專利名稱：細菌的[2Fe-2S]二羥酸脫水酶的鑒定和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域和二羥酸脫水酶活性的表達。更具體地講，鑒定了具有[2i^e-2S]簇的細菌二羥酸脫水酶，并使其在細菌和酵母宿主中作為異源蛋白質(zhì)被表達。
背景技術(shù)：
二羥酸脫水酶(DHAD)，也叫乙酰羥酸脫水酶，催化2，3_ 二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為 α -酮異戊酸和2，3- 二羥基甲基戊酸轉(zhuǎn)化為α -異亮氨酸酮酸。被分類為Ε. C. 4. 2. 1. 9的 DHAD酶是天然存在的生產(chǎn)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和泛酸(維生素Β5)的生物合成途徑的部分。對于增強的支鏈氨基酸或泛酸的微生物生產(chǎn)，活性DHAD的提高的表達是合乎期望的。
2，3- 二羥基異戊酸向α _酮異戊酸的DHAD催化的轉(zhuǎn)化也是共同擁有和共同未決的美國專利申請公布US 20070092957 Al中所公開的多種異丁醇生物合成途徑的共同步驟。本文公開的是用于生產(chǎn)異丁醇的重組微生物的改造。異丁醇作燃料添加劑是有用的， 其可用性可減少對石油化學(xué)燃料的需求。
為了提高在包括了二羥酸脫水酶的途徑中合成的化合物的生產(chǎn)，在所關(guān)注的生產(chǎn)宿主中表達提供這種酶活性的異源酶是合乎期望的。由于這種酶需要i^e-S簇，而這種需求涉及i^e-S簇的可獲得性和其向DHAD脫輔基蛋白中的正確裝載，二羥酸脫水酶在異源宿主中功能性的高表達的獲得是復(fù)雜的。
需要!^e-S簇的DHAD是本領(lǐng)域已知的，并且被發(fā)現(xiàn)以或[2i^e_2S]形式存在。一些細菌的此類酶是已知的，其中被最好地表征的是來自大腸桿菌的(E. coli) (Flint, DH，等人(1993) J.Biol· Chem. 268 14732-14742)。然而，這些細菌的酶均為[4Fe-4S]形式。 迄今報道的惟一 [2iie-2S]形式是一種菠菜酶(Flint 和 Emptage (1988) J. Biol. Chem. 263 3558-3564)。
由于[2i^e-2S]形式在i^e-S簇的合成和/或組裝方面造成的負(fù)擔(dān)更小，在宿主細胞中使用[2i^e-2S]形式的這種酶以提高所引入的生物合成途徑的生產(chǎn)是合乎期望的。遺憾的是，這種酶僅有一種[2i^e-2S]形式是已知的。
因此，存在對鑒定DHAD的新的[2i^e-2S]形式以用于重組宿主細胞中的需求，其中所述重組宿主細胞中，2，3- 二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為α -酮異戊酸是所期望的生物合成途徑中的代謝途徑步驟。
發(fā)明概述 本文提供了鑒定[2!^e-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括 a)用序型隱蔽馬爾科夫模型(Profile Hidden Markov Model)查詢一種或多種氨基酸序列，所述序型隱蔽馬爾科夫模型是使用SEQ ID NO :164、168、230、232、298、310、344 和346的蛋白質(zhì)制備的，其中具有小于10_5的E值的匹配提供了第一序列子集，從而所述第一序列子集對應(yīng)于一種或多種DHAD相關(guān)蛋白質(zhì)； b)分析步驟(a)的對應(yīng)于一種或多種DHAD相關(guān)蛋白質(zhì)的第一序列子集中三個保守的半胱氨酸的存在，從而鑒定出編碼[2i^e-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三個保守的半胱氨酸對應(yīng)于變異鏈球菌(Streptococcus mutans) 二羥酸脫水酶氨基酸序列(SEQ ID NO 168)的 56、129 和 201 位；以及 c)分析步驟(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，從而進一步鑒定出編碼[2i^e-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置對應(yīng)于變異鏈球菌 DHAD氨基酸序列(SEQ ID N0 168)中的以下位置88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和4M位的亮氨酸。
在本發(fā)明的另一方面，上述方法進一步包括 d)在細胞中表達具有可通過步驟a)、b)和c)中任何一個或全部步驟鑒定的序列的多肽；以及 e)確認(rèn)所述多肽在細胞中具有DHAD活性。
在本發(fā)明的另一方面，上述方法進一步包括 d)純化由可通過步驟a)、b)和C)中任何一個或全部鑒定的序列編碼的蛋白質(zhì)； 以及 e)通過紫外可見(UV-vis)和電子順磁共振(EPR)光譜法確認(rèn)所述蛋白質(zhì)是 [2Fe-2S]DHAD 酶。
