專利名稱：：藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實用新型涉及動物基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及以藏綿羊耐寒性相關(guān)基因ADRB3基因的等位基因檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：中國是世界羊產(chǎn)業(yè)大國，羊品種資源豐富，養(yǎng)羊數(shù)量居世界首位。2005年，全世界存欄綿羊、山羊分別為10.8億只和8.1億只，其中中國分別占有1.7億只和2.0億只。2007年全世界綿羊、山羊品種分別有995個和512個，其中中國分別占有50個和50個(FAO，2007)。據(jù)統(tǒng)計，2007年在中國六大牧區(qū)，即新疆、西藏、內(nèi)蒙、青海、四川和甘肅羊只存欄數(shù)1.6億只，占全國的43.9%，其中存欄綿羊1.1億只，占全國綿羊總存欄數(shù)的65.6%。這些地區(qū)的海拔在2500m-5000m的高原地區(qū)，因此，高原型綿羊在中國綿羊總存欄數(shù)中占有很大比例，然而，中國北方大部分地區(qū)冬春季嚴(yán)寒多風(fēng)，也正值母羊產(chǎn)羔高峰期。由于羔羊出生時體溫調(diào)節(jié)機能尚不完善，抵御寒冷的能力較弱，很容易出現(xiàn)羔羊被凍死的現(xiàn)象，新疆每年有14-16萬只羊在越冬中死亡，其中羔羊占60%左右，據(jù)統(tǒng)計,在高原牧區(qū)由于綿羊越冬凍死帶來的經(jīng)濟損失每年為500-700萬元。國內(nèi)外利用傳統(tǒng)方法改善綿羊越冬的耐寒性嘗試了多種方案，其中包括建造暖棚，為綿羊穿上冬衣，改善詞喂條件等。但這些方法皆由于經(jīng)濟耗費高，實用性差或效果不明顯等原因，并不能從根本上解決羔羊越冬的成活率問題。事實上，綿羊的耐寒性是一種受環(huán)境因素與遺傳因素互作的質(zhì)量性狀，也就是說在相同的外界溫度，飼喂和管理體制的條件下，決定綿羊越冬成活率的主要因素便是自身的遺傳特征。隨著分子標(biāo)記輔助育種(Marker-assistedSelection,MAS)技術(shù)的成熟，提高群體內(nèi)綿羊的耐寒性和增加高寒地區(qū)綿羊存活率已成為可能。1987年，Slee在綿羊育種實踐中發(fā)現(xiàn)，蘇格蘭黑面綿羊(ScottishBlack-facesheep)中存在著不同耐寒性的綿羊類群，其中耐寒性較差的一組，其后代不具有腎上腺素表達(dá)的應(yīng)激反應(yīng)。這種性狀為單基因效應(yīng)，以孟德爾方式遺傳，且為顯性遺傳(Simpson和Slee，1988)。該單基因效應(yīng)與兒茶酚胺介導(dǎo)產(chǎn)生的非顫抖熱有關(guān)(Slee和Simpson,1991)。自此，國內(nèi)外專家為定位綿羊耐寒性的主效基因做了大量努力。2000年，F(xiàn)orrest和Hickford對牛、山羊和綿羊的P3-AR基因，通過克隆測序獲得了全序列。Forrest等利用PCR-SSCP技術(shù)對新西蘭境內(nèi)的12個美利奴綿羊半同胞大群體的p3-AR基因開展了突變分析，并與相應(yīng)群體的表型數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析，結(jié)果是位于(33-AR基因內(nèi)中的一段包含部分內(nèi)含子(intron)的區(qū)域表現(xiàn)出了高度多態(tài)性，且其多態(tài)性與藏綿羊的初生重、生長率、屠宰重和耐寒性有關(guān)。擴大研究群體后進一步發(fā)現(xiàn)，這種相關(guān)主要集中在綿羊的耐寒性表型值上，并確立了相應(yīng)等位基因的耐寒性關(guān)聯(lián)值(Forrestetal.,2003,2006,2007)。2005年，Zhou等通過數(shù)據(jù)分析將該片段集中于內(nèi)含子調(diào)控區(qū)的一段長為263bp的片段，并通過對已有系統(tǒng)進行優(yōu)化，建立了耐寒性的商業(yè)檢測系統(tǒng)。然而該系統(tǒng)，缺乏新西蘭國外品種的數(shù)據(jù)，因此也未有涉及來自中國的綿羊品種，數(shù)據(jù)庫的存量仍顯不足。
實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒。為了克服傳統(tǒng)技術(shù)提高藏綿羊越冬耐寒性的不足，我們利用分子生物學(xué)技術(shù)對藏綿羊的耐寒性相關(guān)基因，并通過對檢測到藏綿羊等位基因進行分級從而得到該個體的耐寒性強弱。該技術(shù)不僅能檢測出藏綿羊耐寒性的強弱，而且能對該個體藏綿羊及進行遺傳背景分析，從而從個體自身水平提高藏綿羊耐寒性的選育。本實用新型的目的是提供一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒。依據(jù)現(xiàn)有體系，利用ADRB3這一分子標(biāo)記基因，建立了新的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)的藏綿羊耐寒性檢測體系。