專利名稱：一種動(dòng)物細(xì)胞雙順反子高效表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析、蛋白質(zhì)或多肽類 藥物研究開發(fā)的先決條件。目前用于外源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞主要有大腸桿菌、酵母、昆蟲 細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。大腸桿菌是原核細(xì)胞，缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等可用于進(jìn)行糖基 化等翻譯后修飾的結(jié)構(gòu)和機(jī)制，所表達(dá)的產(chǎn)物是非糖基化的，且常常以包涵體的形式存在。 而酵母及昆蟲等真核細(xì)胞雖能進(jìn)行糖基化等翻譯后修飾，但它們采取的糖基化等翻譯后修 飾方式與人類細(xì)胞的方式不完全一樣，從而影響了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、分泌效率、生物活性、體 內(nèi)穩(wěn)定性以及免疫原性等生物學(xué)特性。用于表達(dá)重組蛋白的表達(dá)體系有微生物、植物、酵 母、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等。與大腸桿菌、酵母及昆蟲細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的外源基因 產(chǎn)物與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式上幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白，并可 大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。但動(dòng)物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高動(dòng)物細(xì)胞外源 蛋白表達(dá)效率，降低生產(chǎn)成本是當(dāng)前工作中的重中之重。 適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體的結(jié)構(gòu)均比較復(fù)雜。目前己發(fā)展出很多哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的表達(dá)載體，并且許多已經(jīng)商業(yè)化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體主要可以分成兩大類，病 毒型載體和非病毒型載體。非病毒型載體基本上是一類質(zhì)粒DNA。這些表達(dá)載體都提供能 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，如SV40早期基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、人巨細(xì)胞病毒瞬 時(shí)早啟動(dòng)子、TK基因啟動(dòng)子等等。載體DNA包含有提供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，以及 其他的相關(guān)元件如poly(A)加尾信號。有的載體還提供內(nèi)含子序列以增強(qiáng)表達(dá)效果，以及 原核和真核細(xì)胞的篩選標(biāo)記基因、原核復(fù)制起始區(qū)域、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒復(fù)制的相關(guān)序列 (如SV40復(fù)制起始區(qū))，在表達(dá)SV40病毒大T基因的細(xì)胞中如COS系列的細(xì)胞，該區(qū)域的 存在可以使得相應(yīng)的質(zhì)粒在細(xì)胞中復(fù)制和擴(kuò)增等。這類表達(dá)載體的代表有Invitrogen公 司的一系列哺乳動(dòng)物表達(dá)載體如pCDNA3。選用什么表達(dá)載體需要從多方面考慮，同一個(gè)表 達(dá)載體，同一個(gè)啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞類型中效果差異較大，這和該細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的 存在狀況有關(guān)，除了借鑒他人的經(jīng)驗(yàn)，還需要許多具體的實(shí)驗(yàn)工作來確定。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)外源蛋白依賴于許多因素，如轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子、 RNA加工(RNA Processing)、基因拷貝的數(shù)目、mRNA的穩(wěn)定性、外源基因在染色體上的整合 位點(diǎn)、重組蛋白對宿主細(xì)胞的潛在毒性和宿主細(xì)胞的基因組偏好性(genetic properties) 等。為重組蛋白選擇一個(gè)合適的表達(dá)系統(tǒng)，由許多因素決定，這些因素包括細(xì)胞生長的特 點(diǎn)、表達(dá)的水平、胞內(nèi)或胞外表達(dá)、重組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾和生物活性、以及蛋白生產(chǎn)過程 中的調(diào)控技術(shù)和經(jīng)濟(jì)問題等。而表達(dá)載體的選擇是建立一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵 要素之一。 —般，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體主要由以下幾個(gè)部分組成
1) —個(gè)組成型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子來啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性；
2)優(yōu)化的mRNA加工和翻譯信號，包括Kozak序列，翻譯終止密碼子，mRNA斷裂 (cleavage)和多聚腺苷化信號，及mRNA剪接信號等；
