專利名稱：：鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達檢測液相芯片和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達檢測液相芯片和檢測方法。
背景技術(shù)：
：鉑類是目前常用的廣譜抗腫瘤藥，已成為癌癥化療中不可缺少的藥物。目前已發(fā)展出以卡鉑為代表的第二代，和以奧沙利鉑為代表的第三代鉑類藥物。鉑類藥物的抗腫瘤作用是通過作用于DNA，形成Pt-DNA結(jié)合物，導致DNA的鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復制。鉑類藥物的療效雖得到廣泛認可，但患者用藥后藥效的個體差異很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系統(tǒng)毒性，常見為惡心、嘔吐，還可有腎毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神經(jīng)毒性較輕。大量的臨床研究已經(jīng)證實，鉬類藥物的療效/毒副作用與患者體內(nèi)核苷酸切除修復交叉互補組1(ERCC1)、遺傳性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1的表達水平關(guān)系密切。(1)鉑類藥物與核苷酸切除修復交叉互補組1(ERCC1)ERCC1是核酸外切修復家族中重要成員，參與DNA鏈的切割和損傷識別。缺失有功能ERCC1的腫瘤細胞不能修復順鉑導致的DNA損傷而死亡；反之，ERCC1mRNA高表達則導致鉑類藥物的耐藥。研究表明手術(shù)切除的中晚期非小細胞肺癌中ERCC1低表達接受吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療后生存期明顯延長，同時ERCC1表達陰性的肺癌患者接受輔助性化療顯著受益。另外，進展期非小細胞肺癌中ERCC1mRNA低表達的患者中位生存期明顯高于高表達者。研究已證實ERCC1參與非小細胞肺癌鉑類化療藥物耐藥發(fā)生，與肺癌療效和生存期呈負相關(guān)；ERCC1mRNA低表達者對含鉑類化療藥的輔助化療顯示良好的獲益率，因而ERCClmRNA的表達水平可作為鉑類藥物耐藥的關(guān)鍵指標之一。(2)鉑類藥物、抗微管類藥物與遺傳性乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1鉑類化合物是最常使用的腫瘤化療藥物，由于鉑類藥物通過廣泛結(jié)合DNA而抑制細胞分裂實現(xiàn)抗癌目的，因此鉑類藥物的使用不可避免地損傷患者機體內(nèi)正常分裂細胞，造成毒副作用。大量臨床研究已經(jīng)證實鉑類藥物的療效與腫瘤組織中BRCAl基因mRNA表達水平密切相關(guān)，即BRCA1基因表達水平低的患者對鉑類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥?？刮⒐茴惢熕幨亲饔糜诩毎⒐?，通過影響紡錘體形成，從而抑制細胞有絲分裂的一類化療藥。抗微管類藥物的抗癌譜很廣，是使用最為廣泛的抗腫瘤藥物。但在臨床應用中，卻時常出現(xiàn)治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異。大量的臨床研究顯示，抗微管藥物的療效與腫瘤組織中BRCA1基因的mRNA表達水平密切相關(guān)，即BRCA1基因表達水平高的患者對抗微管類藥物敏感，反之表達水平低的患者表現(xiàn)耐藥。在對卵巢癌患者的臨床研究中顯示，BRCA1的mRNA表達水平與鉑類和紫杉醇治療的療效相關(guān)。BRCA1的mRNA低表達和中等表達的患者接受鉑類化療后的生存期比高表達患4者顯著增長，而在BRCAlmRNA高表達的患者中，接受紫杉醇/鉑類化療的比只接受鉑類化療的患者生存期延長。(3)持家基因132-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白(TBP)持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達，但由于這種穩(wěn)定表達是相對的，在一定的病理狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達也會發(fā)生變化。選擇在我們所研究對象中穩(wěn)定表達的基因作持家基因，對保證檢測結(jié)果的準確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量的常用持家基因中進行篩選，確定3個合適的持家基因，分別是132-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白(TBP)?；谝陨匣虻谋磉_水平與鉑類藥物療效的相關(guān)性，專家推薦患者在接受鉑類藥物治療之前，應當進行相關(guān)的基因mRNA表達水平的檢測，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個體差異制定個體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。目前，對基因的mRNA表達水平進行檢測的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實時熒光定量PCR法、RNA原位核酸雜交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細胞內(nèi)RNA分布以了解特定基因的表達情況，且其過程較長、操作繁瑣，不適合用于臨床應用；而逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實時熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過一對引物進行PCR擴增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導致假陽性高；再次，這兩種方法一般只有一個持家基因作對照，其準確性容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實時熒光定量PCR法作為臨床應用均存在著難以克服的技術(shù)缺陷。液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應的載體，在微球的制造過程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成IOO種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的探針分子從而實現(xiàn)對多達100中待檢物質(zhì)的同步并行檢測。因此，我們采用液相芯片技術(shù)可以同時檢測多個基因的mRNA表達水平，實現(xiàn)了檢測的高通量，大大提高了檢測效率。技術(shù)方案本發(fā)明的目的之一是提供與鉑類藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達水平液相檢測芯片，該液相芯片可用于檢測以下5種目標基因的表達水平ERCC1、服CA1、B2M、TFRC、TBP。