移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物模型制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明選用6~8周的雄性C57BL/6J小鼠作為供體，6~8周的雄性Balb/c小鼠作為受體，以環(huán)孢素A作為免疫抑制劑，構(gòu)建小鼠皮膚移植模型；皮膚移植術(shù)后第7天通過(guò)鼻孔將200ul的5×105CFU/ml白假絲酵母菌懸液滴入到腰背部皮膚移植術(shù)后小鼠的體內(nèi)，得到移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染的小鼠模型。本發(fā)明制備的小鼠模型更接近臨床患者移植術(shù)后真菌感染的實(shí)際發(fā)生情況，而且模型穩(wěn)定。此外，本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)單快捷，可一次性獲得大量穩(wěn)定的小鼠感染模型供科研人員進(jìn)行相關(guān)臨床問(wèn)題研究使用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物模型制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染 小鼠模型的構(gòu)建方法。 移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法

【背景技術(shù)】
[0002] 感染、排斥反應(yīng)和心腦血管疾病是當(dāng)前影響移植受體預(yù)后的主要原因。器官移植 患者因手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、術(shù)中出血多、術(shù)后服用免疫抑制劑等因素，造成術(shù)后患者免疫力低下， 感染發(fā)生率高，嚴(yán)重影響了患者的長(zhǎng)期生存率和生活質(zhì)量。
[0003] 移植受體機(jī)體免疫力與普通人群有著明顯的不同，其感染譜、感染特點(diǎn)、臨床表 現(xiàn)、診斷和治療上均存在較大的差異，這些因素均極大地制約我國(guó)器官移植受體感染并發(fā) 癥的治療效果。因此，我們需要建立相應(yīng)菌種的動(dòng)物感染模型，借以研究移植受體感染并發(fā) 癥的早期診斷技術(shù)及其防治方法，為進(jìn)一步改善移植受體的預(yù)后奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0004] 據(jù)楊春華等專(zhuān)家研究報(bào)道，肝移植術(shù)后患者的真菌感染率為13. 5%(120/886)，而 其死亡率高達(dá)70. 8%?？梢?jiàn)，器官移植術(shù)后患者真菌感染的診斷、治療、預(yù)防策略研究工作有 著極其重要的實(shí)際意義。白假絲酵母菌是人體常見(jiàn)的條件致病性真菌，約三分之二的器官 移植受體真菌感染由其引起，而其最主要的感染部位為肺部（占 73. 3%)。因此，建立器官移 植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染的動(dòng)物模型，對(duì)于開(kāi)展相關(guān)研究至關(guān)重要。
[0005] 小鼠是目前比較成熟的研究人類(lèi)疾病的模式動(dòng)物。小鼠繁殖快，基因型明確，子代 多。人類(lèi)對(duì)小鼠基因組的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，且其基因組和人類(lèi)90%同源，而其生理生化 和發(fā)育過(guò)程和人類(lèi)相似，所以人類(lèi)疾病的小鼠模型基本上可以真實(shí)模擬人類(lèi)疾病的發(fā)病過(guò) 程。因此，選擇小鼠作為建立該模型的模式生物具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。