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取的技術(shù)方案為一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4),ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)/C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)/E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，在容器孔中還包括分別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)，10%過硫酸銨(7)，上樣變性緩沖液(6)，TEMED(四甲基乙二胺)(8)，聚丙烯酰胺(Arc:Bis=29:1)(9)。上述各種液體分別裝在容器內(nèi)，插入容器孔內(nèi)。上樣變性緩沖液包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025。/o二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)。所述的PCR反應(yīng)液(4)的成分用量及濃度引物各為0.75pL/10pmol，dNTP為0.9^a/2.5mm,TaqDNA聚合酶為0.2pL/2.5U/nL，10xbuffer為1.5pL含Mg2+15nM，雙純水為9.9fiL。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒的特異性擴增引物，上下游長度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc-3，；下游引物為-5，"Cccaactccaacccgacc畫3，<>所述的藏綿羊耐寒性基因為藏綿羊的P3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長為263bp的多態(tài)區(qū)域進行擴增；擴增后的產(chǎn)物長度為263bp。所述的檢測藏綿羊耐寒性等位基因的特異性擴增引物的擴增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，共35個循環(huán)，72。C總延伸10分鐘，4'C保存。藏綿羊ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)的核苷酸序列分別為A:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactag3gggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagecccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttgggC:ctagctcagttctttetctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccg3gactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg6012018024026360120180240263ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60tgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒的使用方法(1)將待檢測的基因組DNA(lpL/50ng)與試劑盒中的PCR反應(yīng)液混合；擴增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存(2)用步驟(1)中擴增的PCR產(chǎn)物和藏綿羊耐寒性較強等位基因A和C和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；(3)步驟(2)中檢測到的帶型與耐寒性等位基因A和C和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶藏綿羊耐寒性較強等位基因的個體。本實用新型的有益效果是反應(yīng)靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養(yǎng)殖企業(yè)的藏綿羊的選種?？梢詸z測藏綿羊個體自身的耐寒性性狀，從而提高藏綿羊的耐寒性選育效率，有效提高群體耐寒性。圖1是本實用新型的立體示意圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖對本實用新型的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限定本實用新型的范圍。實施例l:一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體l，襯墊2，在襯墊2上設(shè)有數(shù)個容器孔，其特征是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液4，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣10和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣11和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣12。