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—種鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，主要包括有(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端能與支持延伸探針互補配對的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對應的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對應的支持探針的特異性序列PI互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對ERCCl基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對BRCAl基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2條或2條5以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2條或2條以上;(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5'端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5，3'端還修飾有生物素；所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對ERCC1基因的選自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5條或5條以上、和/或針對BRCAl基因的選自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5條或5條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5條或5條以上；所述P5所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。或者，主要包括有(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端能與支持延伸探針互補配對的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對應的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對應的支持探針的特異性序列PI互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對ERCCl基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對BRCAl基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2條或2條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2條或2條以上;(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5'端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5;所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對ERCCl基因的選自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5條或5條以上、和/或針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5條或5條以上;以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；禾口(4)標記探針，所述標記探針具有與擴增延伸探針P5互補配對的序列，且末端具有生物素修飾。優(yōu)選地，還包括有填充序列，包括針對ERCCl基因的SEQ.NO.84;針對BRCAl基因的選自SEQ.NO.85-SEQ.NO.86中的一條或多條；針對B2M基因的選自SEQ.N087-SEQ.NO.94中的一條或多條；和/或針對TFRC基因的選自SEQ.NO.95-SEQ.NO.98中的一條或多條.優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個T;所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法。具體方案如下—種檢測鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法，使用權(quán)利要求1_4任一項所述液相芯片，主要包括以下步驟6(1)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(2)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針帶有生物素標記，擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(3)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(4)通過熒光檢測儀檢測。或者，主要包括以下步驟(1)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(2)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合；(3)再加入標記探針，標記探針帶有生物素標記，5(TC士rC，600rpm震蕩孵育1小時，標記探針與擴增延伸探針的序列P5互補配對結(jié)合，從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(4)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(5)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明所設計的各種探針，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。運用本發(fā)明所述的液相芯片和檢測方法，對鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平進行檢測，無需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測結(jié)果的準確性；另一方面，以多個持家基因作對照(N>3)，檢測結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準確性高；(2)本發(fā)明使用的是探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。(3)本發(fā)明所述的液相芯片和檢測方法適用于新鮮組織，在石蠟包埋固定組織、組織切片均適用。對比起其他的mRNA檢測方法，有著操作簡易、準確性高、特異性高的特點。具體實施例方式本領(lǐng)域的人員所知，所述間隔臂序列為用于將支持探針與微球表面間隔開來，在支持延伸探針與擴增延伸探針內(nèi)部也存在間隔臂序列，通過在探針序列與胺基之間、探針內(nèi)部設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n^3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂(間隔臂長度優(yōu)選2-4)。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個T，在中國，T的合成技術(shù)比較成熟，成本相對較低。實施例1鉑類藥物療效相關(guān)目標基因mRNA表達水平檢測液相芯片試劑盒，主要包括有—、偶聯(lián)有支持探針(SP)的微球支持探針由三部分組成，5'端是與微球結(jié)合的胺基端，3'端是與支持延伸探針結(jié)合的特異性序列Pl，中間是8個寡聚核苷酸T的間隔臂序列，每個目標基因選用一種微球，并選用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。