專利名稱：一株近平滑假絲酵母菌菌株及其用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株近平滑假絲酵母菌菌株，特別是涉及一株可降解棉酚的近平滑假 絲酵母菌菌株，尤其涉及一種將其用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國棉花產(chǎn)量居世界第一位，每年棉籽餅粕產(chǎn)量約40(Γ500萬噸，占各類植物餅 粕總產(chǎn)量的30%。棉籽餅粕不僅資源豐富、分布廣泛，而且營養(yǎng)價值也很高，蛋白質(zhì)含量約 為40%，氨基酸組成也較好，但因棉籽仁和棉籽餅粕中含有棉酚等有毒物質(zhì)，其用途受到很 大限制，多年來我國的棉籽餅粕資源有80%左右都用作肥料還田，用作飼料蛋白資源的不 足30%，造成了蛋白質(zhì)的極大浪費。特別是近年來隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，世界范圍內(nèi)蛋白質(zhì)飼 料的缺乏日益突出。棉籽餅(粕)是當(dāng)前形勢下理想的替代豆粕的植物蛋白質(zhì)源，而且棉 籽餅粕價格低廉，現(xiàn)時售價不到大豆餅粕價格的一半，對棉籽餅粕的開發(fā)利用，無疑會給我 國畜牧業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟效益。棉酚，又叫棉毒素或棉籽醇，化學(xué)名為1，1，6，6，7，7-六羥基_5，5-二異丙基-3， 3- 二甲基-(2，2-聯(lián)二萘)-8，8- 二醛基，分子式為C3tlH3tlO8,分子量518. 5，是棉屬植物體內(nèi) 形成的一種黃色多酚型物質(zhì)。棉酚在生物體內(nèi)與酶和蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的可消化性， 破壞胃粘膜組織并引起消化功能紊亂，當(dāng)含量超過安全界限時會導(dǎo)致畜禽生長遲緩、中毒 及死亡。目前常用物理化學(xué)的方法對棉籽餅粕進行脫毒處理，游離棉酚的含量經(jīng)處理后雖 可降低，但處理后產(chǎn)品的營養(yǎng)成分遭到了嚴(yán)重破壞，動物的適口性和采食量也降低了。生物 發(fā)酵法是目前最具有發(fā)展前途的脫毒方法，生產(chǎn)成本低、脫毒效果也好，該方法在利用微生 物發(fā)酵降解棉酚的同時，也提高了粗飼料的營養(yǎng)價值。如何更好的處理棉籽餅粕，使棉粕這 一豐富的飼料蛋白資源更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)成為人們廣為關(guān)注的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一株近平滑假絲酵母 菌菌株以及將其用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，以便使棉粕更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)生 產(chǎn)。本發(fā)明的目的是提供一株能降解棉酚的近平滑假絲酵母。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是，一株近平滑假絲酵母菌菌 株，其具有序列表1所列RNA序列的16S rRNA基因，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，編號為CGMCC No. 3555。命名為Candida parapsilosis KDNOl 18 該近平滑假絲酵母菌菌株CGMCC No. 3555，其單細(xì)胞為卵圓形，不規(guī)則排列，細(xì)胞 大小為Ιμπι 3.0μπιΧ2.0μπι 5μπι，電鏡下可見有明顯的誕生痕和出芽痕，有芽體，兼 性厭氧。其生長最適溫度為28°C 30°C，不耐熱，適宜ρΗ在7.0左右。能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。上述的近平滑假絲酵母從棉粕堆下土樣中分離得到，種子培養(yǎng)基可用PDA或麥?zhǔn)?培養(yǎng)基，在MRS培養(yǎng)基上生長良好，最適生長溫度為30°C。本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是，將上述的近平滑假絲酵母菌菌株CGMCCNo. 3555 用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚。該近平滑假絲酵母能降解棉酚，在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā) 酵72h，可使棉籽餅粕中游離棉酚含量降低60%。一種近平滑假絲酵母菌菌株CGMCC No. 3555用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法， 包括下列內(nèi)容a、制備發(fā)酵菌種，制備過程如下1)斜面菌種將近平滑假絲酵母菌菌株劃線接種于加2%瓊脂的馬鈴薯葡萄糖瓊 脂培養(yǎng)基(PDA)，在30°C條件下培養(yǎng)12小時；斜面菌種在4°C冰箱中可保存3個月；2) 一級種子從斜面保藏菌種接種至新鮮PDA斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ；3) 二級種子從一級種子接種至液體麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，30°C通風(fēng)培養(yǎng)12h，裝液量 30ml/250ml,回旋式搖床 160r/min。b、將二級種子以添加葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕為發(fā)酵底物，在30°C條件下進行 72h的厭氧發(fā)酵對棉籽餅粕進行脫毒，然后再65°C下烘干培養(yǎng)物，得到優(yōu)質(zhì)的棉籽餅粕飼 料蛋白。在該棉籽餅粕中游離棉酚含量降低60%，同時菌體生長產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，能提高 發(fā)酵底料棉籽餅粕的品質(zhì)，從而使之成為優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白原料。上述的近平滑假絲酵母菌菌株CGMCC No. 3555用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方 法，其b步驟的具體內(nèi)容如下(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入 4份的葡萄糖、2份的玉米漿、0. 2份的KH2PO4和40 100份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)