[0006] 目前，常見(jiàn)的白假絲酵母菌小鼠感染模型采用的感染途徑為尾靜脈注射、生殖器 注射及灌胃。此類(lèi)感染方法雖然成熟，但是，其與器官移植術(shù)后患者的常見(jiàn)感染途徑及感染 部位有著明顯的不同，使得該感染模型不能很好地模擬臨床感染病人。不同的感染途徑，機(jī) 體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞群存在差異，這限制了上述感染模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。此外，現(xiàn) 有動(dòng)物感染模型的接菌量尚存在一定爭(zhēng)議，接菌量太小，感染模型不夠穩(wěn)定，接菌量太多， 與臨床實(shí)際感染發(fā)生情況不符合，因此，對(duì)于動(dòng)物感染模型的接菌量，還需要進(jìn)一步摸索和 權(quán)衡。
[0007] 此外，正常的成年小鼠機(jī)體免疫力較強(qiáng)，較難感染白假絲酵母菌，因此，建立相應(yīng) 的小鼠感染模型需要使用免疫抑制劑，而目前常用于建模的免疫抑制劑為環(huán)磷酰胺及可的 松。但是，環(huán)磷酰胺作為最常用的烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥物，具有骨髓抑制的副作用，將造成小 鼠白細(xì)胞數(shù)目顯著下降。而可的松醋酸鹽作為腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，因其副作用較多，目 前臨床已較少單獨(dú)用于抗排斥治療。因此，應(yīng)用這兩類(lèi)藥物作為免疫抑制劑建立的小鼠感 染模型與臨床實(shí)際有一定的差距。因此，該研究方向亟需建立一種與臨床實(shí)際情況更加接 近的小鼠感染模型，以進(jìn)一步推動(dòng)移植受體感染性疾病相關(guān)研究的開(kāi)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中白假絲酵母菌感染小鼠模型不 太接近臨床實(shí)際感染情況、未考慮移植因素等的缺陷，提供一種移植術(shù)后肺部白假絲酵母 菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 51. 選用6~8周的雄性C57BL/6J小鼠作為供體，6~8周的雄性Balb/c小鼠作為受體， 以環(huán)孢素 A作為免疫抑制劑，構(gòu)建皮膚移植小鼠模型； 52. 通過(guò)鼻孔滴入方式將200ul的lX105~lX106CFU/ml白假絲酵母菌懸液滴入到步 驟S1構(gòu)建成功的皮膚移植小鼠體內(nèi)，得到移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型。
[0010] 不同品系、周齡、性別小鼠的機(jī)體免疫應(yīng)答存在一定的差異，其對(duì)于同一移植物的 排斥時(shí)間亦有不同。因此，我們建立該小鼠感染模型，需要保證移植物能夠存活相當(dāng)一段時(shí) 間，使得我們有充分的時(shí)間開(kāi)展相關(guān)研究。因此，我們選用6-8周的雄性C57BL/6J小鼠作 為供體，6?8周的雄性Balb/c小鼠作為受體。
[0011] 建立相應(yīng)的小鼠感染模型需要使用免疫抑制劑，而目前常用于建模的免疫抑制劑 為環(huán)磷酰胺及可的松，而本發(fā)明選擇使用環(huán)孢素 A作為免疫抑制劑，其屬于鈣調(diào)神經(jīng)蛋白 抑制劑，通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖和多種淋巴因子產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)選擇性抑制免疫應(yīng)答，主要抑制 T淋巴細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)具有顯著的抑制作用，對(duì)體液免疫反應(yīng)也有一定的抑制作用， 可防止排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)也在一定程度上抑制機(jī)體對(duì)病原體的抵御和清除功能。其優(yōu) 點(diǎn)為副作用小，更接近臨床實(shí)際。所述環(huán)孢素 A的用量根據(jù)小鼠的體重來(lái)計(jì)算，給予小鼠 15~30毫克/千克/天，直至小鼠皮膚排斥或?qū)嶒?yàn)結(jié)束為止。