每個目標基因的支持探針如表1所示表1不同的目標基因及其選用微球的編號、支持探針(SP)基因微球號SP序列(5，一3')NH2+poly(dT)+PlSEQIDERCC1205，NH2-TTTTTTTT-ATCATCAATCACTTTA1BRCA1565，NH2-TTTTTTTT-CTTTTACATTCATTAC2B2M225，NH2-TTTTTTTT-CTTTCTTTAATCTCAA3TFRC615，NH2-TTTTTTTT-CATTCAAATCTCAACT4TBP335，NH2-TTTTTTTT-CAATTACTTCAAATCT5所有探針由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。將合成的支持探針用滅菌(1朋20配成100nmol/ml的貯存液。微球包被的過程如下分別取5X106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕獲探針(10Onmol/ml)。配制lOng/ml的EDC(N_(3-Dimethylaminopropyl)_N_ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應結(jié)束后，用0.02X的Tween-20洗滌一次，再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有支持探針的微球重懸于lOOul的Tris-EDTA溶液[1Ommol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA]中，2-8。C避光保存。二、與目標基因mRNA特異結(jié)合的支持延伸探針(SE)、擴增延伸探針(AE)1)支持延伸探針(SE)是連接支持探針(SP)與目標基因mRNA之間的序列，SE由三部分組成，5'端是能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2，長度介于17nt至27nt，3'端是能與支持探針5'端通過堿基互補結(jié)合的特異性序列P3，中間是5個寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個目標基因分別設計5至6條支持延伸探針，以提高檢測的特異性。使用時，針對每種目標基因，選擇2條或2條以上支持延伸探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好(實驗數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用5至6條支持延伸探針，以使特異性達到最好。合成后的每條探針分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標基因的支持延伸探針(SE)見表2。8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2)填充序列(FS)，將目標基因mRNA中沒有與SE、AE特異結(jié)合的區(qū)域封閉，以減少后續(xù)反應中生物素或標記探針的非特異性結(jié)合，從而減少檢測背景。填充序列的Tm值應與SE、AE接近，如表4所示。表4目標基因的填充序列(FS)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>三、標記探針(LP)標記的探針(LP)由兩部分組成，其3'端是能與擴增延伸探針序列P5互補結(jié)合的序列，5'端帶有生物素標記，通過與擴增延伸探針結(jié)合實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2運用鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下溶液名稱配方勻漿緩沖液168mMLiCl,9mMEDTA，5%十二烷基硫酸鋰，50mMHEPES，0.05%ProClin300裂解混合液100mMLiCl，5%十二烷基硫酸鋰，9mMEDTA,50mMHEPES(pH7.5)，0.05%羥乙基淀粉，0.05%ProClin300,0.2%酪蛋白.封閉液100Mg/ml變性鮭精DNA探針工作液SE:0.165fmol/ul/gene;AE:0.66fmol/ul/gene;FS:0,33fmol/ul/gene標記探針工作液LP:0.75fmo歸/gene微球工作液偶聯(lián)有SP的微球，每種目標基因分別有2000個微球洗滌緩沖液0.1xSSC，0.03。/。十二烷基硫酸鋰SA-PE工作液20mmol/LTris-HCl,400mmol/L氯化鋰，1mL/L吐溫20,1mL/L牛血清白蛋白，and5mL/LMicr-O-protect，6mg/LSA-PESA-PE洗滌液lOOmMtris-(羥甲基)胺基甲烷，pH8.0,0.1%BRIJ-35,1mMZnCh,10mMMgCh—、裂解樣本釋放總RNA1.將FFPE腫瘤組織切片從載玻片上刮下，放入1.5ml離心管中，加入300ul勻漿緩沖液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均勻，65t:消化2h。2.消化2h后的樣品，室溫下13，OOOrpm離心5分鐘，吸取中間澄清的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中備用。(如溶液仍不澄清，則重復本步驟12次。)宇性結(jié)合固定在微球上。解，然后在95。C變性5分鐘，馬上置于冰上。3勻試劑每孔理論用量(ul)無酶水18.5裂解混合液33.3封閉液2蛋白酶K0.2探針工作液5微球工作液1i+60士裝至雜交板上，60ul/孔。然后將上述處理好的樣品以40ul/孔分別加入雜交板中；空白對照加入勻漿緩沖液40ul/孔。密封雜交板，54°C士rC，600rpm震蕩孵育過夜(16-22h)。4.用洗滌緩沖液潤濕濾板1分鐘，除去洗滌緩沖液。5.將雜交板取出，500Xg離心1分鐘。將反應液全部轉(zhuǎn)移至濾板中。6.除去溶液，用200ul洗滌緩沖液洗滌3次。二、目標mRNA通過與探針特J1.取出探針工作液于室溫融f2.按下表配制工作液，混合楚加入順序234合i3.將上述配制好的工作液j14三、通過多步雜交反應將目標RNA信號放大1.加入標記探針工作液lOOul/孔。50°C士rC，600rpm震蕩孵育1小時。2.除去溶液，用200ul洗滌液洗滌2次。四、與SA-PE結(jié)合，并在液相芯片閱讀儀上檢測1.加入SA-PE工作液lOOul/孔，600rpm震蕩室溫孵育30min。2.除去溶液，用200ulSA-PE洗滌液洗滌2次，用吸水紙吸干濾板底部。3.加入SA-PE洗滌液130u1/孔。室溫，600rpm震蕩孵育2至5分鐘。4.在液相芯片儀上讀取數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)分析及cutoff值的界定在5個目標基因中，目標基因2個，分別是ERCC1、BRCA1;持家基因3個，分別是B2M、TFRC、TBP;將讀取的熒光值按照以下方法進行均一化處理步驟1:獲得原始數(shù)據(jù)(MFI值)步驟2:樣品的MFI減去空白孔N的MFI=netMFI步驟3:每個樣品的三個持家基因的netMFI值分別取幾何平均值，得到相應的G1、G2、G3......Gn步驟4:每個樣品目標基因mRNA的netMFI除以對應的Gn得到相應的Nn。Nn即為已排除上樣量差異，可在樣品間進行相對表達量比較的數(shù)值。