在本發(fā)明的另一方面，上述方法進一步包括選擇一種或多種序列，所述序列對應(yīng)于在步驟a)、b)和c)中任何一個或全部中鑒定的細菌[2i^e-2S]DHAD酶序列。所述選擇的序列可在細胞中被表達；并且在該細胞中其DHAD活性可被確認(rèn)。所述選擇的序列可進一步被純化，從而獲得純化的蛋白質(zhì)并且所述純化的蛋白質(zhì)的[2i^e-2S]DHAD酶活性可通過 UV-vis和EI3R光譜得到確認(rèn)。
本發(fā)明的另一方面涉及微生物宿主細胞，所述宿主細胞包含至少一種可通過本文所述方法鑒定的異源[2i^e-2S]DHAD酶。所述細胞可以是細菌細胞或酵母細胞。所述細胞還可以是生產(chǎn)異丁醇的重組細胞。
本發(fā)明的另一方面是用于生產(chǎn)異丁醇的方法，所述方法包括 a)提供包含至少一種可通過本文所述方法鑒定的異源[2i^e-2S]DHAD酶的微生物宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含異丁醇生物合成途徑；和 b)使(a)的微生物宿主細胞在使異丁醇產(chǎn)生的條件下生長。
本發(fā)明的另一方面是用于使2，3_ 二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸的方法，所述方法包括 a)提供包含通過本文所述方法鑒定的至少一種異源[2i^e-2S]DHAD酶的微生物宿主細胞和2，3- 二羥基異戊酸源；和 b)使(a)的微生物宿主細胞在使2，3- 二羥基異戊酸被轉(zhuǎn)化為α _酮異戊酸的條件下生長。


和序列描述 通過下面的具體實施方式
、附圖和隨附的序列描述可以更全面地理解本發(fā)明，這些詳細描述、附圖和序列描述形成了本專利申請的一部分。
圖1顯示在代表性的細菌[2!^-2S]DHAD和Wi^elS]DHAD中的保守的半胱氨酸區(qū)域，以粗體的C表示半胱氨酸。采用單字母的氨基酸縮寫。
圖2顯示DHAD相關(guān)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。標(biāo)記了關(guān)于Wi^eIS]和[2!^e-2S]DHAD， 以及EDD、醛糖酸脫水酶和未確定的類群(Und)的分枝。標(biāo)記了選擇的個別DHAD。
圖3顯示用于異丁醇生產(chǎn)的生物合成途徑。
圖4顯示A)變異鏈球菌DHADdP B)大腸桿菌DHAD在空氣中的活性穩(wěn)定性的圖。
圖5顯示變異鏈球菌DHAD的紫外-可見光譜的曲線圖。
圖6顯示變異鏈球菌DHAD在介于20° K和90° K之間的不同溫度的電子順磁共振(EPR)光譜的曲線圖。
圖7顯示對表達乙酰乳酸合酶、KARI和變異鏈球菌DHAD基因的酵母細胞提取物的HPLC分析，在47. 533分鐘有異丁醇峰。
圖8顯示乳酸乳球菌(L. lactis)DHAD在空氣中穩(wěn)定性的圖。
圖9顯示純化的乳酸乳球菌DHAD的紫外-可見光譜的曲線圖。
表1是基于如實施例1中所述制備的、具有經(jīng)過檢驗的功能的酶針對二羥酸脫水酶的序型HMM的表。表1以電子方式附于本文提交，并以引用方式并入本文。
下列序列符合37 C. F. R. 1. 821-1. 825 ( “對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規(guī)則”)并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998)和 EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5. 2和49. 5 (a-bis)，以及行政性指示的208節(jié)和附錄C)。 用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37 C.F.R. § 1.822中所列出的規(guī)定。
表加代表性的細菌「2Fe_2SlDHAD蛋白質(zhì)和編碼序列
權(quán)利要求
1.用于鑒定[2i^e-2S]DHAD酶的方法，所述方法包括a)用序型隱蔽馬爾科夫模型查詢一種或多種氨基酸序列，所述序型隱蔽馬爾科夫模型是使用SEQ ID NO :164、168、230、232、298、310、344和346的蛋白質(zhì)制備的，其中具有小于 ΙΟ"5的E值的匹配提供了第一序列子集，從而所述第一序列子集對應(yīng)于一種或多種DHAD相關(guān)蛋白質(zhì)；b)分析步驟(a)的對應(yīng)于一種或多種DHAD相關(guān)蛋白質(zhì)的第一序列子集中三個保守的半胱氨酸的存在，從而鑒定出編碼[2!