[0012] 根據(jù)研究人員的研究目的或技術(shù)特點(diǎn)不同，本發(fā)明可以采用腰背部皮膚移植、尾 部皮膚移植或耳朵皮膚移植來(lái)構(gòu)建小鼠模型。但不同部位的供體皮膚，其排斥反應(yīng)發(fā)生的 時(shí)間、手術(shù)操作的技術(shù)難點(diǎn)等并不一致。
[0013] 開(kāi)展移植受體感染性疾病相關(guān)研究，需要能夠在同一時(shí)間獲得足夠數(shù)量的感染動(dòng) 物模型，以盡量減少動(dòng)物批次、時(shí)間、體重、狀態(tài)等對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的千擾。因此，作為優(yōu)選的操 作，我們選擇小鼠腰背部皮膚移植模型作為基礎(chǔ)，此模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、手術(shù)器械、條件 要求簡(jiǎn)單，易于各研究中心開(kāi)展；2、手術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，手術(shù)時(shí)間短，便于在短時(shí)間內(nèi)獲得 較多動(dòng)物模型；3、術(shù)后小鼠恢復(fù)快，移植物存活情況易于觀察；4、1只供體C57BL/6J小鼠可 以供皮給6?9只Balb/c小鼠，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，相對(duì)減少了術(shù)后小鼠的個(gè)體差異。 [0014] 優(yōu)選地，S2所述鼻孔滴入時(shí)，不可同時(shí)向兩側(cè)鼻孔滴入真菌懸液，以免造成小鼠窒 息，此外，勿將真菌懸液滴入小鼠唇瓣及口腔。
[0015] 所述真菌懸液的接入量太多，小鼠的肺部容積不夠，無(wú)法全部滴入，而且滴入的操 作過(guò)程時(shí)間太長(zhǎng)，小鼠容易動(dòng)，造成液體滴到周?chē)课?。接入量太少，需要接菌液的濃度?越高，操作帶來(lái)的誤差可能就越大，因?yàn)槊繐p失lul，其內(nèi)含有的菌量就越多。另外，接入真 菌量較小的話，有可能模型不穩(wěn)定；量太大的話，又與臨床實(shí)際差距較大。因此，優(yōu)選地，所 述白假絲酵母菌懸液的濃度應(yīng)在IX 105?IX 106 ;最優(yōu)選地，S2所述白假絲酵母菌懸液濃度 為 5X105CFU/ml。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明以鼻孔滴入的方式使白假絲酵母菌感染小鼠肺部，得到的感染模型更接近移植 術(shù)后真菌感染的實(shí)際情況，而且模型穩(wěn)定，能夠滿足相關(guān)科學(xué)研究開(kāi)展的需要。另外，本發(fā) 明在免疫抑制劑的選用上，與時(shí)俱進(jìn)地選用環(huán)孢素 A作為免疫抑制劑，其優(yōu)點(diǎn)為更能真實(shí) 地模擬臨床感染患者的免疫狀態(tài)，使研究成果較易于實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。
[0017] 本發(fā)明以皮膚移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型作為移植受體感染性疾 病相關(guān)研究開(kāi)展的基礎(chǔ)，可以滿足在同一時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的感染動(dòng)物模型的需求，以 盡量減少動(dòng)物批次、時(shí)間、體重、狀態(tài)等對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1.供體皮片夾起操作。
[0019]圖2.供體皮片剪切操作。
[0020]圖3·剪下的供體皮片處理操作。
[0021]圖4.受體皮床消毒。
[0022]圖5.確定受體皮床區(qū)域。
[0023]圖6·剪切受體皮一條邊界。