本實施例中對10例樣品進行檢測，檢測結(jié)果如下所示表610例樣品原始數(shù)據(jù)(MFI值)與ERCC1、BRCA1的相對表達量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3:不同間隔臂的液相芯片對鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的檢測—、液相芯片制備的設計(間隔臂的選擇)以ERCC1檢測液相芯片的支持探針為例，分別選用不同的間隔臂，具體設計如表7所示。探針SP、SE與AE的合成、SP序列包被微球、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表7間隔臂及其長度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對樣品11-15進行檢測，檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測熒光值)表8樣品檢測結(jié)果(檢測熒光值〈MFI值>)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>將4組設計的檢測熒光值進行統(tǒng)計學分析，證明4組設計的檢測效果沒有差異。因此，這4種間隔臂的設計是等效的。其它針對支持延伸探針、擴增延伸探針內(nèi)部不同的間隔序列的液相芯片，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例4:不同信號檢測組分液相芯片對鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的檢測—、液相芯片制備的設計(信號檢測組分)信號檢測組分有兩種選擇，1)擴增延伸探針3'端序列P5的3'端帶有生物素標記；2)擴增延伸探針3'端序列P5與標記探針(LP)通過堿基互補配對結(jié)合，同時標記探針的5'端帶有生物素標記。這兩種信號檢測組分均能實現(xiàn)信號放大，檢測到正常信號。其中，使用標記探針的生物素活性更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以所述液相芯片的檢測ERCC1基因的兩種信號檢測組分為例，具體設計如表9所示。即所述液相芯片的組成為實驗組1:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列同實施例l，擴增延伸探針具有生物素標記；沒有標記探針；實驗組2:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列、標記探針同實施例1，擴增延伸探針不具有生物素標記。表9信號檢測組分<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設計制備的液相芯片，檢測方法實驗組2同實施例2所述檢測過程和方法對樣品16-20進行檢測，實驗組1所述檢測方法，省略(三、通過雜交反應將目標RNA信號放大)該步驟，其余同實施例2。表10樣品檢測結(jié)果(檢測熒光值〈MFI值>)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將兩組設計的檢測熒光值進行統(tǒng)計學分析，證明兩組設計的檢測結(jié)果沒有差異，因此，這兩種信號檢測組分對信號的檢測是等效的。其中，使用標記探針的信號檢測組分，由于其生物素的活性更為穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含于本發(fā)明的專利范圍中。0129]序列表0130]〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司0131]〈120>鉑類藥物療效預測的基因mRNA表達檢測液相芯片和檢測方法0132]〈160〉990133]〈170〉Patentlnversion3.10134]〈210〉10135]<211〉160136]〈212〉DNA0137]〈213〉人工序列0138]〈400〉10139]atcatcaatcacttta160140]〈210〉20141]〈211〉160142]〈212〉DNA0143]〈213〉人工序列0144]〈400〉20145]cttttacattcattac16:0146]〈210〉3:0147]〈211〉16:0148]〈212〉DNA:0149]〈213〉人工序列:0150]<400〉3:0151]ctttctttaatctcaa16:0152]〈210〉4:0153]<211〉16:0154]〈212>DNA:0155]〈213〉人工序列:0156]〈400〉4:0157]cattcaaatctcaact16:0158]〈210〉5:0159]〈211〉16:0160]〈212>DNA:0161]〈213〉人工序列:0162]<400〉5:0163]caattacttcaaatct16〈210〉6〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ggctgaggaacagggcaca〈210〉7〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7cacatccacctgg3c朋gcagg〈210〉8〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉8ggcgaggatcaatgtgcagtc〈210>9<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9gaggtccgctggtttctgc<210>10〈211>23〈212〉DNA〈213>人工序列<400>10caggagggtctgactgtccgttt〈210>11〈211〉21〈212>DNA<213>人工序列<400>11gagtg卿ggagctcccaggg〈210〉12〈211>25<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉12c肌gc3g朋3atcttt肪gggaccc〈210>1319222119232125CN101698886A說〈211>26〈212>DNA〈213>人工序列〈400>13gcctgaatag3朋g朋t3gggetgat〈210>14<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14tgcctttgtgaacacagggttttag〈210>15〈211>25〈212>DNA〈213>人工序列〈400>15actgcccaaggactattctgacttt〈210>16〈211>23〈212>DNA〈213>人工序列〈400>16agtgctgggattacaggcgtgag〈210>17〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>17朋ggCC3Cgg3gCg3g3C3t〈210>18〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列<400>18ccattctctgctggat.gacgtg〈400>19gctga膽gac朋gtctga;at〈210〉20〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>20ttaactatcttgggctgtga〈210>21〈211>25<212>DNA〈213〉人工序列〈400>21ggagac3gcactca朋gteg〈210>22〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>223c朋tagccc朋gtegcc朋〈210>23〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>23tcggttcctgccagtctctc〈210>24<211>24〈212>腿〈213〉人工序列〈400>24tctccgacaactttctcttc〈210>25<211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉25ccagcctcacg3gggacate〈210>26gctc24c肌ag25肌tte25tcat24ac22鄉(xiāng)t24t2121〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>26acgccagactttgctgagtt〈210>27<211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>27cgaagtgcaatggtctttag〈210>28〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>28cgtggttcgtggctctctta〈210>29〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>29tattttcttgctgccagtct〈210>30〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉30catcacagctccccaccata〈210>31〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列<400>31caattctgggtttgatcatt〈210>32〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列taa23gtca24tec23gg22ttct24ctgtag26〈400>32gccc;agc3C3tegtcggg朋〈210>33〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400>33gggtgc鄉(xiāng)ttgtggtegcg〈210>34〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>34cagccgcccatggatgtag〈210>35〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>35aaggcgaagttcttccccag〈210>36〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>36cacatcttagccagctcctt〈210>37〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>37gccttgtaggtctccaggta〈210>38<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>38gacgaagtcctgctctagct〈210〉39t212019g21gagg24ccg23tctcc2523〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>39gacttcacggtggtcagacattcag〈210〉40〈211>25〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉40tgagctgttccagagatccaaatgt25〈210>41〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉41gccagatcttctcttgatgcggc23<210>42〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>42tttagtagccaggacagtagaaggac26〈210>43〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>43cagaagtccttttcaggctgatgta25〈210〉44〈211〉22〈212>DNA<213>人工序列〈400>44atggcagatttccaagggagac22〈210〉45〈211>23<212>DNA〈213>人工序列22/30頁〈400>45caattggtggcgtttaaatg<210〉46〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>46cttccagccctaagccaaca〈210〉47<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉47aaccagctattctcttgagg<210>48〈211>24<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉48ttccattgaagggtctgact〈210>49〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>49tcacataatcgatcccaagc〈210〉50〈211〉23<212>DNA〈213〉人工序列<400>50cccaatgttccactccaaca〈210〉51〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈■〉51accatgcccaggtttcaagt〈210>52gtt2321cca23ctct24actc24ttt23ttc2325〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>52tccagtgatctgcccaccttg〈210〉53〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>53gtttcaccatgttggccaggc21〈210>54〈211〉17〈212>DNA〈213>人工序列〈400>54ttcaggaatgcccgcca17〈210>55〈211>23<212>DNA〈213>人工序列〈400〉55ccaggcc3g3朋g3g3gagt3gc23〈210>56〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>56cctgaatctttggagtacgctgg23〈210>57〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>57ggatg肪acccagacacategcaa24〈210>58〈211>24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>583gtgggggtgElElttCElgtgt〈210〉59〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400>59tcacacggcaggcatactcatct〈210>60〈211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>60gctgcttacatgtctcgatccc〈210>61〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>61tgcggcatcttcaaacctcc〈210>62〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>62gcaacctgctcagatacatc〈210>63〈211>23〈212>DNA<213>人工序列〈400>63cctctaagttgccagccctceta〈210>64〈211