Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique,第117頁(yè)，Alan R. Liss,Inc., 紐約)。該方法在細(xì)胞培養(yǎng)分析儀CEDEXHiRes (Irmovatis AG，比勒費(fèi)爾德，德國(guó))中自動(dòng)進(jìn)行。然后通過(guò)活細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比率來(lái)計(jì)算存活率。底物及代謝產(chǎn)物葡萄糖、乳酸鹽、氨、谷氨酰胺和谷氨酸濃度通過(guò)酶和離子選擇性傳感器測(cè)定。所使用的儀器是NOVA BioProfile loo (nova生物醫(yī)學(xué)，Riidermark，德國(guó))。免疫球蛋白濃度免疫球蛋白濃度通過(guò)親和色譜用蛋白A作為特異性免疫球蛋白結(jié)合劑(PorosA 柱，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行測(cè)量。在波長(zhǎng)為^Onm下通過(guò)吸收測(cè)量來(lái)測(cè)定免疫球蛋白的洗脫曲線。pH、pC02、p02:血?dú)夥治鰞x(pHOx，NOVA生物醫(yī)學(xué)，RSdermark，德國(guó))用于測(cè)定pH以及氧分壓(p02)和二氧化碳分壓(PCO2)。滲透壓通過(guò)測(cè)量可與溶質(zhì)含量相關(guān)的樣品凝固點(diǎn)的降低來(lái)測(cè)定滲透壓(Osmomate 030， Gonotec，柏林，德國(guó))。實(shí)施例2小型振蕩瓶培養(yǎng)-一般程序在裝有通風(fēng)帽以及綜合pH和氧氣傳感器(Precision Sensing GmbH，雷根斯堡，德國(guó)，Cat. -Nr. 200000919)的250ml無(wú)菌錐形瓶(康寧，Cat. -Nr. 431144)中，在無(wú)菌條件下采用潔凈工作臺(tái)裝入120ml培養(yǎng)基。將含有培養(yǎng)基的振蕩瓶在已被證實(shí)能夠提供足夠精確的溫度調(diào)節(jié)的帶有溫度控制的恒溫箱中進(jìn)行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)包括在用于培養(yǎng)的起始階段的溫度、氣壓條件和機(jī)械運(yùn)動(dòng)條件下對(duì)含有尚未接種細(xì)胞的培養(yǎng)基的燒瓶進(jìn)行保溫。調(diào)節(jié)后，在無(wú)菌條件下使用潔凈工作臺(tái)，用表達(dá)重組免疫球蛋白的CHO細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基接種。培養(yǎng)以分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式進(jìn)行。在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的PH值和PA值通過(guò)光化學(xué)熒光傳感器原位測(cè)定。通過(guò)恒溫箱的設(shè)置來(lái)控制pC02。除了連續(xù)測(cè)定pH值、PA值和p(X)2值外， 每培養(yǎng)M小時(shí)后，還要測(cè)定以下參數(shù)-細(xì)胞密度，-底物(葡萄糖)和代謝物(谷氨酰胺、氨、谷氨酸、乳酸、乳酸脫氫酶活性)的濃度，-上清液中免疫球蛋白濃度，-滲透壓。基于上述所列參數(shù)的測(cè)定值，沒(méi)有、有一個(gè)或多個(gè)下列參數(shù)每M小時(shí)改變一次-通過(guò)改變機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度改變p02，-通過(guò)改變恒溫箱中的外界(X)2氣壓(酸控制)或加入堿(堿控制)來(lái)改變pH，-添加營(yíng)養(yǎng)液。實(shí)施例3使用恒定的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和恒溫箱中恒定的P(X)2進(jìn)行小型振蕩瓶培養(yǎng)可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行小型培養(yǎng)的抗體(優(yōu)選單克隆)的例子為抗淀粉樣蛋白β -Α4 肽的抗體(抗Αβ抗體)。在例如WO 2003/070760或US 2005/0169925中報(bào)道了這種抗體和相應(yīng)的核酸序列。用以下參數(shù)在KUhner恒溫箱(Kilhner AG,比爾斯費(fèi)爾登，瑞士，B08型)中小型培養(yǎng)表達(dá)抗-A β抗體的CHO細(xì)胞。
參數(shù)數(shù)值振蕩瓶偏心距5cm接種細(xì)胞密度5xl05 細(xì)胞 /ml起始體積120ml機(jī)械運(yùn)動(dòng)160rpm外界CO2氣體量5%飽和度pH約為7PO2> 25%空氣飽和度樣品體積4. 5ml測(cè)定的p02值和pH值示于附圖1中。從附圖1可以看出，溶液中的氧分壓(PO2) 非常高(高于70%空氣飽和度)，并且培養(yǎng)基的氧含量和pH值在每次取樣后均會(huì)上升。原位測(cè)定值(在線)和取樣(離線)的測(cè)定值的比較示于附圖2中?？梢缘贸鼋Y(jié)論-離線測(cè)定的p02值低于在線測(cè)定值；-144小時(shí)后離線測(cè)定的PA值低于25%空氣飽和度的閾值，其顯示了實(shí)際上并不存在的氧氣極限值；-離線測(cè)定的PH值低于在線測(cè)定值；-PH值的在線值和離線值之間的差異顯示其并不依賴于細(xì)胞密度。實(shí)施例4使用可變的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和恒溫箱中可變的P(X)2進(jìn)行小型振蕩瓶培養(yǎng)用以下參數(shù)在KUhner恒溫箱(Kilhner AG,比爾斯費(fèi)爾登，瑞士，B08型)中小型培養(yǎng)表達(dá)抗-A β抗體的CHO細(xì)胞。
參數(shù)數(shù)值振蕩瓶偏心距5cm接種細(xì)胞密度SxlO5 細(xì)胞/ml起始體積120ml機(jī)械運(yùn)動(dòng)根據(jù)在線測(cè)定的PO2而變化外界CO2氣體量根據(jù)在線測(cè)定的PH而變化PH約為7PO2> 25%空氣飽和度樣品體積4. 5ml
根據(jù)下表對(duì)機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行調(diào)節(jié)