[0024]圖7·剪切受體皮其余三條邊界。
[0025]圖8.移植皮膚縫合。
[0026]圖9_移植皮膚包扎。
[0027]圖1〇·術(shù)后第4天情況。
[0028]圖11.術(shù)后排斥反應(yīng)判斷。
[0029]圖12.術(shù)后第7天、第21天情況。
[0030]圖13·小鼠體重變化。
[0031]圖14·排毒后白細(xì)胞比例變化。
[0032]圖15.排毒后中性粒細(xì)胞比例變化。
[0033]圖16.排毒后淋巴細(xì)胞比例變化。
[0034]圖Π ·排毒后單核細(xì)胞比例變化。
[0035]圖18.排毒后嗜酸性粒細(xì)胞比例變化。
[0036]圖19.排毒后嗜堿性粒細(xì)胞比例變化。
[0037]圖20.肺部白假絲酵母菌DNA拷貝數(shù)變化。
[0038]圖21·腎部白假絲酵母菌DNA拷貝數(shù)變化。
[0039]圖22.肺組織載菌量變化。
[0040]圖23.腎組織載菌量變化。
[0041]圖24· 5X103CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第1天肺部病理變化（HE染色，左上： 5倍，右上：10倍，左下：2〇倍，右下：4〇倍)。
[0042]圖25. 5X103CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第3天肺部病理變化（HE染色，左上： 5倍，右上：10倍，左下：2〇倍，右下：4〇倍)。
[0043]圖26. 5 X l〇4CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第1天肺部病理變化（HE染色，左上： 5倍，右上：10倍，左下：2〇倍，右下：4〇倍)。
[0044]圖27· 5 X l〇4CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第3天肺部病理變化（HE染色，左上： 5倍，右上：1〇倍，左下：20倍，右下：40倍)。
[0045]圖28. 5X l〇5CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第1天肺部病理變化（HE染色，左上· 5倍，右上：1〇倍，左下：20倍，右下：40倍)。 ' '
[0046]圖29. 5X10sCFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第3天肺部病理變化（冊(cè)染色，左上： 5倍，右上：1〇倍，左下：20倍，右下：40倍)。 '
[0047]圖30_ l〇5CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第14天肺部病理變化（冊(cè)染色，左 上：5倍，右上：1〇倍，左下：20倍，右下：40倍)。 '
[0048]圖31· 5X 105CFU/ml濃度組小鼠鼻腔接毒后第14天肺部病理變化(六胺銀染色， 左上：5倍，右上：1〇倍，左下：20倍，右下：4〇倍)。 '
[0049] 圖32.各組小鼠皮膚移植物存活曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0050]下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā) 明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0051] 實(shí)施例1 一、小鼠腰背部皮膚移植模型的建立 以下操作需要在SPF級(jí)環(huán)境中進(jìn)行，相關(guān)實(shí)驗(yàn)用品需經(jīng)相應(yīng)程序(高溫高壓、噴75%酒 精及紫外線照射）處理后進(jìn)入屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需提前行檢驗(yàn)檢疫，待其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后 方可使用。
[0052] 1、物品準(zhǔn)備：眼科剪、無(wú)齒鑷、彎鑷、游標(biāo)卡尺、標(biāo)記筆、持針器、玻璃平皿、l〇ml注 射器、lml注射器、剃毛器、小號(hào)角針、絲線、凡士林紗、無(wú)菌紗、醫(yī)用繃帶、醫(yī)用膠布、電子天 平、15ml無(wú)菌離心管。