>25<211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉65c朋tcaagaa3朋gacg3tcacagc〈210〉66〈211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉66ctcagtttttggttctacccctt23〈210〉67<211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉67ctcctggctcctccctcactg21〈210〉68<211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉68cgacgtgctgcagggaagt19〈210〉69〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉69gctggtgaagtctgtgctgtcc22〈210〉70<211〉22〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉70ttttcattcagcagcttgatgg22〈210〉71<211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列cgagttttgagcgctgtctttg〈210>72〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉72caggattctccaccaggtaa〈210>73〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉73gttgcagccttactatacgcC3C〈210〉74〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉74gcagctgcggtacaatccc〈210〉75<211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉75tacaaccaagattcactgtggatac〈210〉76〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉76gattatattcggcgtttcgggc〈210〉77<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉77atgatteccgC3gca朋ccgc〈210〉78明書26/30頁22242319252221〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>78gcacaccattttcccagaac<210>79〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>79ctgttcttcactcttggctc〈210>80〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>80acccaacttctgtacaactc〈210>81〈211>25〈212>DNA<213>人工序列〈400>81tcttgaagtccaagaactta〈210>82〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>82gggtgagcacaaggccttct〈210>83〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>83ca_ggaaataactctggctca〈210>84〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列tg22ctg23tagc24gctgg25■22tBBCtB26〈400>84cagcttcctcggggctc〈210>85〈211>26<212>DNA〈213〉人工序列〈400>85tcttctcaggtgaaaaatta〈210>86〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>86tcatttctaatacctgcctc〈210>87〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>87cggcccgaatgctgtca〈210>88〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>88cagt朋gtcaacttcaatgteg〈210〉89〈211>23〈212>DNA〈213>人工序列〈400>89ctttttcaattctctctccattc〈210>90〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>90agag;at;ag朋3g3ccagtcc〈210>9128八30頁17262617222320ag朋tttggaattcatcc朋tec〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>91〈210>92<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>92catatcaatattaaaaagcaage23〈210>93<211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>93ctacattttgtgcataaagtgta23〈210>94〈211>23〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>94gaagatcatgtccatgttaacat23〈210>95〈211>23〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>95cgcaagattttcatctttttgag23<210>96〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>96cacgaaattgattttcaacatac23〈210>97〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>97ctgaatcttaacaaaatgttg￡l〈210>98〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列<400>98ctaccgttcttatcaactatgat〈210>99〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>99tagacacgggaggcatagg權(quán)利要求一種鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對應的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對應的支持探針的特異性序列P1互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對ERCC1基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2條或2條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2條或2條以上；(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5’端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對ERCC1基因的選自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5條或5條以上、和/或針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5條或5條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括針對ERCCl基因的SEQ.NO.84、針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.85-SEQ.NO.86中的一條或多條、針對B2M基因的選自SEQ.N087-SEQ.NO.94中的一條或多條、和/或針對TFRC基因的選自SEQ.NO.95-SEQ.NO.98中的一條或多條。