3)轉(zhuǎn)錄終止子； 4)用于基因擴(kuò)增和建立穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選標(biāo)記； 5)用于在細(xì)菌中質(zhì)粒載體擴(kuò)增的原核來源的復(fù)制起始位點(diǎn)和選擇標(biāo)記；
6)其他有特殊功能的元件如融合域(fusion moieties)、蛋白酶切割位點(diǎn)、基因 或蛋白靶向序列和構(gòu)成雙順反子的IRES元件，另外如SV40復(fù)制起始位點(diǎn)有利于外源基因 在COS細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)等。 CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞是目前最常選用的工程細(xì)胞。二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase, DHFR)缺陷型CH0細(xì)胞株(CH0/DHFR-)的特點(diǎn)是缺失二氫葉 酸還原酶。葉酸是細(xì)胞生存所必需的，必須由培養(yǎng)基供給，而葉酸又必須在二氫葉酸還原酶 作用下還原為四氫葉酸，成為葉酸的活性形式才能被細(xì)胞利用。氨甲喋吟(MTX)的結(jié)構(gòu)與 葉酸相似，是葉酸的拮抗劑，它能抑制二氫葉酸的活性，使四氫葉酸的合成減少，從而抑制 體內(nèi)胸腺嘧啶核苷酸的合成，而干擾細(xì)胞的生長。二氫葉酸還原酶缺陷型不能合成四氫葉 酸，如果引入外源DHFR基因，通過氨甲喋呤(methotraxate， MTX)擴(kuò)增體系，可明顯提高外 源蛋白的表達(dá)量。提高CH0/DHFR-外源蛋白的表達(dá)水平，可以通過優(yōu)化載體的方式來實(shí)現(xiàn)， 因此構(gòu)建一種適用于動(dòng)物細(xì)胞，尤其是CHO細(xì)胞的高效表達(dá)載體在工業(yè)生產(chǎn)中意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種高效表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體及其應(yīng)用，以降低小分子蛋 白的生產(chǎn)成本。 首先，本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，包括CMV增強(qiáng)子、 SV40晚期啟動(dòng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) 、 SV40晚期polyA信號等，所述SV40晚期 polyA信號區(qū)插入了一段重復(fù)序列。 較佳的，所述CMV增強(qiáng)子拼接于SV40晚期啟動(dòng)子的5'端。本發(fā)明實(shí)施例列舉的 SV40晚期啟動(dòng)子的序列為SEQ ID NO :1。 所述CMV增強(qiáng)子可以為人CMV增強(qiáng)子。本發(fā)明實(shí)施例列舉的人CMV增強(qiáng)子序列為 SEQ IDNO :2。 所述插入SV40晚期polyA信號中的重復(fù)序列為SEQ ID NO :4。
優(yōu)選的，所述SV40晚期polyA信號序列為SEQ ID NO :3。 本發(fā)明實(shí)施例所列舉的表達(dá)載體，是由質(zhì)粒pIRESneo3改造獲得，其中，CMV 增強(qiáng)子與SV40晚期啟動(dòng)子的拼接序列替換了原質(zhì)粒中的hCMV主要立即早期啟動(dòng)子 (Humancytomegalovirus major immediate early promoter)序列，改造的SV40晚 期PolyA信號序列替換了原質(zhì)粒中的早期SV40多聚腺苷酸信號(SV40early mRNA polyadenylationsignal)序列。 本發(fā)明的用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體還可進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記，所述內(nèi)部 核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為部分失活的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。 所述部分失活的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，可以是可引導(dǎo)3'端蛋白翻譯的元件如5' 端先導(dǎo)序列等。
4
所述篩選標(biāo)記可選自二氫葉酸還原酶(DHFR)或新霉素抗性基因(neo)。 本發(fā)明還提供了上述動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體在小分子蛋白或多肽的高效
細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用。 所述小分子蛋白或多肽可以是各種分子量為小于60kDa的蛋白或多肽，如各種藥 物蛋白促紅細(xì)胞生成素(EPO)，長效EPO以及各種具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì) 胞生成素等。 本發(fā)明將幾種含有相同外源蛋白的重組質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源蛋白的表達(dá)量的 測定結(jié)果表明，本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體特別適用于CHO細(xì)胞，與現(xiàn)有SV40 晚期啟動(dòng)子的的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體相比，在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量獲得大幅提升，
表達(dá)水平提高了約io倍，其應(yīng)用有利于篩選到高表達(dá)單克隆細(xì)胞株，具有降低生產(chǎn)成本、
便于后續(xù)純化等優(yōu)勢。