[0053] 2、藥物準(zhǔn)備：麻醉藥、75%醫(yī)用酒精、碘酊、無(wú)菌生理鹽水、環(huán)孢素 A。
[0054] 3、小鼠選擇：選用6?8周的雄性C57BL/6J小鼠作為供體，6?8周的雄性Balb/c小 鼠作為受體。
[0055] 4、制備供體皮片： (1) 供體鼠用頸椎脫臼方法處死后，用剃毛器備皮，范圍為雙上肢、雙下肢之間的背部 皮膚。備皮范圍盡量大，毛發(fā)盡量剪短，但注意不要弄破背部皮膚，若有刮破者，則不適于用 作移植皮片； (2) 用碘酊、75%酒精消毒供皮區(qū)，消毒范圍應(yīng)大于剪毛范圍，并用無(wú)菌紗布擦干供皮區(qū) 的消毒液； (3) 水平握持無(wú)齒鑷，利用其將同側(cè)上下肢之間的皮膚水平夾起,注意使部分皮膚均勻 突出于無(wú)齒鑷上緣，用組織剪將無(wú)齒鑷上緣均勻突出的皮膚剪去，具體操作見(jiàn)圖1 ; (4) 用同樣方法剪去另一側(cè)上下肢、雙上肢、雙下肢之間的皮膚，在供皮區(qū)的邊緣形成 一個(gè)" 口"字的切緣，再用無(wú)齒鑷夾起其中一個(gè)邊角，用眼科剪剪斷其皮下組織、筋膜，注意 不要損傷供皮，分離下來(lái)的供皮放入事先準(zhǔn)備的含有無(wú)菌生理鹽水的平皿中，具體操作見(jiàn) 圖2 ; (5) 將剪下的大塊背部皮膚翻轉(zhuǎn)，用無(wú)齒鑷夾住供皮一角固定，用彎鑷將皮下脂肪、結(jié) 締組織夾除，要求盡量剃除干凈，否則將會(huì)影響移植后皮片的存活，一般以肉眼看到供體皮 片上無(wú)殘留的脂肪、血管、筋膜為準(zhǔn)，必要時(shí)更換平皿中的無(wú)菌生理鹽水，具體操作見(jiàn)圖3 ; (6)將供體皮膚剪成0. 8cmX0. 8cm大小的正方形皮片，置于含無(wú)菌生理鹽水的平皿中 備用。
[0056] 5、準(zhǔn)備受體皮床： (1) 受體鼠稱(chēng)重后用麻醉藥腹腔注射，麻醉成功后，用剃毛器在其右側(cè)腰背部剪毛備 皮，范圍約2cmX 2cm ; (2) 用碘酊、75%酒精消毒備皮區(qū)，消毒范圍應(yīng)大于剪毛范圍，并用無(wú)菌紗布擦干備皮區(qū) 的消毒液，具體操作見(jiàn)圖4 ; (3) 用游標(biāo)卡尺及標(biāo)記筆在備皮區(qū)內(nèi)標(biāo)記預(yù)定的正方形皮床區(qū)，大小約icmx lcm，皮床 區(qū)以盡量靠近背部為宜(便于包扎固定)，但皮床區(qū)上界不超過(guò)雙上肢連線，內(nèi)側(cè)界不超過(guò) 背部中線，外側(cè)界不超過(guò)右側(cè)腋后線，具體操作見(jiàn)圖5 ; (4) 水平握持無(wú)齒鑷，利用其水平夾起皮床區(qū)一側(cè)邊界皮膚，注意使部分皮膚均勻突出 于無(wú)齒鑷上緣，用組織剪將均勻突出于無(wú)齒鑷上緣的表淺皮膚剪去，切記剪皮要表淺，一般 以無(wú)齒鑷上緣皮膚的皮緣下1mm處剪皮為宜，具體操作見(jiàn)圖6 ; (5) 用同樣方法剪去皮床區(qū)其余三條邊界的皮膚,在皮床區(qū)邊緣形成一個(gè)"口，，字的切 緣，再用鑷子夾取皮床區(qū)其中一個(gè)較表淺的邊角，用另一把鑷子協(xié)助將皮下結(jié)締組織剝離， 注意勿損傷皮下的小血管(切忌使用剪刀剪皮下組織，否則容易損傷血管),可見(jiàn)皮下清晰 的血管床，具體操作見(jiàn)圖7。
[0057] 6、皮膚移植及包扎： (1)將制備好的供體皮片逆毛發(fā)方向置于皮床區(qū)中部，皮片四個(gè)角用小號(hào)角針及絲線 各縫一針固定，并注意供受體皮膚是否對(duì)接好，有無(wú)皮膚重疊或縫隙過(guò)大，并給與相應(yīng)的處 理；具體操作見(jiàn)圖8。
[0058] (2)在移植皮片上方覆蓋一層1. 5cmX 1· 5cm凡士林紗，再加蓋一層無(wú)菌紗布，用 一手指稍加壓固定無(wú)菌紗布，將小鼠頭側(cè)抬起，使其胃腸等器官大部分下垂至下腹部，然后 用醫(yī)用彈性繃帶環(huán)繞一圈，加壓包扎，松緊適當(dāng)（以既不影響小鼠心肺功能，又不至于容易 脫落為宜)，最后再用膠布環(huán)繞一圈固定，具體操作見(jiàn)圖9。