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括根據(jù)i)培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度改變培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述改變進(jìn)一步取決于ii)培養(yǎng)基中的氧分壓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)如下步驟a)培養(yǎng)一套培養(yǎng)容器-每一個(gè)容器的總?cè)莘e最高為200 μ 1，或 -每一個(gè)容器的工作容積最高為100 μ 1，或 -每一個(gè)容器的總?cè)莘e在25ml至3000ml之間，或 -每一個(gè)容器的工作容積在IOml至1500ml之間，b)通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)攪動(dòng)培養(yǎng)基，c)通過(guò)培養(yǎng)容器的外氣相的二氧化碳濃度來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的俯仰運(yùn)動(dòng)或整個(gè)培養(yǎng)容器的振蕩進(jìn)行機(jī)械運(yùn)動(dòng)。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括d)通過(guò)非侵入性光化學(xué)傳感器確定培養(yǎng)容器內(nèi)的pH值和p02。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的調(diào)節(jié)如下 i)根據(jù)起始細(xì)胞密度將機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度設(shè)置為60rpm至IOOrpm，其中當(dāng)細(xì)胞密度為IxlO5細(xì)胞/ml或更小時(shí)設(shè)置為60rpm，當(dāng)細(xì)胞密度為2. 5x10s細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為80rpm， 當(dāng)細(xì)胞密度為5xl05細(xì)胞/ml時(shí)設(shè)置為lOOrpm， 或在中間細(xì)胞密度時(shí)設(shè)置為線性中間值， )活細(xì)胞密度每增加一倍，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞濃度達(dá)到20xl05細(xì)胞/ml,iii)活細(xì)胞密度每增加20xl05細(xì)胞/ml，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加20rpm，直至細(xì)胞密度達(dá)到 80xl05 細(xì)胞/ml，iv)活細(xì)胞密度由80xl05細(xì)胞/ml增加至細(xì)胞密度IOOxIO5細(xì)胞/ml時(shí)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度增加lOrpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于機(jī)械運(yùn)動(dòng)的速度進(jìn)一步調(diào)節(jié)如下ν)維持機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度在200rpm至210rpm之間，逐步降低機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度至135rpm，并保持該速度不變直到培養(yǎng)完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于步驟ν)中機(jī)械運(yùn)動(dòng)的速度維持在200rpm至 2IOrpm達(dá)18小時(shí)至30小時(shí)。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括，e)增加機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度來(lái)增加培養(yǎng)基中的氧分壓或降低機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度來(lái)降低培養(yǎng)基中的氧分壓。
10.生產(chǎn)異源多肽的方法，包括以下步驟a)提供含有編碼所述異源多肽的核酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，b)用根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，c)從培養(yǎng)基中回收異源多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白接合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11任一項(xiàng)的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、HEK 細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。
13.非侵入性光化學(xué)傳感器在權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法中用于測(cè)定小型培養(yǎng)容器中的PH值和p02的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法用于確定在容積為10001至250001的攪拌培養(yǎng)容器中的大型培養(yǎng)的培養(yǎng)參數(shù)范圍的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明報(bào)道了表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中a)培養(yǎng)是在總體積為25ml至3000ml的培養(yǎng)容器中進(jìn)行的，b)培養(yǎng)容器包含培養(yǎng)基和培養(yǎng)基上方的內(nèi)部氣相，c)培養(yǎng)容器包含將內(nèi)部氣相和外部氣相分離的膜或帽或蓋，d)培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基通過(guò)整個(gè)培養(yǎng)容器的機(jī)械運(yùn)動(dòng)進(jìn)行攪拌，e)培養(yǎng)過(guò)程中，機(jī)械運(yùn)動(dòng)速度的改變?nèi)Q于培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度或者取決于培養(yǎng)基中的氧分壓，f)培養(yǎng)基的pH值通過(guò)培養(yǎng)容器外部氣相的二氧化碳濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而活細(xì)胞密度的時(shí)程圖或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的異源多肽的體積得率與總體積為1000l至25000l的機(jī)械攪拌培養(yǎng)容器得到的結(jié)果相似。
文檔編號(hào)C12M1/36GK102171360SQ200980139382
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
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