圖1顯示表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) 圖2顯示表達(dá)載體構(gòu)建過程 圖3顯示SV40晚期啟動(dòng)子的測序圖譜 圖4顯示CMV增強(qiáng)子/SV40晚期啟動(dòng)子測序圖譜 圖5顯示SV40晚期polyA信號的測序圖譜 圖6顯示本發(fā)明SV40晚期polyA信號的測序圖譜 圖7pCSL-EP0酶切鑒定 其中，1 :Spel/Nhel雙酶切產(chǎn)物(約870bp ;4850bp) 2 :GeneRuler DNA ladder Mix#SM0331 3 :Nhel/BamHI雙酶切產(chǎn)物(約590bp ;5130bp) 4 :XbaI/BST1107I雙酶切產(chǎn)物(約280bp ;5440bp) 5 :pCSL-EPO質(zhì)粒 圖8pSVS-EP0酶切鑒定 其中，1 :Spel/Nhel雙酶切產(chǎn)物(約410bp ;4800bp)
2 :Nhel/BamHI雙酶切產(chǎn)物(約590bp ;4620bp) 3 :Xbal/BST11071雙酶切產(chǎn)物(約230bp ;4980bp) 4 :pSVS-EPO質(zhì)粒 5 :GeneRuler DNA ladder Mix#SM0331 圖9pCSS-EP0酶切鑒定 其中，l :GeneRuler DNA ladder Mix#SM0331
2 :Spel/Nhel雙酶切產(chǎn)物(約870bp ;4800bp) 3 :Nhel/BamHI雙酶切產(chǎn)物(約590bp ;5080bp) 4 :Xbal/BST11071雙酶切產(chǎn)物(約230bp ;5440bp) 5 :pCSS-EPO質(zhì)粒 圖10顯示本發(fā)明質(zhì)粒與相關(guān)質(zhì)粒促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量的比較 其中，橫坐標(biāo)促紅細(xì)胞生成素重組質(zhì)粒
縱坐標(biāo)促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不對其發(fā)明范圍進(jìn)行限制
實(shí)施例1SV40晚期啟動(dòng)子的構(gòu)建
(1)SV40晚期啟動(dòng)子的擴(kuò)增①以SV40基因組(NCBI登錄號NC_001669)中的SV40晚期啟動(dòng)子序列為參考設(shè)計(jì)引物F01/R01， pSVL質(zhì)粒(Amersham)為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如表1。
F01 ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC(SEQ ID NO :5)
R01 GGTGGCTAGCGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTG(SEQ ID NO :6)
表1PCR反應(yīng)條件
階段步驟溫度('c)保溫時(shí)間循環(huán)次數(shù)(次)
第一階段第一步94lmin1
第一步94lOsec
第二階段第二步6030sec30
第三步72lmin
第三階段第一步4②以SV40基因組中的SV40晚期啟動(dòng)子序列為參考設(shè)計(jì)引物FO12/RO1 ， pSVL質(zhì)粒
(Amersham)為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如表1。F012 ATTGACTAGTAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAA(SEQ ID NO :7) 所得PCR產(chǎn)物與經(jīng)過Smal處理的pUC57 (購自Fermentas公司)連接，并進(jìn)行測
序鑒定。 (2) CMV增強(qiáng)子的擴(kuò)增 以質(zhì)粒pIRESneo3 (購自Clontech公司)為模版，人CMV增強(qiáng)子序列為參考，設(shè)計(jì)引物F02/R02，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出CMV增強(qiáng)子序列，反應(yīng)條件如表1。
F02 :ATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG(SEQ ID NO :8) (3) CMV增強(qiáng)子與SV40晚期啟動(dòng)子的拼接 將上述實(shí)施例1 (1)①的SV40晚期啟動(dòng)子和實(shí)施例1 (2)的CMV增強(qiáng)子PCR產(chǎn)物等比例混合，按照表1條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的序列(CMV增強(qiáng)子/SV40晚期啟動(dòng)子)。將PCR產(chǎn)物與經(jīng)過Smal處理的pUC57連接，并進(jìn)行測序鑒定。
實(shí)施例2SV40晚期polyA信號序列合成
(1) SV40晚期polyA信號的擴(kuò)增 以pSVL為模版，pSVL序列中SV40晚期polyA信號序列為參考設(shè)計(jì)引物F03/R03,PCR反應(yīng)條件如表1。
6
R03 :GTCGACGGTATACTACCACATTTGTAGAGG(SEQ ID NO :11) 所得PCR產(chǎn)物與經(jīng)過Smal處理的pUC57連接，并進(jìn)行測序鑒定。 (2)本發(fā)明SV40晚期polyA信號的合成 以SV40基因組中SV40晚期polyA信號序列為參考，人為添加了一段重復(fù)序列，該
段重復(fù)序列為SV40晚期polyA信號區(qū)上的一段重復(fù)序列。設(shè)計(jì)引物如下 1 ACAAATCTAGACAGACATGATAAGATACATTGAT(SEQ ID NO :12) 2 AGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTCT(SEQ ID NO :13) 3 GAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCACTCGACGCGTT(SEQ ID NO :14) 4 TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTCGAGTGCATTC(SEQ ID NO :15) 5 AAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGA(SEQ ID NO :16) 10 ACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTG(SEQ ID NO :21)
