專利名稱：一種大環(huán)糊精的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種大環(huán)糊精的制備方法，屬于食品工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大環(huán)糊精具有復雜的空腔結(jié)構(gòu)，并且大環(huán)糊精的疏水內(nèi)腔具有一定的柔性，可以隨著客體分子的形狀發(fā)生相應的變化，對不同大小的客體分子具有不同的俘獲能力。此外，大環(huán)糊精具有高度的水溶性、低黏度和不回生等特性，因此可以用做食品中不良雜味的去除，作為食品添加劑用于抗回生，或者用于藥物載體等等，具有巨大的應用前景。可以預見大環(huán)糊精將具有巨大的經(jīng)濟價值。本發(fā)明為實現(xiàn)大環(huán)糊精的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了很好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大環(huán)糊精的制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種制備大環(huán)糊精的方法，以土豆直鏈淀粉為底物，經(jīng)4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶作用、復合酶綜合處理得到聚合度范圍為18-55的大環(huán)糊精，步驟為
1) 土豆直鏈淀粉的提取稱取10.0g土豆淀粉，加入少量無水乙醇浸潤，加入370mL的0. 5mol/L氫氧化鈉溶液，并置于沸水中加熱30min左右，溶液分散均勻后冷卻。低速離心除去不溶物，用2mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性。加入200mL體積比為3 : 1的正丁醇-異戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，無結(jié)團狀。冷卻至室溫。于2-4t:的冰箱中放置24h，取出，進行以下操作以6000轉(zhuǎn)/min的離心力下高速離心20min。將上述沉淀物全部轉(zhuǎn)移至120mL的正丁醇與水的體積比為1 : 9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中攪拌直至溶液分散透明，再逐漸冷卻至室溫，放入2-4t:的冰箱中24h，取出，離心，將得到的沉淀物重復所述操作共3次后，用無水乙醇浸泡5-6次，并于室溫下真空干燥得到土豆直鏈淀粉。 2)大環(huán)糊精的制備稱取土豆直鏈淀粉4g，加入90X的二甲亞砜100mL，沸水浴中加熱使其溶解；向該淀粉體系中加入30mL Tris-HCL緩沖溶液(pH7. 5， 0. 05mol/L)，并調(diào)節(jié)溶液pH為7. 5 ;加入4- a -糖基轉(zhuǎn)移酶純酶液4mL (40U/mL)，于75。C下反應8h，沸水浴中加熱20min終止反應；4°C 、 10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集反應液，向反應液中加入P _淀粉酶(30U/g淀粉)去除未反應的直鏈淀粉，3(TC反應4h后沸水浴加熱10min終止反應；離心去除沉淀后再加入糖化酶(100U/mL)和脫支酶(30U/mL)各2mL，5(TC反應6h后沸水浴加熱10min終止反應，4°C 、 10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集上清，加入無水乙醇使得乙醇質(zhì)量濃度達到60%， 10000轉(zhuǎn)/min離心10min收集沉淀，將沉淀凍干即得經(jīng)過初步純化的大環(huán)糊精。 3)產(chǎn)物的鑒定用高效陰離子色譜(HPAEC)對大環(huán)糊精樣品進行了鑒定，操作如下 稱取0. Olg大環(huán)糊精樣品，用超純水溶解至lmL制成10mg/mL的樣品溶液，上樣lOii L，采用的色譜條件是Carbo PacTM PA-200col咖n(3*250mm);柱溫為30°C ;流速為0. 5mL/min ;檢測器采用電化學檢測器；洗脫條件采用醋酸鈉梯度洗脫法，程序如下0-5min醋酸鈉濃度達到70m mol/L，氫氧化鈉濃度達到96. 5m mol/L， 5_45min醋酸鈉濃度達到320m mol/L，氫氧化鈉濃度達到72. 5m mol/L。在此梯度洗脫程序下，大環(huán)糊精得到有效分離，經(jīng)與標準大環(huán)糊精進行對比，制備得到大環(huán)糊精的聚合度范圍為18-55之間。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法首次實現(xiàn)了大環(huán)糊精的制備，并且對其進行了初步的純化及鑒定。大環(huán)糊精獨特的包埋特性使得其具有巨大的應用前景，本發(fā)明為實現(xiàn)大環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。


圖1樣品大環(huán)糊精的高效陰離子色譜圖。
具體實施例方式
實施例l 1、土豆直鏈淀粉的提取稱取10.0g土豆淀粉，加入少量無水乙醇浸潤，加入370mL的0. 5mol/L氫氧化鈉溶液，并置于沸水中加熱30min左右溶液分散均勻后冷卻。低速離心除去不溶物，用2mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性。加入200mL體積比為3 : 1的正丁醇_異戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，無結(jié)團狀。冷卻至室溫。于2-4°C的冰箱中放置24h，取出，以6000轉(zhuǎn)/min的離心力下高速離心20min。將上述沉淀物全部轉(zhuǎn)移至120mL的正丁醇與水的體積比為1 : 9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中攪拌直至溶液分散透明，再逐漸冷卻至室溫，放入2-4t:的冰箱中24h，取出，離心，將得到的沉淀物重復上述操作3次后用無水乙醇浸泡5-6次，并于室溫下真空干燥得到土豆直鏈淀粉。 2、大環(huán)糊精的制備稱取土豆直鏈淀粉4g，加入質(zhì)量濃度90X的二甲亞砜100mL，沸水浴中加熱使其溶解；向該淀粉體系中加入30mL Tris-HCl緩沖溶液(pH7. 