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，還包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水5，10%過硫酸銨7，上樣變性緩沖液6，TEMED(四甲基乙二胺)8，聚丙烯酰胺(Arc:Bis=29:1)9。上述各種液體分別裝在容器內(nèi)，插入容器孔內(nèi)。上樣變性緩沖液6，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)，10%過硫酸銨，TEMED(四甲基乙二胺)，14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc:Bis=29:1)。所述的PCR反應(yīng)液4的成分及濃度為引物各為0.75nL/10pmol，dNTP為0.9pl/2.5mm，TaqDNA聚合酶為0.2nL/2.5U/nL,10xbuffer為1.5pL含Mg2+15pM,雙純水為9.9pL。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒的特異性擴增引物，上下游長度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc隱3，；下游引物為-5，"cccaactccaacccgacc-3，《所述的藏綿羊耐寒性基因為藏綿羊的p3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長為263bp的多態(tài)區(qū)域進行擴增；擴增后的產(chǎn)物長度為263bp。所述的檢測藏綿羊耐寒性等位基因的特異性擴增引物的擴增條件為:94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存。藏綿羊耐寒性基因ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣10/C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣11/E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣12的核苷酸序列分別為A:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60cgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263C:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60cgagactegagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60tgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒的使用方法，(1)將待檢測的基因組DNA(ltiL/50ng)與試劑盒中的PCR反應(yīng)液混合；擴增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60。C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個循環(huán)，72'C總延伸IO分鐘，4'C保存(2)用步驟(1)中擴增的PCR產(chǎn)物和藏綿羊耐寒性較強等位基因A、C、E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；(3)步驟(2)中檢測到的帶型與耐寒性等位基因A、C、E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶藏綿羊耐寒性較強等位基因的個體實施例2:1.材料和方法1.1試驗材料和方法l丄l試驗材料本試驗共采集甘加羊50只，采于甘南藏族自治州。血樣不加抗凝劑直接利用FTA試紙收集，陰干后待用。1.2試驗方法1.2.1藏綿羊基因組DNADNA提取按照WhatMan公司的提取方法進行。步驟如下(1)用取樣器從FTA采樣紙上取1個直徑為1.2mm的圓盤(Disk)，放入預(yù)先編號的PCR管中。(2)在每個樣品中加入200nL的20mM的NaOH溶液，使之充分與小圓盤(Disk)混勻，室溫下放置40mins(待小圓盤(Disk)的顏色變?yōu)榘咨?，必要時可以加熱至7(TC左右以加快洗脫速度)。(3)棄管內(nèi)NaOH液，加入200pL的TE緩沖液，室溫放置5min后棄TE緩沖液(一定要棄盡液體部分)。(4)PCR管敞口放置過夜，待管內(nèi)殘留液揮發(fā)盡后進行PCR擴增。1.2.2PCR擴增根據(jù)Forrest等報道的全序列與Byun等檢測到的耐寒性相關(guān)多態(tài)區(qū)域設(shè)計引物，對ADRB3基因第一內(nèi)含子一段長為263bp區(qū)域進行擴增。