11 GGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAA(SEQ ID NO :22) 將上述引物混合，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得本發(fā)明SV40晚期polyA信號全序列。PCR反應(yīng)條件如表1。將該P(yáng)CR產(chǎn)物與經(jīng)過Smal處理的pUC57連接，并進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果表明序列為SEQ ID NO :3。
實(shí)施例3表達(dá)載體的構(gòu)建 將實(shí)施例1 (3)中的產(chǎn)物CMV增強(qiáng)子/SV40晚期啟動(dòng)子與pIRESneo3質(zhì)粒進(jìn)行Spel/Nhel雙酶切連接，獲得質(zhì)粒pCSe。 將實(shí)施例2 (1)的SV40晚期polyA信號與pCSe質(zhì)粒進(jìn)行XbaI/BST1107I雙酶切連接，所得質(zhì)粒命名為pCSS。 將pCSS與實(shí)施例1 (1)②的SV40晚期啟動(dòng)子進(jìn)行Spel/Nhel雙酶切連接，所得質(zhì)粒命名為pSVS。 將實(shí)施例2 (2)的本發(fā)明SV40晚期polyA信號與pCSe進(jìn)行Xbal/BSTl 1071雙酶切連接，所獲得的質(zhì)粒本發(fā)明的表達(dá)載體，命名為pCSL。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞作外源蛋白的瞬時(shí)表達(dá)研究 將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的人促紅細(xì)胞生成素基因(GeneBank登錄號AB463610)經(jīng)Nhel/BamHI雙酶切處理后，連接至Nhel/BamHI雙酶切后的本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒pCSL、 pSVS、pCSS和商業(yè)化質(zhì)粒pSVL (Amersham)中，獲得重組質(zhì)粒pCSL-EPO、 pSVS-EPO、 pCSS-EPO和pSVL-EPO。并采用脂質(zhì)體法(lip2000， invitrogen)將該四種重組質(zhì)粒pCSL-EPO、pSVS-EPO、pCSS-EPO和pSVL-EPO分別轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞，檢測其促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)水平。
按照lip2000操作說明書，將4 ii g pCSL-EPO、pSVS-EPO、pCSS-EPO和pSVL-EPO分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于5ml DMEM/F12(10X胎牛血清)的25cm2方瓶中的C0S7細(xì)胞(約5X 107個(gè)細(xì)胞)中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在5%0)2，371:的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，收集培養(yǎng)液上清，利用ELISA法測定其促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量。pCSS-EPO、pSVS-EPO、pCSL-EPO和pSVL-EPO的促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量分別是88. 6、 18. 3、 176. 3和17. 8ng/ml。結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的重
組質(zhì)粒pCSL-EP0促紅細(xì)胞生成素表達(dá)量最高，約是pSVL-EP0和pSVS-EPO的10倍。序列表〈110〉上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司〈120〉 一種動(dòng)物細(xì)胞雙順反子高效表達(dá)載體〈130〉PCNKM091555〈160>23〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>407〈212>DNA〈213>Simian virus 40〈400>1aagctttttg caaaagccte ggcctccaaa aaagcctcct cactecttctgg朋tegctc603g3ggcag3g gcggcctcgg cctctgcate朋te朋朋朋attegtcagcC3tggggCgg120卿3tgggcg g雄tgggcg g3gttegggg cggg3tgggc gg3gtteggggcgggactet180ggttgctgac teattgagat gcatgctttg catecttctg cctgctggggagcctgggga240ctttccacac ctggttgctg acteattgag atgcatgctt tgcatecttctgcctgctgg300ggagcctggg gactttccac acccteactg acacacattc cacagctggttctttccgcc360tcagaaggte ccteaccaag ttcctctttc agaggttett tcaggcc407〈210>2〈211>406〈212>DNA〈213>Homo sapiens〈400>2cgcgttecat aacttecggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacgaCCCCCgCCC360ttgacgtcaa teatgacgte tgttcccate gteacgccaa tegggactttccattgacgt120c朋tgggtgg agtetttecg gte朋ctgcc cacttggcag tecatc朋gtgtetcatetg180ccaagtecgc cccctettga cgtcaatgac ggteaatggc ccgcctggcattetgcccag240tacatgacct tetgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt300accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg360ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgtttt406〈210>3〈211>275〈212>DNA〈213>artificial sequence〈220〉〈223〉改造的SV40晚期polyA信號序列〈400>3:0136] cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cactcgacgc 60