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個T。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。5.—種鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端能與支持延伸探針互補配對的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對應的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對應的支持探針的特異性序列Pl互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對ERCCl基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.21中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.22-SEQ.NO.26中的2條或2條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.27-SEQ.NO.31中的2條或2條以上；(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5'端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5;所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對ERCC1基因的選自SEQ.NO.32-SEQ.NO.41中的5條或5條以上、和/或針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.42-SEQ.NO.53中的5條或5條以上;以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.63中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.73中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.74-SEQ.NO.83中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；禾口(4)標記探針，所述標記探針具有與擴增延伸探針P5互補配對的序列，且末端具有生物素修飾。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，還包括有填充序列包括，針對ERCC1基因的SEQ.NO.84，針對BRCA1基因的選自SEQ.NO.85-SEQ.NO.86中的一條或多條、針對B2M基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.94中的一條或多條、和/或針對TFRC基因的選自SEQ.NO.95-SEQ.NO.98中的一條或多條。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個T。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。9.一種檢測鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-4任一項所述液相芯片，主要包括以下步驟(1)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(2)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針帶有生物素標記，擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(3)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(4)通過熒光檢測儀檢測。10.—種檢測鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求5-8任一項所述液相芯片，主要包括以下步驟(1)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(2)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54°C±1°C，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的PI結(jié)合互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合；(3)再加入標記探針，標記探針帶有生物素標記，5(TC士rC，600rpm震蕩孵育1小時，標記探針與擴增延伸探針的序列P5互補配對結(jié)合，從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(4)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應；(5)通過熒光檢測儀檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，所述檢測液相芯片，主要包括有與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對應的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端的能與對應的支持探針的特異性序列互補配對的序列；連接目標基因mRNA與信號檢測組分間的擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5’端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標記探針互補配對的序列。本發(fā)明還公開了運用該液相芯片對鉑類藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測的方法。本發(fā)明檢測過程無需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測結(jié)果的準確性；另一方面，由于液相芯片技術(shù)使多指標并行檢測成為了現(xiàn)實，在一次檢測中可設置多個內(nèi)參基因，使檢測結(jié)果更為可靠。文檔編號C12Q1/68GK101698886SQ200910193800公開日2010年4月28日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者吳詩揚,楊惠夷,羅彩英,許嘉森,郭元杰申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司