上下游長度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc-3，；下游弓I物為5，-cccaactccaacccgacc-3，。藏綿羊耐寒性基因為藏綿羊的P3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長為263bp的多態(tài)區(qū)域進行擴增。引物的擴增條件為94t:預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存。擴增后的產(chǎn)物長度為263bp。檢測藏綿羊耐寒性等位基因的檢測試劑盒，包括15nl的PCR反應(yīng)體系，其成分的用量及濃度為引物各為0.75pL/10pmol，dNTP為0.9nl/2.5mm，DNA聚合酶為0.2nL/2.5U4iL，10xbuffer為1.5pL含Mg2+15^iM，模板DNA為洗滌過的半徑為1.2mm8的FTA試紙小圓盤，雙純水為10.9nL;產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.3SSCP檢測0.7^1PCR產(chǎn)物和6^1的上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)、10%甘油]，95'C變性5min，迅速插入冰中使之保持變性。樣品在14。/。非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr:Bis=29:1)中電泳。電泳結(jié)束后,進行銀染顯帶。銀染法顯色后拍照。2.結(jié)果與分析2.1SSCP檢測辨型與耐寒性評估SSCP分析配膠表2.14%聚丙烯酰胺凝膠配置表214%聚丙烯酰胺凝膠配置14%聚丙烯酰胺凝膠04)40%聚丙烯酰胺10xTBE10。/o過硫酸胺aTEMED雙蒸水33ml5.5ml660pl66(a170mla過硫酸胺需要新鮮配制將擴增產(chǎn)物每管加入IO(HU上樣緩沖液(95%甲酰胺，20mMEDTA，0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯菁)，置于加熱板95'C加熱5mins，之后迅速轉(zhuǎn)置碎冰上，上樣于14%的聚丙烯酰胺凝膠(16x18cm,l.Omm夾片，34孔梳子)包括0.5xTBE[44.5mMTris，44.5mM硼酸，lmMEDTA(PH8.0)]。樣品在ProteanIIXicell(Bio-Rad,HerculesCA,USA)200v下電泳22hrs,電泳在22t:恒溫室內(nèi)25'C水浴下進行。電泳完畢后，將膠片從電泳槽中取出，放入預(yù)先配制好的固定液[0.P/。AgNO3+固定液(10n/。醋酸+25n/。乙醇)]靜置4mins后用真空泵吸盡殘液，用雙蒸水洗滌30s，吸盡殘液。加入染色液(2Q/。NaOH+lml40Q/。甲醛)，大約等待15mins后條帶便會顯現(xiàn)出來，吸盡殘液，加入固定液，將膠片小心轉(zhuǎn)置于紙上，即可讀膠。等位基因辨型。根據(jù)所得條帶對膠片進行辨型，其中標(biāo)準(zhǔn)樣品及帶型為耐寒性測試標(biāo)準(zhǔn)物。不同等位基因型所代表的藏綿羊耐寒性級數(shù)見表3:表3不同ADBR3等位基因型所代表的藏綿羊耐寒性級數(shù)等位基因Genbank登錄號_分級(1-5分)AAF3142001BAF3142013CAF3142022DAF314203'5EAF3142041FAF3142054GDQ2679395HDQ2694973IEU37畫2IEU3714043數(shù)據(jù)錄入與轉(zhuǎn)換將所得SSCP等位基因型進行可能的表型值轉(zhuǎn)換，如AD基因型可相應(yīng)轉(zhuǎn)換為1，5表型值。根據(jù)圖3可知，分值為1時羔羊凍死風(fēng)險最低，在l-3之間為低凍死風(fēng)險，3-5之間為高凍死風(fēng)險，5為最高凍死風(fēng)險。SSCP檢測辨型與耐寒性評估見表4表4甘加羊耐寒性評估表品種個體編號ADRB3等位基因型耐寒性風(fēng)險值Tibet-GJS1Tibet-GJS2Tibet-GJS3Tibet-GJS4Tibet-GJS5Tibet-GJS6Tibet-GJS7Tibet-GJS8Tibet-GJS9Tibet-GJS10Tibet-GJS11Tibet-GJS12Tibet-GJS13Tibet-GJS14Tibet-GJS15Tibet-GJS16Tibet-GJS17Tibet-GJS18Tibet-GJS20Tibet-GJS19Tibet-GJS21Tibet-GJS22Tibet-GJS23Tibet-GJS24Tibet-GJS25Tibet-GJS26Tibet-GJS27Tibet-GJS28Tibet-GJS29Tibet-GJS30Tibet-GJS31Tibet-GJS32Tibet-GJS33Tibet-GJS34Tibet-GJS35Tibet-GJS36Tibet-GJS37Tibet-GJS38Tibet-GJS40Tibet-GJS41Tibet-GJS42Tibet-GJS43Tibet-GJS44EU3714053EU3714065EU3714071231CCGCACBFCCCCBFCCCBCCT.JFFBCCCCFCCECHCCCACCCCHTibet-GJS45CC2，2Tibet-GJS46CF2,4Tibet-GJS47CC2,2Tibet-GJS48CC2,2Tibet-GJS49CC2,2Tibet-GJS50CC2，2Tibet-GJS51CE2,1Tibet-GJS52CC2,2Tibet-GJS53AC1,2從結(jié)果中可以得知具體藏綿羊個體的耐寒性風(fēng)險值，其值為各等位基因風(fēng)險值的算術(shù)平均數(shù)，數(shù)字越高，凍死風(fēng)險越大。