:0137] gttaagatec attgatgagt ttggacaaac cac朋ctag3 3tgcagtg朋3朋助tgctt 120
:0138] tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attateagct gcaataaaca 180
:0139] agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 240
:0140] tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggta 275
:0141] 〈210〉4
:0142] 〈211 〉43
:0143] 〈212>DNA
:0144] 〈213>artificial sequence
:0145] 〈220〉
:0146] 〈223〉改造的SV40晚期polyA信號序列中的重復(fù)序列
:0147] 〈400〉4
:0148] taagatacat tgatgagttt ggacaaacca c朋ctagaat gca 43
:0149] 〈210>5
:0150] 〈211>47
:0151] 〈212〉DNA
:0152] 〈213〉artificial sequence
:0153] 〈220〉
:0154] 〈223〉引物
:0155] 〈400>5
:0156] acgtcaatgg gagtttgttt taagcttttt gcaaaagcct aggcctc 47
:0157] 〈210〉6
:0158] 〈211 〉41
:0159] 〈212〉DNA
:0160] <213〉artificial sequence
:0161] 〈220>
:0162] 〈223〉引物
:0163] 〈400〉6
:0164] ggtggctagc ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt g 41
:0165] 〈210〉7
:0166] <211〉40
:0167] 〈212>DNA
:0168] 〈213>artificial sequence
:0169] 〈220〉
:0170] 〈223〉引物
:0171] 〈400〉7
:0172] attgactagt aagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 40
:0173] 〈210>8
:0174] 〈211>31:0175] 〈212>DNA
:0176] 〈213>artificial sequence
:0177] 〈220〉
:0178] 〈223>引物
:0179] 〈400>8
:0180] attgactagt tattaatagt aatcaattac g 31
:0181] 〈210>9
:0182] 〈211>51
:0183] 〈212>DNA
:0184] 〈213>artificial sequence
:0185] 〈220〉
:0186] 〈223〉引物
:0187] 〈400>9
:0188] aggcctaggc ttttgcaaaa agcttaaaac aaactcccat tgacgtcaat g 51
:0189] <210〉10
:0190] 〈211>50
:0191] 〈212>DNA
:0192] 〈213>artificial sequence
:0193] 〈220〉
:0194] 〈223〉引物
:0195] 〈400>10
:0196] tatatctega cagacatgat aagatecatt gatgagtttg gacaaaccac 50 〈210>11 〈211>30 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400〉 11 gtcgacggta tactaccaca tttgtagagg 30 〈210>12 〈211>34 〈212>DNA <213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400>12 3c3朋tctag acag;acatga taagatacat tgat 34 〈210>13
〈211>47 〈212>DNA 〈213〉artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400>13 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtct 47 〈210〉14 〈211 〉40 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400〉 14 gagtttggac aaaccacaac tagaatgcac tcgacgcgtt 40 <210>15 〈211>43 〈212〉DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 <223>引物 〈400>15 ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gtcgagtgca ttc 43 〈210>16 <211>46 <212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 <400>16 aagatecatt gatg3gtttg gac朋3ccac朋cteg朋tg cagtga 46 〈210>17 〈211 〉49 〈212>DNA <213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400〉17 cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggt 49