酵培養(yǎng)基無需滅菌；(2)發(fā)酵培養(yǎng)在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中接入5 15份的二級種子，30°C條件下 厭氧培養(yǎng)72hr ；(3)發(fā)酵結(jié)束，65°C烘干培養(yǎng)物，得到棉籽餅粕飼料蛋白。本發(fā)明利用篩選培養(yǎng)的近平滑假絲酵母菌菌株CGMCC No. 3555，通過微生物發(fā)酵 的方法對棉籽餅粕進行發(fā)酵脫毒，相比以往的物理化學(xué)脫毒法，生物發(fā)酵的方法沒有破壞 棉籽餅粕的營養(yǎng)成分，同時菌體在生長過程中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，提高了棉籽餅粕的品 質(zhì)；由于采用固態(tài)厭氧發(fā)酵，生產(chǎn)設(shè)備和發(fā)酵工藝簡單；發(fā)酵底料不需要滅菌，生產(chǎn)成本低 廉
MTv ο我國是世界產(chǎn)棉大國，擁有豐富的棉籽餅粕資源，這是制備優(yōu)質(zhì)棉籽飼料蛋白的 原料。本發(fā)明可促進棉粕在飼料行業(yè)中的應(yīng)用，提高棉粕的利用率，緩解目前世界范圍內(nèi)蛋 白質(zhì)飼料原料缺乏的問題，對于提高資源利用率，降低飼料行業(yè)生產(chǎn)成本意義顯著。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1將棉粕堆下土樣中大量菌株接種在MRS平板中，經(jīng)多次篩選、培養(yǎng)，分離得到一株
4保藏編號為CGMCC No. 3555的近平滑假絲酵母菌菌株，其單細(xì)胞為卵圓形，不規(guī)則排列，細(xì) 胞大小為1 μ m 3. 0 μ mX 2. 0 μ m 5 μ m，電鏡下可見有明顯的誕生痕和出芽痕，有芽體， 兼性厭氧。其生長最適溫度為28°C 30°C，不耐熱，適宜pH在7.0左右。能利用葡萄糖 產(chǎn)酸產(chǎn)氣。菌株降解棉酚效果顯著，遺傳穩(wěn)定，經(jīng)其發(fā)酵后棉籽餅粕中游離棉酚含量降低 60%，不超過 0. 5g/kg。實施例2制備棉籽餅粕發(fā)酵菌種。1)斜面菌種使用PDA培養(yǎng)基，加2%瓊脂，劃線接種菌株CGMCCNo. 3555，在30°C 條件下培養(yǎng)12小時，斜面菌種可在4°C冰箱中保存3個月內(nèi)；2) 一級種子從斜面保藏菌種中轉(zhuǎn)接至新鮮PDA斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)12小時；3) 二級種子從一級種子取一環(huán)接種至液體麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，裝液量30ml/250ml，回 旋式搖床160r/min，在30°C條件下通風(fēng)培養(yǎng)12小時，即制成發(fā)酵菌種。實施例3 用固態(tài)厭氧發(fā)酵方法發(fā)酵棉粕。使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法為取40g經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，加入1. 6g的葡萄糖、 0. Sg的玉米漿、0. 08g的KH2PO4和24mL的水，混勻即可，發(fā)酵培養(yǎng)基無需滅菌。菌種的接種 量為4mL，30°C條件下厭氧培養(yǎng)72小時。發(fā)酵結(jié)束，65°C烘干培養(yǎng)物，經(jīng)粉碎后得到的優(yōu)質(zhì) 棉籽飼料蛋白可用作飼料添加劑。棉酚的檢測方法參照國標(biāo)GB13086-91“飼料中游離棉酚的測定方法”，發(fā)酵結(jié)束后 測得干燥后棉籽餅粕中殘余的游離棉酚小于0. 5g/kg。實施例4本實施例與實施例2的區(qū)別在于發(fā)酵培養(yǎng)基的配制不同，其余步驟一樣。本實施例的發(fā)酵培養(yǎng)基配制取40g經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，加入1. 6g的葡萄糖、 0. Sg的玉米漿、0. 04g的FeSO4和24mL的水，混勻發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后測得干燥后棉籽餅粕 中殘余的游離棉酚小于0. 5g/kg。序列表<110>青島康地恩生物科技有限公司<120> 一株近平滑假絲酵母菌菌株及其用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法<160>1<211>1112<212>16S rRNA<223> 近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)<400>1CAATTCCTTT AAGTTTCAGC CTTGCGACCA TACTCCCCCC AGAACCCAAA 50GACTTTGATT TCTCGTAAGG TGCCGATTGC GTCAATAAAA GAACAACAAC 100CGATCCCTAG TCAGCATAGT TTATGGTTAA GACTACGACG GTATCTGATC 150ATCTTCGATC CCCTAACTTT CGTTCTTGAT TAATGAAAAC GTCCTTGGTA 200AATGCTTTCG CAGTAGTTAG TCTTCAGTAA ATCCAAGAAT TTCACCTCTG 250
ACTACTGAATACTGATACCCCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGT300
CCTAGAAACCAACAAAATAGAACCATAACGTCCTATTCTATTATTCCATG350
CTAATATATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAG400
TAAAAGTCCTGGTTCGCCAAAAAGGCTAGCCAGAAGGAAAGGCTCGGCTG450
GGTCCAGTACGCATCAAAAAAGATGGACCGGCCAGCCAAGCCCAAGGTTC500
AACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTTTTGGAGCTG550
GAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTT600
AAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGAAAGGGCCCTG650
TATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGC700
GCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTC750
CGGAATCGAACCCTTATTCCCCGTTACCCGTTGAAACCATGGTAGGCCAC800
TATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCC850
AGCACAAGGCCATGCGATTCGAAAAGTTATTATGAATCATCAAAGAGCCC900
GAAGGCATTGATTTTTTATCTAATAAATACATCCCTTCCAAACAGTCGGG950
ATTTTAAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA1000
GGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCA1050
CTGTATAATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAG1100
CATATGACTACA1112
權(quán)利要求
一株近平滑假絲酵母菌菌株，其具有ID NO1所示的16S rRNA基因，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCCNo.3555。
2.將權(quán)利要求1所述的近平滑假絲酵母菌菌株用于棉籽餅粕發(fā)酵降解棉酚。
3. 一種將權(quán)利要求1所述的近平滑假絲酵母菌菌株用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方 法，包括下列內(nèi)容a、制備發(fā)酵菌種，制備過程如下1)斜面菌種將近平滑假絲酵母菌菌株劃線接種于加2%瓊脂的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基(PDA)，在30°C條件下培養(yǎng)12小時；斜面菌種在4°C冰箱中可保存3個月；2)一級種子從斜面保藏菌種接種至新鮮PDA斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ；3)二級種子從一級種子接種至液體麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，30°C通風(fēng)培養(yǎng)12h，裝液量 30ml/250ml,回旋式搖床 160r/min ；b、將二級種子以添加葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕為發(fā)酵底物，在30°C條件下進行72h 的厭氧發(fā)酵對棉籽餅粕進行脫毒，然后再65°C下烘干培養(yǎng)物，得到棉籽餅粕飼料蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的近平滑假絲酵母菌菌株用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法， 其b步驟的具體內(nèi)容如下(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基取一定量經(jīng)細(xì)粉碎的棉籽餅粕，在每100份棉籽餅粕中加入4份 的葡萄糖、2份的玉米漿、0. 2份的KH2PO4和40 100份的水，混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培 養(yǎng)基無需滅菌；(2)發(fā)酵培養(yǎng)在棉籽餅粕發(fā)酵培養(yǎng)基中接入5 15份的二級種子，30°C條件下厭氧 培養(yǎng)72hr ；(3)發(fā)酵結(jié)束，65°C烘干培養(yǎng)物，得到棉籽餅粕飼料蛋白。
全文摘要
一株近平滑假絲酵母菌菌株，其具有ID NO1所示的16S rRNA基因，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No.3555。一種將該近平滑假絲酵母菌菌株用于降解棉酚生產(chǎn)飼料蛋白的方法，包括a、制備種子；b、將種子以添加葡萄糖和玉米漿的棉籽餅粕為發(fā)酵底物，30℃條件下進行72h的厭氧發(fā)酵，再65℃下烘干得到棉籽餅粕飼料蛋白。本發(fā)明可促進棉粕在飼料行業(yè)中的應(yīng)用，提高棉粕的利用率，對于提高資源利用率，降低飼料行業(yè)生產(chǎn)成本意義顯著。
文檔編號C12N1/16GK101892166SQ20091021720
公開日2010年11月24日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者于俊堯, 周生飛, 柳紅艷, 蔡冬梅, 馬立周 申請人:青島康地恩生物科技有限公司