^-2S]DHAD酶的第二序列子集，其中所述三個保守的半胱氨酸對應(yīng)于變異鏈球菌(Str印tococcus mutans) 二羥酸脫水酶氨基酸序列(SEQ ID NO 168)的 56、1 和 201 位；以及c)分析步驟(b)的第二序列子集中特征保守氨基酸的存在，從而進一步鑒定出編碼[2i^e-2S]DHAD酶的第三序列子集，其中所述特征保守氨基酸的位置對應(yīng)于變異鏈球菌 DHAD氨基酸序列(SEQ ID NO 168)中的以下位置88位的天冬氨酸、142位的精氨酸或天冬酰胺、208位的天冬酰胺和4M位的亮氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括d)在細胞中表達具有能夠通過步驟a)、b)和c)中任何一個或全部來鑒定的序列的多肽；和e)確認(rèn)所述多肽在所述細胞中具有DHAD活性。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括d)純化由能夠通過步驟a)、b)和c)中任何一個或全部來鑒定的序列編碼的蛋白質(zhì)；和e)通過紫外-可見和電子順磁共振光譜法確認(rèn)所述蛋白質(zhì)是[2i^e-2S]DHAD酶。
4.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括選擇一種或多種序列，所述序列對應(yīng)于在步驟 a)、b)和c)中任何一個或全部中鑒定的細菌[2i^e-2S]DHAD酶序列。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述細胞缺少內(nèi)源的DHAD活性。
6.權(quán)利要求4的方法，所述方法還包括d)在細胞中表達所述選擇的一種或多種對應(yīng)于細菌[2i^e-2S]DHAD酶序列的序列；以及e)確認(rèn)所述酶序列在所述細胞中具有DHAD活性。
7.權(quán)利要求4的方法，所述方法還包括d)純化由所述選擇的一種或多種對應(yīng)于細菌[2i^e-2S]DHAD酶序列的序列編碼的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生純化的蛋白質(zhì)；和e)通過紫外-可見和電子順磁共振光譜法確認(rèn)所述蛋白質(zhì)是[2i^e-2S]DHAD酶。
8.包含至少一種異源[2!^-2S]DHAD酶的微生物宿主細胞，其中所述[2i^_2S]DHAD酶可通過權(quán)利要求1-7中任一項的方法被鑒定。
9.權(quán)利要求8的微生物宿主細胞，其中所述細胞是細菌細胞或酵母細胞。
10.權(quán)利要求9的微生物宿主細胞，其中所述細菌宿主細胞是選自梭菌屬 (Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽胞桿菌屬 (Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、禾口短桿菌屬(Brevibacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、酒球菌屬 (Oenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌屬的成員。
11.權(quán)利要求9的微生物宿主細胞，其中所述酵母細胞是選自糖酵母屬 (Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和畢赤酵母屬 (Pichia)的酵母屬的成員。
12.權(quán)利要求8的微生物宿主細胞，其中所述細胞產(chǎn)生異丁醇。
13.用于生產(chǎn)異丁醇的方法，所述方法包括a)提供權(quán)利要求8的微生物宿主細胞，其中所述宿主細胞包含異丁醇生物合成途徑；以及b)使步驟(a)的宿主細胞在產(chǎn)生異丁醇的條件下生長。
14.用于使2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸的方法，所述方法包括a)提供權(quán)利要求8的微生物宿主細胞和2，3-二羥基異戊酸源；以及b)使(a)的微生物宿主細胞在使2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸的條件下生長。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)了具有[2Fe-2S]簇的二羥酸脫水酶的群體。細菌的[2Fe-2S]DHAD被作為異源蛋白質(zhì)在細菌和酵母細胞中表達，提供了用于使2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為α-酮異戊酸和2，3-二羥基甲基戊酸轉(zhuǎn)化為α-異亮氨酸酮酸的DHAD活性。異丁醇和其他化合物可以在包括了細菌[2Fe-2S]DHAD活性的途徑中得到合成。
文檔編號C12P13/08GK102186973SQ200980138542
公開日2011年9月14日 申請日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月29日
發(fā)明者D·弗林特, S·C·羅思曼, W·蘇, J-F·湯布, R·W·葉 申請人:布特馬斯先進生物燃料有限責(zé)任公司