5，0. 05mo1/L)，并調(diào)節(jié)溶液pH為7. 5 ;加入4- a -糖基轉(zhuǎn)移酶純酶液4mL(40U/mL)，于75。C下反應8h，沸水浴中加熱20min終止反應；4°C、 10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集反應液，向反應液中加入P _淀粉酶(30U/g淀粉)去除未反應的直鏈淀粉，3(TC反應4h后沸水浴加熱10min終止反應；離心去除沉淀后再加入糖化酶(100U/mL)和脫支酶(30U/mL)各2mL， 5(TC反應6h后沸水浴加熱10min終止反應，4°C 、 10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集上清，加入無水乙醇使得乙醇質(zhì)量濃度達到60%， 10000轉(zhuǎn)/min離心10min收集沉淀，將沉淀凍干即得經(jīng)過初步純化的大環(huán)糊精。 3.產(chǎn)物的鑒定用高效陰離子色譜(HPAEC)對大環(huán)糊精樣品進行了鑒定，具體操作如下 稱取0. Olg大環(huán)糊精樣品，用超純水溶解至lmL制成10mg/mL的樣品溶液，上樣10ii L，采用的色譜條件是Carbo PacTM PA-200col咖n(3*250mm);柱溫為30°C ;流速為0. 5mL/min ;檢測器采用電化學檢測器；洗脫條件采用醋酸鈉梯度洗脫法，具體程序如下0-5min醋酸鈉濃度達到70m mol/L，氫氧化鈉濃度達到96. 5m mol/L， 5-45min醋酸鈉濃度達到320m mol/L，氫氧化鈉濃度達到72. 5m mol/L。
制備所得大環(huán)糊精樣品是含有不同聚合度的環(huán)糊精的混合物。利用HPAEC(高效陰離子交換色譜)對不同聚合度環(huán)糊精進行了分離鑒定，結(jié)果如圖l所示。從圖l可以看出，樣品大環(huán)糊精的聚合度范圍和標樣大環(huán)糊精的聚合度相似，都為20-50之間。
權(quán)利要求
一種大環(huán)糊精的制備方法，其特征在于，以土豆直鏈淀粉為底物，經(jīng)4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶作用、復合酶綜合處理得到聚合度范圍為18-55的大環(huán)糊精，步驟為1)土豆直鏈淀粉的提取稱取10.0g土豆淀粉，加入少量無水乙醇浸潤，加入370mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液，并置于沸水中加熱30min，溶液分散均勻后冷卻，低速離心除去不溶物，用2mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，加入200mL體積比為3∶1的正丁醇-異戊醇的混合液，在沸水中水浴20-30min，使溶液清澈透明，無結(jié)團狀，冷卻至室溫，于2-4℃的冰箱中放置24h，取出，進行如下操作以6000轉(zhuǎn)/min離心20min，將沉淀物全部轉(zhuǎn)移至120mL的正丁醇與水的體積比為1∶9的正丁醇水溶液中，然后置于沸水浴中攪拌直至溶液分散透明，再逐漸冷卻至室溫，放入2-4℃的冰箱中24h，取出，離心，將得到的沉淀物重復所述操作共3次后，用無水乙醇浸泡5-6次，并于室溫下真空干燥得到土豆直鏈淀粉；2)大環(huán)糊精的制備稱取土豆直鏈淀粉4g，加入90％的二甲亞砜100mL，沸水浴中加熱使其溶解；向該淀粉體系中加入pH 7.5，0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液30mL，并調(diào)節(jié)溶液pH為7.5；加入40U/mL的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶純酶液4mL，于75℃下反應8h，沸水浴中加熱20min終止反應；4℃、10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集反應液，向反應液中加入30U/g淀粉的β-淀粉酶去除未反應的直鏈淀粉，30℃反應4h后沸水浴加熱10min終止反應；離心去除沉淀后再加入100U/mL的糖化酶和30U/mL的脫支酶各2mL，50℃反應6h后沸水浴加熱10min終止反應，4℃、10000轉(zhuǎn)/min離心10min后收集上清，加入無水乙醇使得乙醇質(zhì)量濃度達到60％，10000轉(zhuǎn)/min離心10min收集沉淀，將沉淀凍干即得經(jīng)過初步純化的大環(huán)糊精；3)產(chǎn)物的鑒定用高效陰離子色譜HPAEC對大環(huán)糊精樣品進行鑒定，操作如下稱取0.01g大環(huán)糊精樣品，用超純水溶解至1mL制成10mg/mL的樣品溶液，上樣10μL，采用的色譜條件是Carbo PacTM PA-200column 3*250mm；柱溫為30℃；流速為0.5mL/min；檢測器采用電化學檢測器；洗脫條件采用醋酸鈉梯度洗脫法，程序如下0-5min醋酸鈉濃度達到70m mol/L，氫氧化鈉濃度達到96.5m mol/L，5-45min醋酸鈉濃度達到320m mol/L，氫氧化鈉濃度達到72.5m mol/L；在此梯度洗脫程序下，大環(huán)糊精得到有效分離，經(jīng)與標準大環(huán)糊精進行對比，制備得到大環(huán)糊精的聚合度范圍為18-55。
全文摘要
一種大環(huán)糊精的制備方法，屬于食品工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從土豆淀粉中提取得到直鏈淀粉；然后用4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶作用直鏈淀粉生產(chǎn)大環(huán)糊精，并對制備的大環(huán)糊精進行了初步純化及鑒定。本發(fā)明制備的大環(huán)糊精經(jīng)鑒定聚合度范圍為18-55之間，在國內(nèi)首次制備得到了大環(huán)糊精，并且為大環(huán)糊精在工業(yè)中應用提供了技術(shù)依據(jù)。
文檔編號C12P19/18GK101696441SQ20091021317
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者徐學明, 王金鵬, 田耀旗, 謝正軍, 金征宇 申請人:江南大學;