[0059] (3)將包扎好的小鼠仰臥位置于電熱毯上或恒溫箱內(nèi)復(fù)蘇，一般以37?為宜，待其 能夠自主翻身為俯臥位后，轉(zhuǎn)移至潔凈鼠籠內(nèi)。7、注射免疫抑制劑：小鼠自皮膚移植日起， 每日腹腔注射環(huán)孢素 A (CsA;Novartis Pharma Ltd;Germany;3〇mg/kg/day)，直至小鼠皮 膚排斥或?qū)嶒?yàn)結(jié)束為止，注意在腹腔注射藥物前用 75%酒精消毒注射部位皮膚。
[0060] 8、拆除敷料及觀察： (1) 術(shù)后24小時(shí)注意觀察小鼠的活動(dòng)情況，若小鼠出現(xiàn)眼睛緊閉、不活動(dòng)、尾巴強(qiáng)直等 痛苦不適的表現(xiàn)，給與調(diào)整繃帶松緊度、腹腔注射止痛藥物等處理，若小鼠繃帶脫落，應(yīng)重 新消毒術(shù)口并重新包扎，否則移植皮膚易因新生血管未及供給、水分蒸發(fā)過(guò)多而干結(jié)； (2) 皮膚移植術(shù)后48小時(shí)，拆除小鼠術(shù)口敷料，若敷料與術(shù)口有粘連，不要用力撕脫， 待其術(shù)口愈合后，可自行連同痂皮一起脫落； (3) 每日注射免疫抑制劑前觀察皮膚移植物情況：術(shù)口有無(wú)愈合，移植物有無(wú)千結(jié)、脫 落、排斥，有無(wú)新生毛發(fā)等；術(shù)后第4天的情況見(jiàn)圖10。 <
[0061] (4)皮膚移植物排斥判斷標(biāo)準(zhǔn):A:顏色呈黑色;B:瘢痕結(jié)痂；C:壞死脫落；D:皮膚 移植物小于原皮片的20%。術(shù)后排斥反應(yīng)判斷見(jiàn)圖11。
[0062] (5)移植術(shù)后5?7天，小鼠術(shù)口基本愈合，可剔除手術(shù)失敗（因皮床血管受損嚴(yán)重 或供體皮片尚有脂肪、筋膜等未剔除干凈）致移植皮膚千結(jié)脫落者，選取皮膚移植成功的小 鼠轉(zhuǎn)入感染實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。術(shù)后第7天、第21天的情況見(jiàn)圖I 2。
[0063] 二、肺部白假絲酵母菌感染模型的建立 將上述步驟一成功制備得到的皮膚移植小鼠轉(zhuǎn)入感染實(shí)驗(yàn)室，建立移植術(shù)后肺部白假 絲酵母菌感染小鼠模型。以下操作需要在感染實(shí)驗(yàn)室（P3)內(nèi)進(jìn)行，具體操作應(yīng)在相應(yīng)級(jí)別 的生物安全柜中進(jìn)行，相關(guān)實(shí)驗(yàn)用品需要提前經(jīng)相應(yīng)程序(高溫高壓、噴75%酒精及紫外線 照射)處理后進(jìn)入屏障環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需提前轉(zhuǎn)入相應(yīng)的隔離籠具內(nèi)。菌種保存液的菌量需 要提前測(cè)定，接種前2小時(shí)復(fù)蘇，并用無(wú)菌生理鹽水作梯度稀釋?zhuān)唧w菌量測(cè)定、菌種復(fù)蘇 及梯度復(fù)蘇方法請(qǐng)查考相關(guān)書(shū)籍、文獻(xiàn)。
[0064] 1、器械及用品準(zhǔn)備：麻醉藥、lml注射器、75%醫(yī)用酒精、200ul槍頭、200ul移液器、 5X 103CFU/ml、5X 104CFU/ml、5X 105CFU/ml 白假絲酵母菌懸液。
[0065] 2、小鼠稱(chēng)重，常規(guī)消毒注射部位后用麻醉藥腹腔注射，待其翻身反射消失后待 用； 3、 試驗(yàn)分組：取20只上述步驟一制備得到的皮膚移植成功的小鼠，5只一組，分為四 組，四組分別為5X103CFU/ml濃度組、5X10 4CFU/ml濃度組、5X10sCFU/ml濃度組和空白 對(duì)照組（空白對(duì)照組為吸取200ul無(wú)菌生理鹽水通過(guò)小鼠鼻孔滴入)。