〈210>18 〈211>53 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400>18 aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cat 53 〈210>19 〈211>52 〈212>DNA 〈213>artificial sequence <220> 〈223〉引物 〈400>19 ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc at 52 〈210>20 〈211>54 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400>20 tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttca 54 〈210>21 <211>44 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 <223>引物 〈400>21 acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttg 44 〈210>22 〈211>42 〈212>DNA 〈213>artificial sequence 〈220〉 〈223〉引物 〈400>22
ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttte朋g固gtEiEi肌42〈210〉23〈211>53〈212>DNA〈213>artificial sequence<220>〈223〉引物〈400>23aatcagtata ctaccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct ccc5權(quán)利要求
一種用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，包括CMV增強(qiáng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、SV40晚期polyA信號，所述SV40晚期polyA信號區(qū)插入了一段重復(fù)序列。
2. 如權(quán)利要求1所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述SV40晚期 啟動(dòng)子的序列為SEQ ID NO :1。
3. 如權(quán)利要求1所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述CMV增強(qiáng)子 為人CMV增強(qiáng)子。
4. 如權(quán)利要求3所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述人CMV增強(qiáng) 子序列為SEQ ID NO :2。
5. 如權(quán)利要求1所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述插入SV40 晚期polyA信號中的重復(fù)序列為SEQ ID NO :4。
6. 如權(quán)利要求1所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述SV40晚期 polyA信號序列為SEQ ID NO :3。
7. 如權(quán)利要求1所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述用于動(dòng)物 細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體還進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記，所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為部分失活的 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。
8. 如權(quán)利要求7所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述篩選標(biāo)記 選自二氫葉酸還原酶或新霉素抗性基因。
9. 如權(quán)利要求1-8任一所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體，其特征在于，所述雙 順反子表達(dá)載體是由質(zhì)粒pIRESneo3改造獲得。
10. 如權(quán)利要求l-9任一所述用于動(dòng)物細(xì)胞的雙順反子表達(dá)載體在小分子蛋白或多肽 的高效細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用。
11. 如權(quán)利要求io所述的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子蛋白或多肽選自促紅細(xì)胞生成素、長效EP0以及具有促紅細(xì)胞生成素活性的改構(gòu)促紅細(xì)胞生成素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞雙順反子高效表達(dá)載體。本發(fā)明涉及的表達(dá)載體含有CMV增強(qiáng)子，SV40晚期啟動(dòng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、SV40晚期polyA信號，其中，SV40晚期polyA信號區(qū)插入了一段重復(fù)序列。本發(fā)明的表達(dá)載體與現(xiàn)有SV40晚期啟動(dòng)子的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體相比，在動(dòng)物細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)量得到大幅提升，表達(dá)水平提高了約10倍。
文檔編號C12P21/02GK101705244SQ20091019925
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者厲穎, 周永春, 張玉晶, 李瑤 申請人:上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司