如第5號羊具有AA基因型分別具有1，l的風(fēng)險值，那么該羊只的凍死風(fēng)險值為(1+1)/2=1。實施例2:中國藏綿羊群體耐寒性多態(tài)性分析1.3統(tǒng)計分析方法序列的分析與比對利用軟件DNASTAR7.0完成，等位基因頻率的計算利用EXCEL2003進行，基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)由軟件POPGENE32(V1.32)進行計算。多態(tài)信息含量的計算由公式完成ffl附一l—m_式中pi—第i個等位基因的頻率；pj—第j個等位基因的頻率；m—該座位的等位基因數(shù)。2.4不同藏綿羊品種ADRB3等位基因頻率與基因多態(tài)性分析對中國藏綿羊群體中檢測出的12條ADRB3等位基因進行頻率分析(表5),等位基因C在甘加羊，歐拉羊，喬科羊，小尾寒羊和美利奴灘寒雜種羊中為優(yōu)勢等位基因，頻率分別達(dá)到了56.7%，66.7%，59.5%，47.7%和44.2%，在湖羊群體中優(yōu)勢等位基因為A達(dá)到了41.5c/。其次為等位基因C(30.9%);在中國藏綿羊群體中新發(fā)現(xiàn)的5條等位基因中等位基因I的頻率最高(2.1%)，等位基因G、H、J、K、L禾BM比例最低(0.1%-1.9%)。_表5中國藏綿羊群體ADRB3等位基因頻率(％)_等位基因~~甘加羊~iS~小尾寒羊美利奴雜種羊1"""5個中國藏綿羊群體遺傳多態(tài)性指標(biāo)見表6。由表6可知，中國5個藏綿羊群體共462只個體的PCR-SSCP結(jié)果表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，其中美利奴灘寒雜種羊，歐拉和喬科羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；從位點間雜合度來看，六個群體雜合度皆大于0.8，其中湖羊的雜合度最高(0.9629)，歐拉羊最低(0.8020);有效等位基因數(shù)(Ne):湖羊最大(26.9542)，歐拉羊最小(5.0505);位點間多態(tài)信息含量(PIC):美利奴灘寒雜種羊最高(0.6656)，歐拉羊最低(0.4506),除了歐拉羊群體，其余群體的PIC皆超過了0.5，^10q"0102430p00_02300020一2嚴(yán).o238500ooLc5o,cSCijcl016061000一7JJ03001000002.67:0989900000ABCDEFGHIGKLMll在ADRB3基因位點屬于中高度多態(tài)。表6中國藏綿羊群體乂D朋3基因座遺傳多態(tài)性指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述僅為本實用新型的較佳實施例，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，其特征是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4)，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。2.如權(quán)利要求l所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，其特征是在容器孔中還包括分別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)，10%過硫酸銨(7)，上樣變性緩沖液(6)，TEMED(8)，聚丙烯酰胺(9)。專利摘要本實用新型涉及動物基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及以藏綿羊耐寒性相關(guān)基因ADRB3基因的等位基因檢測試劑盒。一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4)，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。本實用新型的優(yōu)點是反應(yīng)靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養(yǎng)殖企業(yè)的藏綿羊的選種。可以檢測藏綿羊個體自身的耐寒性性狀，從而提高藏綿羊的耐寒性選育效率，有效提高群體耐寒性。文檔編號C12Q1/68GK201381324SQ2009201528公開日2010年1月13日申請日期2009年4月10日優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日發(fā)明者成述儒,方素櫟,果楊,羅玉柱,江胡申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)