用移液器分別吸取 200ul的5X10 3CFU/ml、5X104CFU/ml、5X105CFU/ml白假絲酵母菌懸液(每次吸液前注意 吹打搖勻懸液)，左手固定小鼠呈仰臥位，右手持移液器，將槍頭輕輕靠在小鼠一側(cè)鼻孔上， 觀察小鼠有無(wú)躲避反應(yīng)，如有，則需要等待數(shù)分鐘后再重復(fù)操作，或加用麻醉藥； 4、 觀察小鼠呼吸頻率及節(jié)奏，待小鼠吸氣時(shí)，按壓移液器排出部分液體(約50ul)，觀 察液體隨著小鼠吸氣而進(jìn)入鼻孔，注意小鼠呼氣時(shí)是否將液體排出鼻孔，若無(wú)排出液體或 者氣泡，則重復(fù)上述操作，直到所有懸液滴入小鼠鼻孔，若有排出液體或者氣泡，則用原移 液器吸回液體，稍等片刻后重復(fù)操作，注意不可同時(shí)向兩側(cè)鼻孔滴入液體，以免造成小鼠窒 息，此外，勿將菌液滴入小鼠唇瓣及口腔； 5、 保持小鼠頭高尾低30飛0秒，將小鼠仰臥位置于復(fù)溫臺(tái)，待其蘇醒后轉(zhuǎn)移入相應(yīng)籠 具內(nèi)。
[0066] 6、模型檢驗(yàn)與相關(guān)參數(shù)：本實(shí)驗(yàn)組在摸索接菌量的過(guò)程中設(shè)置了 5X103CFU/ml、 5X 104CFU/ml、5X 105CFU/ml三個(gè)濃度組，監(jiān)測(cè)了各組小鼠體重、外周血計(jì)數(shù)的變化，并在接 菌后特定時(shí)間點(diǎn)采集小鼠肺、腎、外周血進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，包括Q-PCR、載菌量及病理切片，同 時(shí)，我們還比較觀察了接菌組與空白對(duì)照組小鼠皮膚移植物的存活時(shí)間。具體采樣方法及 相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)參考本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)方法。
[0067] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、空白對(duì)照組與5X l〇5CFU/ml組小鼠體重變化情況如表1和圖13所示，圖13中*代 表兩組小鼠體重t檢驗(yàn)p值小于〇· 05,說(shuō)明兩組小鼠體重的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0068] 表1.小鼠體重變化

【權(quán)利要求】
1·移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步 驟： S1.選用6 8周的雄性C57BL/6J小鼠作為供體，6?8周的雄性Balb/c小鼠作為受體， 以環(huán)孢素 A作為免疫抑制劑，構(gòu)建皮膚移植小鼠模型； ' S2·通過(guò)鼻孔滴入的方式將200ul的lXi〇5~ixi〇6CFU/ml白假絲酵母菌懸液滴入到 步驟S1構(gòu)建成功的皮膚移植小鼠體內(nèi)，得到移植術(shù)后肺部白假絲酵母菌感染的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，S1所述環(huán)孢素 A的用量 為15 30暈克/千克/天，直至小鼠皮膚排斥或?qū)嶒?yàn)結(jié)束為止。
3·根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，S1所述皮膚移植為腰背 部皮膚移植、尾部皮膚移植或耳朵皮膚移植。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，S1所述皮膚移植為腰背 部皮膚移植。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，S2所述鼻孔滴入時(shí)，不可 同時(shí)向兩側(cè)鼻孔滴入真菌懸液，以免造成小鼠窒息，此外，勿將真菌懸液滴入小鼠唇瓣及口 腔內(nèi)。
6·根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，S2所述白假絲酵母菌懸 液濃度為5X10sCFU/ml。
【文檔編號(hào)】A61D1/00GK104189020SQ201410391899
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】何曉順, 郭志勇, 張鈺, 楊安力, 吳玉娥, 黃韌 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院